专利名称：一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸rna结合蛋白的方法
技术领域：
本发明属于基因工程中分子生物学蛋白加工技术领域，具体涉及一种利用大肠杆 菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法。
背景技术：
现有技术利用大肠杆菌表达外源蛋白主要包括克隆目的基因、构建重组表达质粒 转化表达菌、诱导表达、蛋白提取、活性鉴定等步骤，其中诱导表达和蛋白提取是精髓所在， 但是存在成本高，操作复杂，生产周期长，而且蛋白表达率低、活性差，不易纯化、较易降解 的不足。为此，本发明人经过潜心研究，研制开发了一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸 RNA结合蛋白的方法，试验证明，应用效果良好。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供了一种成本低、操作简单、生产 周期短、适于大规模生产、蛋白表达率高、易于纯化、不易降解的利用大肠杆菌表达烟草富 含甘氨酸RNA结合蛋白(GRP)的方法。本发明的目的是实现的包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲液配制， 具体包括下列工序A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；B、构建重组表达质粒pGEX4T-l-GRP ；C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达；D、蛋白提取；E、蛋白活性鉴定。本发明通过筛选大肠杆菌高效表达菌株，优化培养基，克隆基因构建出GRP基因 重组表达质粒PGEX4T-1-GRP，再用阳性质粒对菌种为Rosetta的大肠杆菌菌株进行转化， 并采用优化的专用培养基LinA培养、缓冲液TKM，筛选出了高效表达菌株，从而提高了烟草 中富含甘氨酸RNA结合蛋白的表达效率。本发明具有成本低、操作简单、生产周期短、适于 大规模生产、蛋白表达率高、活性强，易于纯化、不易降解的优点。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，任 何基于本发明教导所作的变换均属于本发明的保护范围。本发明包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲液配制，其特征在于具体 包括下列工序A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；B、构建重组表达质粒pGEX4T-l-GRP ；
C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达；D、蛋白提取；E、蛋白活性鉴定。所述的A工序，系按试剂盒载明的技术规范进行，根据GenBank中GRP基因序列，设计出针对GRP基因的引物，提取总RNA为模板，在逆转录酶的作用下逆转录出GRP基因 cDNA Ist-Stand ；再设计引物，以逆转录出的Ist-Stand为模板PCR扩增cDNA，PCR结束后， 经琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化后的克隆至增值载体PMD20-T中，热激法转化大肠 杆菌普通增殖感受态细胞DH5 α，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送测序。所述的B工序，系根据GRP基因阳性重组质粒的测序结果，通过上下游加入酶切位 点和保护碱基设计引物，以GRP基因阳性重组质粒pMD20-T-GRP为模板进行PCR，扩增出两 端带有酶切位点和保护碱基的GRP基因序列；经琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化后双 酶切，与用同两种酶双酶切的PGEX4T-1载体连接、热激法转化大肠杆菌普通增殖感受态细 胞DH5 α、挑单克隆菌株扩大培养，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送测 序。所述的C工序，将用阳性pGEX4T-l-GRP质粒转化的大肠杆菌表达菌rosetta，涂 培养基LinA平板，37°C恒温培养箱培养约15小时至长出单克隆，用牙签挑10个克隆菌株 分别做好标记，各克隆菌株的一半分别放入2ml培养基LinA中，于37°C摇约4_5小时至 OD600 = 0 . 5，每管取出200 μ 1作为阴性对照，剩余加终浓度为0. 5mM的异丙基-β _D_硫代 半乳糖苷IPTG，于37°C下诱导两小时后所有管取200μ 1，同两小时前取出的阴性对照一起 (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)SDS-PAGE ；选择表达量最好的克隆，从板上挑剩余 的一半接种入IOOml培养基LinA中，于37°C振摇培养15小时；按1 100转接入IL培养 基LinA中，摇约2小时至OD6tltl = 0. 6-0. 8，加入终浓度为0. 5mM的异丙基- β _D_硫代半 乳糖苷IPTG于37°C下诱导，2小时后离心收集菌体，并用缓冲液IOxA洗一次，沉淀物冷冻 于-80°C冰箱中备用。