专利名称：一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种含有毛囊的组织工程皮
肤的制备方法。
背景技术：
组织工程是生命科学领域的研究热点，相关的研究涉及到各个方面。其内容是将 体外培养的功能细胞种植于相应的支架材料，经培养后形成具有一定功能的组织或器官。 随着组织工程技术的迅速发展，组织工程皮肤已开始在临床上广泛使用。目前的组织工程 皮肤主要是将皮肤真皮细胞和表皮细胞种植于皮肤支架材料，由此构建的组织工程皮肤具 有与正常皮肤相似的真皮和表皮二层结构，但没有毛囊、皮脂腺等皮肤的附属器官，在组织 结构上与正常皮肤组织仍存在有差异。 皮肤是人体最大的器官，具有保护机体、调节体温、排泄废物等功能。但由于炎症、 溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天畸形等原因造成皮肤和粘膜的缺损或异常，使皮肤功 能受损或丧失，从而导致内脏器官失去保护，甚至影响生命。采用自体皮瓣和自体皮肤移植 会造成供皮区的新创伤，常由于供皮区来源有限无法满足大面积移植的需要。组织工程皮 肤的应用缓解了这种危机，但不含附属器官的组织工程皮肤，在功能上不能满足患者需求。
毛囊是皮肤重要的附属器官，在皮肤的生理过程中有重要的作用。头部毛囊的缺 失和异常会导致斑秃或全秃，影响美观的同时也影响了患者的生活质量；而身体部位的毛 囊异常则严重影响了身体的代谢和热量交换，致使患者只能在恒温的环境中生活。因此，毛 囊的再生成为解决上述问题的关键。 在发育生物学研究中，毛囊是上皮与间充质相互作用的典型器官，在胚胎发育早 期，表皮细胞向下突起形成毛钉，毛钉向下延伸、膨大形成皮脂腺的胚基，膨大处为立毛肌 的胚基，进一步形成毛锥，皮脂腺、立毛肌逐渐成形，最后形成毛乳头、内毛根鞘，毛囊内有 毛干形成。成熟的毛囊分为毛干、上皮根鞘、真皮鞘及毛乳头四部分。上皮根鞘紧贴毛干，由 多层角化上皮细胞组成，由内向外可分为内根鞘和外根鞘，内根鞘在皮脂腺开口水平与内 陷的表皮相连，类似于表皮的透明层和角化层，外根鞘的细胞类似于表皮基底层和棘层的 细胞；真皮鞘及其周围的致密结缔组织是由真皮转化而来，相当于皮肤的真皮层；毛乳头 细胞也是真皮源性的细胞，对于毛囊的发育生物学具有重要的作用，在体内外都可以诱导 毛囊生成。有证据表明，毛囊在减少皮肤瘢痕形成、提高皮肤创伤愈合速度和伤口愈合质量 上有重要的作用；并在毛囊隆突部位的毛囊外根鞘细胞中，存在有支持毛囊上皮细胞更新 的毛囊干细胞，不仅在毛囊周期性生长中起重要作用，同时也是表皮自我更新的细胞来源； 另外，真皮鞘细胞和毛乳头细胞在一定条件下可以互相转化，起到维持毛囊生长的作用，并 显示出一些干细胞的特性，在皮肤创伤后可以转化为皮肤成纤维细胞参与或直接参与皮肤 真皮组织的重建，促进皮肤愈合。 微胶囊技术是将分散的各种物质(包括固体、液体、气体及生物物质)包封在一层 由高分子材料组成的膜中，形成直径为50 1000 ii m的球状微胶囊的技术。将蛋白酶和激素等生物活性物质包封在选择性透过膜中形成的球状微胶囊，称为生物微胶囊。研究报道， 将微胶囊技术与组织细胞移植相结合，把细胞包封在膜内，其特点是选择性透过膜可避免 免疫系统对囊内细胞的攻击，而小分子的营养物质和囊内生物活性物质及代谢产物可自由 出入。 目前，含毛囊组织工程皮肤的研究已成为热点。模拟胚胎早期毛囊形成的条件，将 上皮类细胞与间充质类细胞混合，经体内培养可实现毛囊的再生；多是采用将具有诱导毛 囊再生作用的毛乳头细胞与毛囊外根鞘细胞或毛囊干细胞混合后注入皮肤支架中培养，以 期形成含毛囊组织工程皮肤；其中毛囊的形成，无论从数量还是所形成的毛囊结构，都不理 想。早期毛囊是上皮细胞凹陷并聚集包绕成团的间充质细胞后经发育逐渐形成，而混合注 入的上皮类细胞与间充质细胞接触无序，使得细胞间需相互识别后自我组织重排，由此形 成的毛囊结构及大小不均。皮肤中的毛囊应是分布均匀且数量巨大，局部形成或仅有少量 形成的毛囊是无法起到相应的生理作用。 针对已有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种含毛囊组织工程皮肤的制
备方法，使所制备的组织工程皮肤含有大量的毛囊结构，可实现皮肤移植后的毛囊再生。 本发明所提出的含毛囊组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，是将组织工程毛
囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养
后即形成含毛囊的组织工程皮肤；所述的组织工程毛囊是将间充质来源的毛乳头细胞或可
向毛乳头细胞分化的干细胞包裹于高分子材料中形成粒径为200 1000iim的微囊，再采
