专利名称：：乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(s)-3-羟基丁酸乙酯的方法
技术领域：
：本发明涉及一种乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的方法，尤其是一种以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266为生物催化剂、转化乙酰乙酸乙酯制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的方法。
背景技术：
：3-羟基丁酸乙酯(ethyl-3-hydroxybutyrate，EHB)是一种重要的药物中间体，其手性单一对映异构体(S)-EHB是薰衣草醇、食菌甲诱醇、核球壳菌、格哈菌素、卡包霉素和灰绿霉素前体等天然产物的手性源，是非常有应用前景的手性砌块。(S)-3-羟基丁酸乙酯分子式C6H12O3，分子量132.16，CAS号56816-01_4，可通过还原乙酰乙酸乙酯制得。由于乙酰乙酸乙酯易于合成且价格低廉，对其进行还原制备(S)-3-羟基丁酸乙酯是非常经济有效的方法。通过还原乙酰乙酸乙酯制备(S)-3_羟基丁酸乙酯主要有化学法和生物转化法两种。采用化学法不对称还原乙酰乙酸乙酯需要在手性催化剂的催化下才能完成，化学还原过程中手性催化剂价格昂贵、制备过程繁琐。生物转化法主要有两种方式，一种是直接利用醇脱氢酶催化乙酰乙酸乙酯，这种方法不仅要有酶蛋白参加反应，而且还要添加价格昂贵的辅酶因子，在实际应用中受到一定的限制。而微生物细胞中含有完整的酶系，如酵母细胞中含有醇脱氢酶系，可以实现辅酶的原位再生，不需要添加辅酶因子，是一种经济有效的制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的方法。采用微生物转化法还原乙酰乙酸乙酯制备(S)-3_羟基丁酸乙酯未见专利报道，只有少数文章公开报道，且产物的对映体过剩值及转化率均不理想，需要找到一种催化效率更高的菌株，并选择适当的反应条件，最大限度地提高产物的转化率及对映体过剩值。
发明内容本发明的目的是提供一种利用催化效率高的酿酒酵母菌株转化乙酰乙酸乙酯合成(S)-3-羟基丁酸乙酯的方法。本发明采用的技术方案是一种乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(S)-3_羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101，保藏日期2007年11月26日，保藏编号CGMCCNo.2266，已于在先申请CN200810059686.6中作为新菌株予以保护。菌株来源本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCCNo.2266是从杭州市西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化乙酰乙酸乙酯，得到酿酒酵母CGMCCNo.2266具有良好的转化乙酰乙酸乙酯生产(S)-3-羟基丁酸乙酯的能力。所述酿酒酵母CGMCCNo.2266的菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均勻的菌落形态。进一步，所述方法包括在pH5.08.0的磷酸盐缓冲液中，以乙酰乙酸乙酯为底物、以酿酒酵母CGMCCNo.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于2545°C下进行转化反应840小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。所述乙酰乙酸乙酯在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为0.050.25mol/L。所述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为150g/g底物。为提高转化效率，所述磷酸盐缓冲液中还可添加有50150g/L的葡萄糖作为辅助底物。所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到将酿酒酵母CGMCCNo.2266接种至发酵培养基中，培养温度为2635°C，摇床转速为150200r/min，培养1830h得到含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgSO4O.20.4g/L，K2HPO4·3Η200·51.5g/L,KH2PO4O.61.5g/L,自然pH值，溶剂为水。通常，菌株需要先用斜面培养基进行活化培养获得斜面活化菌种，活化菌种再经种子培养获得种子液再接入发酵培养液进行发酵产酶培养。本发明中，该酿酒酵母菌株的斜面培养、种子培养及发酵培养均可按照本领域常规方法进行，亦可参照CN200810059686.6中的培养方法。所述分离纯化方法如下将转化液离心分离弃去菌体细胞，取上清液5070°C水浴12小时弃去沉淀，取清液用等体积正己烷萃取，萃余液减压蒸馏蒸出水分，残余物(残余物为产物和缓冲液中的磷酸盐)用正己烷溶解，所得混合液抽滤除去磷酸盐，正己烷层加入无水硫酸钠脱水，抽滤后，得到的正己烷溶液蒸馏除去正己烷即得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。具体的，所述方法如下(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo.2266接种到斜面培养基，2635°C培养46天得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖712g/L，琼脂1525g/L，自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，2635°C，摇床转速为150200r/min，培养1826h得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgSO4O.20.4g/L，K2HPO4·3H200.51.5g/L，KH2PO4O.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积比1020%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为2635°C，摇床转速为150200r/min，培养1830h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgSO4O.20.4g/L，K2HPO4·3H200.51.5g/L，KH2PO4O.