所述的D工序，将诱导表达收集的菌体从-80°C冰箱取出置于冰上或4°C冰箱中约 半小时至溶化；按质量体积比1 10的比例加入缓冲液TKM，涡旋震荡混勻，加入100倍的 苯甲基磺酰氟化物PMSF，溶菌酶，1000倍的二巯基苏糖醇DTT后于冰上磁力搅拌半小时； 然后再加入PMSF、DTT,于180HZ超声波间歇破碎lmin，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消化 IOmin,于12000rpm离心分离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱体纯化蛋白。所述的E工序，纯化蛋白采用常规酶联免疫吸附测定ELISA和蛋白印迹法western blotting进行鉴定。所述的培养基LinA由8_12g的胰蛋白胨Trypton、l_3g的酵母抽提物 Yeastextracts,4-6g的氯化钠Nacl、80_120ml的缓冲液IOxA和IOOOml双蒸水配制而成； 所述的培养基LinA使用前加入经过滤除菌的浓度0. 5%的葡萄糖。所述的缓冲液IOxA由380-420mM的磷酸钾K2HP04、150_250mM的磷酸氢钾 KH2P04、70-90mM 的硫酸铵(NH4) 2S04 和 16-20mM 的柠檬酸钠 SodiumCitrate 配制而成。所述的缓冲液TKM由8_12mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl、 40-60mM氯化钾KCl、8-12mM的醋酸镁Mg (AC) 2配制而成。所述的溶菌酶用蛋白提取缓冲液TKM溶解。
实施例1 首先提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因。根据GRP基因 阳性重组质粒的测序结果，设计引物，以GRP基因阳性重组质粒pMD20-T-GRP为模板进行 PCR,通过扩增、电泳分离、双酶切，热激法转化大肠杆菌普通增殖感受态细胞DH5 α、挑单 克隆菌株扩大培养，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送测序。将用阳性 PGEX4T-I-GRP质粒转 化的大肠杆菌表达菌rosetta，涂由IOg的胰蛋白胨Trypt0n、2g的酵 母抽提物Yeastextracts、5g的氯化钠Nacl、IOOml的缓冲液IOxA和IOOOml双蒸水配制而 成的培养基LinA平板，37°C恒温培养至长出单克隆，挑选后分别置入培养基LinA中摇种 子培养，选择表达量最好的克隆菌株，然后进行大量表达，离心分离，用由400mM的磷酸钾 K2HP04、200mM的磷酸氢钾KH2P04、80mM的硫酸铵(NH4) 2S04和18mM的柠檬酸钠Sodium Citrate配制而成的缓冲液IOxA洗一次，沉淀物冷冻于_80°C冰箱中备用。从_80°C冰箱取 出置于冰上或4°C冰箱中约半小时至溶化；按质量体积比1 10的比例加入由IOmM的三 羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液Tris-HCl、50mM氯化钾KClUOmM的醋酸镁Mg (AC) 2配制而 成的缓冲液TKM，涡旋震荡混勻，加入100倍的苯甲基磺酰氟化物PMSF，加入0. 5 %的葡萄糖 的溶菌酶，1000倍的二巯基苏糖醇DTT后于冰上磁力搅拌半小时；然后再加入PMSF、DTT, 于180HZ超声波2S等间隔时间间歇破碎lmin，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消化lOmin， 于12000rpm离心分离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱纯化蛋白。经鉴定，目 标蛋白表达率占菌体总蛋白51-57%。实施例2 首先提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因。根据GRP基因 阳性重组质粒的测序结果，设计引物，以GRP基因阳性重组质粒pMD20-T-GRP为模板进行 PCR,通过扩增、电泳分离、双酶切，热激法转化大肠杆菌普通增殖感受态细胞DH5 α、挑单 克隆菌株扩大培养，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送测序。将用阳性 PGEX4T-I-GRP质粒转化的大肠杆菌表达菌rosetta，涂由8g的胰蛋白胨Trypt0n、3g的酵 母抽提物Yeastextracts、6g的氯化钠NaCl、80ml的缓冲液IOxA和IOOOml双蒸水配制而 成的培养基LinA平板，37°C恒温培养至长出单克隆，挑选后分别置入培养基LinA中摇种 子培养，选择表达量最好的克隆菌株，然后进行大量表达，离心分离，用由380mM的磷酸钾 K2HP04、150mM的磷酸氢钾KH2P04、90mM的硫酸铵(NH4) 2S04和20mM的柠檬酸钠Sodium Citrate配制而成的缓冲液IOxA洗一次，沉淀物冷冻于_80°C冰箱中备用。