用旋转培养方法将上皮来源的毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上皮类细胞包裹于
微囊外围形成粒径为250 1100 ii m的组织工程毛囊；所述的支架材料与所述的高分子材
料一样，为机体可接受的生物可降解材料，可以选择细胞外基质、胶原、透明质酸、硫酸软骨
素、明胶、纤维蛋白胶、壳聚糖、海藻酸盐、蛋白多糖、聚赖氨酸、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一
种或是几种的组合。 所述的各类细胞为自体或是异体来源细胞；其中，微囊内的毛乳头细胞或是可向 毛乳头细胞分化的干细胞，可以选择胚胎干细胞、IPS细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细 胞、或毛囊真皮鞘干细胞的任一种；微囊外层的毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上 皮类细胞，可以选择表皮干细胞、毛囊干细胞、或毛囊隆突部干细胞的任一种。
本发明制备方法的具体步骤包括
步骤一、配制培养液 培养液A :在含有V/V为15%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有表皮生 长因子EGF 2 10 ii g、成纤维细胞生长因子bFGF 5 50ng、牛垂体提取物BPE 3 15g ;
培养液B :在无血清商用Williams E培养液500ml中，加有EGF 2 10iig、bFGF 5 50ng、BPE 3 15g、胰岛素样生长因子IGF-15 50ng ; 培养液C :在含有V/V为10%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有胰岛素 2 50ng、氢化可的松10 500 ii g、腺嘌呤10 17mg、Vc 5 30mg、EGF 2 10 ii g、bFGF 5 50ng、 BPE 3 15g j 培养液D :在培养液C中含有0. 1 lmM浓度的氯化钙；
发明内容
培养液E :在培养液C中含有0. 2 2mM浓度的氯化钙；
培养液F :在培养液C中含有0. 3 3mM浓度的氯化钙；
步骤二、获取细胞 毛乳头细胞的获取与培养可参照文献程波等改良毛乳头细胞培养法《中华皮肤 科杂志》2001 34(5)387 388或是其他已有技术，获得生长状态良好且具有凝集性生长 特征的毛乳头细胞；不同来源的干细胞经毛乳头细胞培养上清液的诱导培养，具有毛乳头 细胞特征后，可作为组织工程毛囊的微囊内细胞。毛囊外根鞘细胞的获取与培养可参照文 献唐建兵等人毛囊外根鞘细胞的培养《中华烧伤杂志》2003 19(1)47 48或是其他 已有技术，获得生长状态良好的毛囊外根鞘细胞；其他上皮来源的干细胞可参考已有技术 获取，无需诱导即作为组织工程毛囊的外层细胞。成纤维细胞和表皮细胞的获取与培养可 参照《组织工程学原理与技术》金岩主编第四军医大学出版社239 240或是其他已 有技术获得。 步骤三、制备组织工程毛囊 含细胞的微囊的制备可参照文献刘瑞等ACA、 APA微囊的强度、通透性及生物相 容性研究《第三军医大学学报》2009 31 (17) 1653 1656或是其他已有技术，制备高分子 材料微囊，微囊中含有毛乳头细胞或可向毛乳头细胞方向分化的干细胞；将含有细胞的微 囊与获取的毛囊外根鞘细胞或其他上皮来源的干细胞混合，用培养液A采用旋转培养1 3 天，待细胞贴附于微囊，以300rpm离心弃去上清，换培养液B培养2 4天，获得组织工程 毛囊；步骤四、含毛囊组织工程皮肤的制备 4t:条件下，用0. 5M的醋酸溶液将支架材料配制成6 20mg/ml的溶液，冰浴下紫 外线照射，再分别加入10%体积比的胎牛血清和终浓度为80 150mg/ml的DMEM商用培 养基，调pH7. 2 7. 4，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养皿中固化形成支撑 膜；把体外培养的成纤维细胞以105 106个/ml的密度混合于凝胶，将其滴加至已固化的 支撑膜表面，37t:培养固化后形成真皮层，加入培养液C培养2 4天，每天换液；真皮层培 养完成后吸弃培养液，用针头在表面均匀打孔，孔间距为2 5mm ;将培养的组织工程毛囊 悬液按10 100个/cm2的密度滴加在真皮层表面，使悬液均匀渗入孔中；然后在真皮层表 面按105 106个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养液D培养1天后，移至支架上进行液
下培养2 4天；更换培养液E进行气_液面培养1 2天；更换培养液F培养1 2天；
培养期间每天换液。 本发明采用微囊技术将毛乳头细胞或可向毛乳头细胞分化的干细胞用高分子材