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水；(4)生物转化在pH5.08.0的磷酸盐缓冲液中，加入0.050.25mol/L的乙酰乙酸乙酯和50150g/L的葡萄糖，以及以细胞干重计为150g/g乙酰乙酸乙酯的含酶菌体细胞，于2545°C下进行转化反应840小时；(5)分离纯化转化液离心分离弃去菌体细胞，取上清液5070°C水浴12小时弃去沉淀，取清液用等体积正己烷萃取，萃余液减压蒸馏蒸出水分，残余物用正己烷溶解，所得混合液抽滤除去磷酸盐，正己烷层加入无水硫酸钠脱水，抽滤后，得到的正己烷溶液蒸馏除去正己烷即得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。得到的(S)-3-羟基丁酸乙酯纯品可用气相色谱-质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。摩尔转化率和产物(S)-3-羟基丁酸乙酯对映体过剩值(ee%)采用日本岛津气相色谱仪GC-2014分析检测。色谱柱为CP-Chirasil-DexCB(25mX0.25mmX0.25μm)手性色谱柱，分析条件为进样器温度250°C，检测器温度250°C，柱温80°C，载气为氮气，分流比125。手性柱可以检测到(R)_3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基丁酸乙酯两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-3-羟基丁酸乙酯的对映体过剩值(ee%)。本发明中采用微生物细胞不对称还原乙酰乙酸乙酯来制备(S)-3_羟基丁酸乙酯，可以获得高对映体过剩值的产品，摩尔转化率较高，重要的是，反应中伴有辅酶再生过程有利于提高转化率。本发明采用的微生物转化法制备(S)-3_羟基丁酸乙酯与化学合成法、酶催化法相比具有以下优点①生物催化剂为微生物菌体，比化学催化剂成本低廉；②环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化；③生产所用的菌株安全无毒；④不受季节影响，易于实现大规模工业化生产；⑤生产操作简便，生物转化率较高；⑥整个反应过程中不需要添加辅酶。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1斜面培养将CGMCCNo.2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C灭菌20min。用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以体积比10%的接种量接种于含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得菌体。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯，使其浓度分别为0.05mol/L、0.Imol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L，置于30°C，200r/min的摇床中反应16h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液60°C水浴1小时弃去沉淀后取清液用等体积正己烷萃取，水相混合物(萃余液)采用减压蒸馏除去水分后有盐析出，加入正己烷溶解产物，抽滤除盐后得到的样品蒸去正己烷即可获得(S)-3-羟基丁酸乙酯。气相色谱分析摩尔转化率和产物对映体过剩值(见表1)。表1底物初始浓度对转化率及(S)-3-羟基丁酸乙酯对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2斜面培养将CGMCCNo.2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C灭菌20min。用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以10%的接种量接种于含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得菌体。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯浓度为0.15mol/L，加入辅助底物葡萄糖浓度分别为10g/L、30g/L、50g/L、70g/L、100g/L、150g/L，置于30°C，200r/min的摇床中反应16h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液60°C水浴1小时弃去沉淀后取清液用等体积正己烷萃取，取水相混合物采用减压蒸馏除去水分后有盐析出，加入正己烷溶解产物，抽滤除盐后得到的样品蒸去正己烷即可获得(S)-3-羟基丁酸乙酯。气相色谱分析其摩尔转化率及产物对映体过剩值。表2添加葡萄糖对转化率及(S)-3-羟基丁酸乙酯对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3斜面培养将CGMCCNo.2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4Ig/L,121°C灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以10%的接种量接种于含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得菌体。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯浓度为0.15mol/L，加入辅助底物葡萄糖100g/L，在200r/min的摇床中分别于25°C、30°C、35°C、40°C、45°C下反应16h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液60V水浴1小时弃去沉淀后取清液用等体积正己烷萃取，取水相混合物采用减压蒸馏除去水分后有盐析出，加入正己烷溶解产物，抽滤除盐后得到的样品蒸去正己烷即可获得(S)-3-羟基丁酸乙酯。气相色谱分析其摩尔转化率及产物对映体过剩值。表3反应温度对转化率及(S)-3-羟基丁酸乙酯对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例4:斜面培养将CGMCCNo.2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以10%的接种量接种于含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得菌体。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯浓度为0.15mol/L，加入辅助底物葡萄糖浓度为100g/L，置于30°C，200r/min的摇床中分别反应8h、16h、24h、32h、40h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液60°C水浴1小时弃去沉淀后取清液用等体积正己烷萃取，取水相混合物采用减压蒸馏除去水分后有盐析出，加入正己烷溶解产物，抽滤除盐后得到的样品蒸去正己烷即可获得(S)-3-羟基丁酸乙酯。