从_80°C冰箱取 出置于冰上或4°C冰箱中约半小时至溶化；按质量体积比1 10的比例加入由SmM的三羟 甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液Tris-HCl、60mM氯化钾KCl、12mM的醋酸镁Mg(AC) 2配制而成 的缓冲液TKM，涡旋震荡混勻，加入100倍的苯甲基磺酰氟化物PMSF，加入0. 5 %的葡萄糖 的溶菌酶，1000倍的二巯基苏糖醇DTT后于冰上磁力搅拌半小时；然后再加入PMSF、DTT, 于180HZ超声波2S等间隔时间间歇破碎lmin，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消化lOmin， 于12000rpm离心分离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱纯化蛋白。经鉴定，目 标蛋白表达率占菌体总蛋白21-47%。实施例3:首先提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因。根据GRP基因 阳性重组质粒的测序结果，设计引物，以GRP基因阳性重组质粒pMD20-T-GRP为模板进行PCR，通过扩增、电泳分离、双酶切，热激法转化大肠杆菌普通增殖感受态细胞DH5 α、挑单克隆菌株扩大培养，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送测序。将用阳性 PGEX4T-1-GRP质粒转化的大肠杆菌表达菌rosetta，涂由12g的胰蛋白胨Trypton、Ig的酵 母抽提物Yeastextracts、4g的氯化钠Nacl、120ml的缓冲液IOxA和IOOOml双蒸水配制 而成的培养基LinA平板，37°C恒温培养至长出单克隆，挑选后分别置入培养基LinA中摇 种子培养，选择表达量最好的克隆菌株，然后进行大量表达，离心分离，用420mM的磷酸钾 K2HP04、250mM的磷酸氢钾KH2P04、70mM的硫酸铵(NH4) 2S04和16mM的柠檬酸钠Sodium Citrate配制而成的缓冲液IOxA洗一次，沉淀物冷冻于_80°C冰箱中备用。从_80°C冰箱取 出置于冰上或4°C冰箱中约半小时至溶化；按质量体积比1 10的比例加入由12mM的三 羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液Tris-HCl、40mM氯化钾KCl、8mM的醋酸镁Mg (AC) 2配制而成 的缓冲液TKM，涡旋震荡混勻，加入100倍的苯甲基磺酰氟化物PMSFj^A 0. 5%的葡萄糖 的溶菌酶，1000倍的二巯基苏糖醇DTT后于冰上磁力搅拌半小时；然后再加入PMSF、DTT, 于180HZ超声波2S等间隔时间间歇破碎lmin，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消化lOmin， 于12000rpm离心分离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱纯化蛋白。经鉴定，目 标蛋白表达率占菌体总蛋白44-51%。本发明具有以下特点1、能获取活性好的烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白。2、建立了有效的筛选高效表达菌株的方法，目标蛋白产率高、易于纯化。3、本发明具有成本低、操作简单、生产周期短、适于大规模生产的优点。
权利要求
一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法，包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲液配制，其特征在于具体包括下列工序A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；B、构建重组表达质粒pGEX4T-1-GRP；C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达；D、蛋白提取；E、蛋白活性鉴定。
2.如权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的A工序，系按试剂盒载明的技术规范进行，根据GenBank中GRP基因序 列，设计出针对GRP基因的引物，提取总RNA为模板，在逆转录酶的作用下逆转录出GRP基 因cDNA Ist-Stand ；再设计引物，以逆转录出的Ist-Stand为模板PCR扩增cDNA，PCR结束 后，经琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化后的克降至增值载体PMD20-T中，热激法转化 大肠杆菌普通增殖感受态细胞DH5 α，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送 测序。
3.如权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的B工序，系根据GRP基因阳性重组质粒的测序结果，通过上下游加入酶 切位点和保护碱基设计引物，以GRP基因阳性重组质粒pMD20-T-GRP为模板进行PCR，扩增 出两端带有酶切位点和保护碱基的GRP基因序列；经琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化 后双酶切，与用同两种酶双酶切的PGEX4T-1载体连接、热激法转化大肠杆菌普通增殖感受 态细胞DH5 α、挑单克隆菌株扩大培养，PCR鉴定，能PCR出正确大小基因片段的阳性质粒送 测序。