料包裹，再利用旋转培养方法将毛囊外根鞘细胞或可向毛囊外根鞘细胞分化的干细胞接种
于微囊外围，使毛乳头细胞处于毛囊内部，周围被真皮鞘细胞包裹，有如天然微囊，给以毛
囊更完善的发育条件，经培养后形成数量巨大的组织工程毛囊；将其均匀接种于组织工程
皮肤的真皮层中，覆以表皮细胞经培养成熟即形成含毛囊组织工程皮肤。 本发明克服了以往混合注射所造成的皮肤中毛囊数量小、不均匀、毛囊量不可控
的缺点，所制备的组织工程皮肤含有表皮、真皮以及毛囊样组织结构，其中毛囊数量接近天
然数量并均匀分布于人工毛孔中，毛囊在体外培养中和经移植后继续发育，形成多层的同
心圆结构，内层为微囊膜所包裹的毛乳头细胞，外层为上皮类细胞；经体外培养或体内移植
的皮肤最终形成含毛囊附属结构的功能性皮肤，可实现皮肤移植后的毛囊再生。
具体实施例方式
以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式
。
步骤一、配制培养液 培养液A :在含有V/V为15%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有表皮生 长因子EGF 6 ii g、成纤维细胞生长因子bFGF 10ng、牛垂体提取物BPE 25 y g/ml ;
培养液B :在无血清商用Williams E培养液500ml中，加有EGF 6iig、bFGF 10ng、 BPE 25ii g/ml、胰岛素样生长因子IGF-110ng ; 培养液C :在含有V/V为10%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有胰岛素 10ng、氢化可的松lOOii g、腺嘌呤15mg、Vc 10mg、EGF 6ii g、bFGF 10ng、BPE 25 ii g/ml ;
培养液D :在培养液C中含有0. 8mM浓度的氯化钙；
培养液E :在培养液C中含有1. 9mM浓度的氯化钙；
培养液F :在培养液C中含有2. 6mM浓度的氯化钙；
步骤二、获取细胞 1)、毛乳头细胞的获取与培养剪取人头部皮肤，置入含双抗的PBS液中冲洗3遍， 显微镜下分离毛囊；将分离的毛囊置于离心管中加入2ml胶原酶溶液(625U/ml)，于37t:孵 箱中消化1小时，毛乳头从毛母质中松散游离，轻轻吹打使之游离出来；用检胚针转移毛囊 真皮乳头组织至培养瓶中，加入含4%血清的DMEM培养液(加有100U/ml双抗)，在5% C02 37t:孵箱中培养，获得生长状态良好的毛乳头细胞，作为组织工程毛囊的微囊内细胞；
2)、毛囊外根鞘细胞的获取与培养将毛囊置于离心管中，加入dispase酶4。C消 化过夜，体式显微镜下将毛干连同根鞘上皮细胞从毛囊中挤出放入24孔板中，将盖玻片盖 压于毛干组织上，加入无血清K-SFM(GBICO)培养液培养，获得生长状态良好的毛囊外根鞘 细胞； 成纤维细胞和表皮细胞的获取与培养可参照《组织工程学原理与技术》金岩主编 第四军医大学出版社239 240或是其他已有技术获得。
步骤三、制备组织工程毛囊 将毛乳头细胞用0. 25%胰蛋白酶溶液消化成单细胞，混悬于20g/L浓度的海藻酸 钠溶液中，细胞浓度为5X1()8个/L，经高压电场微囊发生器滴入11g/L的氯化钙溶液中， 形成微胶球，生理盐水清洗3次；在0. 3%壳聚糖溶液中作用10min，生理盐水清洗3次；于 2g/L海藻酸钠溶液中作用4min，生理盐水清洗3次；再于0. 05mol/L枸橼酸钠溶液中作用 6min，以生理盐水清洗3次；获得海藻酸钠_壳聚糖_海藻酸钠微囊，微囊中含有毛乳头细 胞。将含细胞微囊与获取的毛囊外根鞘细胞混合，加入培养液A放入无重力旋转发生器培 养2天，待外根鞘细胞贴附于微囊，以300rpm离心弃去上清，更换培养液B培养3天，获得 组织工程毛囊。 步骤四、含毛囊组织工程皮肤的制备 在4t:条件下，用0. 5M的醋酸溶液将细胞外基质、胶原和透明质酸配制成8mg/ml 的溶液，冰浴下紫外线照射，再分别加入10%体积比的胎牛血清和终浓度为100mg/ml的 匿EM商用培养基，调pH7. 3，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养皿中固化形 成支撑膜；把体外培养的成纤维细胞以1Qs个/ml的浓度混合于凝胶中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，37t:培养固化后形成真皮层，加入培养液C培养3天，每天换液；真皮层培养 完成后吸弃培养液，用0. 7mm注射针头在表面均匀打孔，孔间距为2mm ;将培养的组织工程 毛囊悬液按25个/cm2的密度滴加在真皮层表面，使悬液均匀渗入孔中；然后在真皮层表面 按105个/ml的密度接种表皮细胞，加入培养液D培养1天后，移至支架上进行液下培养2 天；更换培养液E进行气-液面培养2天；更换培养液F培养2天；培养期间每天换液，含 毛囊组织工程皮肤制备完成。