气相色谱分析其摩尔转化率及产物对映体过剩值。表4反应时间对转化率及(S)-3-羟基丁酸乙酯对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例5斜面培养将CGMCCNo.2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以10%的接种量接种于含有IOOml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得菌体。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述所得菌体分别为5g、10g、15g、20g、25g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯0.15mol/L，加入辅助底物葡萄糖浓度为100g/L，置于30°C，200r/min的摇床中反应16h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液60°C水浴1小时弃去沉淀后取清液用等体积正己烷萃取，取水相混合物采用减压蒸馏除去水分后有盐析出，加入正己烷溶解产物，抽滤除盐后得到的样品蒸去正己烷即可获得(S)-3-羟基丁酸乙酯。气相色谱分析摩尔转化率及产物对映体过剩值。表5菌体量对转化率及(S)-3-羟基丁酸乙酯对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>菌体细胞浓度(g/L)~~(S)-3-羟基丁酸乙酯的对映(干重/缓冲液体积)转化率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括在pH5.O8.O的磷酸盐缓冲液中，以乙酰乙酸乙酯为底物、以酿酒酵母CGMCCNo.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于2545°C下进行转化反应840小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述乙酰乙酸乙酯在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为0.050.25mol/L。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为150g/g底物。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液中还添加有50150g/L的葡萄糖作为辅助底物。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到将酿酒酵母CGMCCNo.2266接种至发酵培养基中，培养温度为2635°C，摇床转速为150200r/min,培养1830h得到含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgSO40.20.4g/L，K2HPO4·3Η200·51.5g/L，KH2PO40·61.5g/L，自然pH值，溶剂为水。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下将转化液离心分离弃去菌体细胞，取上清液5070°C水浴12小时弃去沉淀，取清液用等体积正己烷萃取，萃余液减压蒸馏蒸出水分，残余物用正己烷溶解，所得混合液抽滤除去磷酸盐，取正己烷层加入无水硫酸钠脱水，抽滤后，得到的正己烷溶液蒸馏除去正己烷即得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。8.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo.2266接种到斜面培养基，2635°C培养46天得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖712g/L，琼脂1525g/L，自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min,灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，2635°C，摇床转速为150200r/min，培养1826h得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgSO40.20.4g/L，K2HPO4·3H200.51.5g/L，KH2PO40.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积比1020%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为2635°C，摇床转速为150200r/min，培养1830h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L,酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgSO40.2-0.4g/L，K2HPO4·3Η200·51.5g/L，KH2PO40·61.5g/L，自然pH值，溶剂为水；(4)生物转化在pH5.08.0的磷酸盐缓冲液中，加入0.050.25mol/L的乙酰乙酸乙酯和50150g/L的葡萄糖，以及以细胞干重计为150g/g乙酰乙酸乙酯的含酶菌体细胞，于2545°C下进行转化反应840小时；(5)分离纯化转化液离心分离弃去菌体细胞，取上清液5070°C水浴12小时弃去沉淀，取清液用等体积正己烷萃取，取萃余液减压蒸馏蒸出水分，残余物用正己烷溶解，所得混合液抽滤除去磷酸盐，取正己烷层加入无水硫酸钠脱水，抽滤后，得到的正己烷溶液蒸馏除去正己烷即得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。全文摘要本发明提供了一种乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(S)-3-羟基丁酸乙酯。本发明的有益效果主要体现在①生物催化剂为微生物菌体，比化学催化剂成本低廉；②环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化；③生产所用的菌株安全无毒；④不受季节影响，易于实现大规模工业化生产；⑤生产操作简便，生物转化率较高；⑥整个反应过程中不需要添加辅酶。文档编号C12P7/04GK101824438SQ20101010861公开日2010年9月8日申请日期2010年2月9日优先权日2010年2月9日发明者欧志敏,陈庆美,陈晓彦申请人:浙江工业大学