4.如权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的C工序，将用阳性pGEX4T-l-GRP质粒转化的大肠杆菌表达菌rosetta， 涂培养基LinA平板，37°C恒温培养箱培养约15小时至长出单克隆，用牙签挑10个克降菌 株分别做好标记，各克降菌株的一半分别放入2ml培养基LinA中，于37°C摇约4_5小时至 OD600 = 0 . 5，每管取出200 μ 1作为阴性对照，剩余加终浓度为0. 5mM的异丙基-β _D_硫代 半乳糖苷IPTG，于37°C下诱导两小时后所有管取200μ 1，同两小时前取出的阴性对照一起 SDS-PAGE ；选择表达量最好的克隆，从板上挑剩余的一半接种入IOOml培养基LinA中，于 37°C振摇培养15小时；按1 100转接入IL培养基LinA中，摇约2小时至OD6tltl = 0.6-0. 8， 加入终浓度为0. 5mM的异丙基- β -D-硫代半乳糖苷IPTG于37°C下诱导，2小时后离心收 集菌体，并用缓冲液IOxA洗一次，沉淀物冷冻于-80°C冰箱中备用。
5.如权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的D工序，将诱导表达收集的菌体从-80°C冰箱取出置于冰上或4°C冰箱 中约半小时至溶化；按质量体积比1 10的比例加入缓冲液TKM，涡旋震荡混勻，加入100 倍的苯甲基磺酰氟化物PMSF，溶菌酶，1000倍的二巯基苏糖醇DTT后于冰上磁力搅拌半小 时；然后再加入PMSF、DTT，于180HZ超声波间歇破碎lmin，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消 化lOmin，于12000rpm离心分离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱体纯化蛋白。
6.如权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方 法，其特征在于所述的E工序，纯化蛋白采用常规酶联免疫吸附测定ELISA和蛋白印迹法western blotting 进行鉴定。
7.如权利要求4所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的培养基LinA由8-12g的胰蛋白胨Trypt0n、l-3g的酵母抽提物Yeast extracts,4-6g的氯化钠Nacl、80_120ml的缓冲液IOxA和IOOOml双蒸水配制而成；所述 的培养基LinA使用前加入经过滤除菌的浓度0. 5%的葡萄糖。
8.如权利要求4或7所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方 法，其特征在于所述的缓冲液IOxA由380-420mM的磷酸钾K2HP04、150_250mM的磷酸氢钾 KH2P04、70-90mM 的硫酸铵(NH4) 2S04 和 16-20mM 的柠檬酸钠 Sodium Citrate 配制而成。
9.如权利要求5所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的缓冲液TKM由8-12mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl、 40-60mM氯化钾KCl、8-12mM的醋酸镁Mg (AC) 2配制而成。
10.如权利要求5所述的一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法， 其特征在于所述的溶菌酶用蛋白提取缓冲液TKM溶解。
全文摘要
本发明公开了一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRP)的方法，包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲液配制，其特征在于具体包括下列工序A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；B、构建重组表达质粒pGEX4T-1-GRP；C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达；D、蛋白提取和E、蛋白活性鉴定。本发明通过筛选大肠杆菌高效表达菌株，优化培养基，克隆基因构建出GRP基因重组表达质粒pGEX4T-1-GRP，再用阳性质粒对菌种为rosetta的大肠杆菌菌株进行转化，并采用优化的专用培养基LinA培养、缓冲液TKM，筛选出了高效表达菌株，从而提高了烟草中富含甘氨酸RNA结合蛋白的表达效率。本发明具有成本低、操作简单、生产周期短、适于大规模生产、蛋白表达率高、活性强，易于纯化、不易降解的优点。
文档编号C12N15/70GK101824429SQ20101011090
公开日2010年9月8日 申请日期2010年2月21日 优先权日2010年2月21日
发明者刘勇, 卢秀萍, 唐启慧, 李文正, 陈学军, 陈禹保 申请人:云南省烟草农业科学研究院