权利要求
一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，是将组织工程毛囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养后即形成含毛囊的组织工程皮肤；所述的组织工程毛囊是将间充质来源的毛乳头细胞或可向毛乳头细胞分化的干细胞包裹于高分子材料中形成粒径为200～1000μm的微囊，再采用旋转培养方法将毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上皮类细胞包裹于微囊外围，形成粒径为250～1100μm的组织工程毛囊；所述的支架材料与所述的高分子材料一样，为机体可接受的生物可降解材料。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括 步骤一、配制培养液培养液A :在含有V/V为15%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有表皮生长因 子EGF 2 10 ii g、成纤维细胞生长因子bFGF 5 50ng、牛垂体提取物BPE 3 15g ;培养液B :在无血清商用Williams E培养液500ml中，加有EGF 2 10 ii g、bFGF 5 50ng、BPE 3 15g、胰岛素样生长因子IGF-15 50ng ;培养液C :在含有V/V为10%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有胰岛素2 50ng、氢化可的松10 500 ii g、腺嘌呤10 17mg、Vc 5 30mg、EGF 2 10 ii g、bFGF 5 50ng、BPE 3 15g ;培养液D :在培养液C中含有0. 1 lmM浓度的氯化钙；培养液E :在培养液C中含有0. 2 2mM浓度的氯化钙；培养液F :在培养液C中含有0. 3 3mM浓度的氯化钙；步骤二、获取细胞获取生长状态良好的毛乳头细胞，对不同来源的干细胞需经毛乳头细胞培养上清液的 诱导培养；获取生长状态良好的毛囊外根鞘细胞，对其他上皮来源的干细胞无需诱导； 步骤三、制备组织工程毛囊将含有细胞的微囊与获取的毛囊外根鞘细胞或其他上皮来源的干细胞混合，用培养液 A采用旋转培养1 3天，待细胞贴附于微囊，以300rpm离心弃去上清，换培养液B培养2 4天，获得组织工程毛囊；步骤四、含毛囊组织工程皮肤的制备fC条件下，用0. 5M的醋酸溶液将支架材料配制成6 20mg/ml的溶液，冰浴下紫外线 照射，再分别加入10%体积比的胎牛血清和终浓度为80 150mg/ml的DMEM商用培养基， 调pH7. 2 7. 4，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养皿中固化形成支撑膜；把 体外培养的成纤维细胞以105 1(f个/ml的密度混合于凝胶，将其滴加至已固化的支撑膜 表面，37t:培养固化后形成真皮层，加入培养液C培养2 4天，每天换液；真皮层培养完 成后吸弃培养液，用针头在表面均匀打孔，孔间距为2 5mm ;将培养的组织工程毛囊悬液 按10 100个/cm2的密度滴加在真皮层表面，使悬液均匀渗入孔中；然后在真皮层表面按 105 106个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养液D培养1天后，移至支架上进行液下培养2 4天；更换培养液E进行气_液面培养1 2天；更换培养液F培养1 2天；培养期间每天换液。
全文摘要
一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法，本发明是将组织工程毛囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养后即形成含毛囊的组织工程皮肤；本发明克服了以往混合注射所造成的皮肤中毛囊数量小、不均匀、毛囊量不可控的缺点，所制备的组织工程皮肤含有表皮、真皮以及毛囊样组织结构，其中毛囊数量接近天然数量并均匀分布于人工毛孔中，毛囊在体外培养中和经移植后继续发育，形成多层的同心圆结构，内层为微囊膜所包裹的毛乳头细胞，外层为上皮类细胞；经体外培养或体内移植的皮肤最终形成含毛囊附属结构的功能性皮肤，可实现皮肤移植后的毛囊再生。
文档编号C12N5/071GK101775366SQ20101010720
公开日2010年7月14日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者凡孝菊, 张勇杰, 王爱军, 金岩 申请人:中国人民解放军第四军医大学;陕西瑞盛生物科技有限公司