专利名称：体外预测肿瘤转移和侵袭能力的方法及核苷酸片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法及所使用的人工核苷 酸片段。
背景技术：
恶性肿瘤的侵袭和转移能力是决定患者预后的重要因素。肿瘤组织侵袭破坏邻近 器官和远处转移既是使患者失去手术治疗机会的主要因素，也是手术后复发导致治疗失败 的基本原因。建立预测恶性肿瘤的侵袭和转移能力的方法是人们长期追求的目标，对制定 肿瘤患者手术后治疗方案有重要指导价值。根据肿瘤的病理形态学变化很难对患者手术后的转移和复发情况做出判断，人们 对是否可用分子生物学的手段来对恶性肿瘤进行分子分型寄予了厚望，在MMP7等基因的 蛋白和mRNA水平改变方面做出了许多的努力。尽管国内外在这一领域进行了大量的研究， 但至今仍然缺乏一种能够早期准确识别恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法。在分子生物学飞速发展的今天，人们对细胞癌变机制已经有了更加全面的认识。 例如，研究者除了发现P53、APC等肿瘤抑制基因结构变异导致基因失活之外，他们还发现 pl5、pl6、hMLHl等基因CpG岛的异常甲基化也将导致这些基因的表观遗传(印igenetic) 失活。组织中存在这种表观遗传失活的细胞数目较少时，目的基因的总蛋白和总mRNA水平 往往不会有明显变化。由于CpG岛甲基化检测方法及其灵敏，可检测到少数细胞中存在的 CpG岛异常甲基化变化，在肿瘤的分子分型上可能发挥特殊作用。血清反应因子(Serum Response Factor, SRF)调节许多细胞增殖相关基因的表 达，通过肿瘤间质来影响肝癌、胰腺癌、结肠癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤细胞的侵袭能力 (Nature Cell Biology 2009，11 :257-268)，具有癌基因的作用。目前未见利用SRF甲基化 失活来测定机体抵御恶性肿瘤侵袭和转移能力的报道。
发明内容
现有技术中还未见可以预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法。为了填补这一空 白，本发明提供了一种通过检测组织中是否存在5’端的CpG岛中的甲基化的胞嘧啶的血清 反应因子核苷酸序列以预测恶性肿瘤的侵袭和转移的能力的方法。—方面，本发明通过了一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其中，该方 法包括以下步骤a)从手术切缘组织或癌旁活检组织中提取DNA ；b)检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5，-端CpG岛中胞 嘧啶的甲基化程度；C)当步骤b)中测得存在5’ -端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA 序列时，则推定被测组织具有抵御恶性肿瘤侵袭和转移能力。另一方面，本发明还提供了四种人工核苷酸片段，一条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO :5所示的核苷酸序，或者具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序；另一 条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序或者具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序；另一条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID N0:9所示 的核苷酸序或者具有SEQ ID NO :10所示的核苷酸序；另一条片段的特征在于，该人工核苷 酸片段具有SEQ ID NO :11所示的核苷酸序或者具有SEQ ID NO 12所示的核苷酸序。本发明的发明人首次发现通过检测组织中是否存在5’-端的CpG岛中的甲基化胞 嘧啶的SRF核苷酸序列以快速并准确地预测恶性肿瘤的侵袭和转移的能力。此外，本发明 的发明人还提供了四种人工核苷酸片段，利用这四种核苷酸片段可以准确快速地检测SRF 核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度。附图的简要说明
图1为SRF基因CpG岛(A)、胃癌及手术切缘组织中SRF的CpG岛中的胞嘧啶甲基 化比率(B)及其PCR扩增产物的变性高效液相色谱技术(DHPLC)色谱图(C)。图2为胃癌手术切缘组织SRF甲基化阳性和阴性胃癌患者术后总生存时间(月) 比较。图3为克隆测序结果展示胃癌组织中SRF关键性CpG位点(即SEQ ID NO :1所示 的核苷酸序列的第86-161位中的CpG位点)存在胞嘧啶甲基化。测定2个SRF CpG岛中 胞嘧啶甲基化阳性(F0859和F0860)和1个阴性(F0974)样品的克隆测序结果。每一行代 表一个克隆；每个圆点代表一个CpG位点，黑色和白色圆点分别代表甲基化和非甲基化CpG 位点；方框所在为关键性甲基化CpG位点所在区域。图4为甲状腺癌旁组织中存在SRF基因PCR扩增产物中甲基化CpG岛的DHPLC色 谱图。图5为口腔癌旁组织中存在SRF基因PCR扩增产物中甲基化CpG岛的DHPLC色谱 图。
具体实施例方式SRF基因是重要的原癌基因，其启动子区包含CpG岛，该CpG岛的甲基化状态调控 该基因的表达。本申请的发明人发现在正常组织中该基因保持非甲基化的低表达状态，而 在肿瘤组织中该基因的表达明显上调。本申请的发明人猜想在肿瘤发生时，如果宿主靶器 官中的正常组织(包括肿瘤间质和癌旁组织)细胞发生SRF基因甲基化失活，也许可以抵 御肿瘤细胞的侵袭和转移。基于此，本申请的发明人进一步猜想可能通过检测癌旁组织中 SRF基因甲基化水平，可能预测出机体抵御肿瘤细胞侵袭和转移的能力。为了验证上述猜想是否正确，本申请的发明人设计了以下实验方法进行了大量的 实验进行验证，获得了大量的实验结果，从这些结果中完全可以推出上述猜想是完全可行 的。所述实验方法包括以下基本步骤1、组织DNA提取分别提取来自肿瘤切缘组织或癌旁活检组织、SRF甲基化阳性对 照细胞和未甲基化阴性对照细胞DNA(不少于IOng)；2、SRF CpG岛中胞嘧啶甲基化序列测定利用化学修饰法将未甲基化胞嘧啶修饰 成尿嘧啶；根据SRF CpG岛修饰后序列，设计和合成不含CpG位点、可同时扩增甲基化和非 甲基化序列的通用PCR上游和下游引物[或者可与该序列所含甲基化CpG位点特异性互补 的甲基化特异性PCR上游和下游引物]；用这些引物对修饰后待测样品中的SRF进行PCR扩增，然后利用DHPLC、克隆测序等方法，检测甲基化和非甲基化SRF CpG岛扩增产物的存在； 或者利用其它现有技术进行检测。3、根据SRF CpG岛中胞嘧啶甲基化程度判断肿瘤侵袭和转移的能力。验证1 本申请的发明人从胃癌转移相关DNA甲基化组芯片数据库中发现非转移 性胃癌手术切缘组织SRF的CpG岛中胞嘧啶的甲基化水平明显高于转移性胃癌切缘组织 的，利用DHPLC测定该CpG岛中胞嘧啶的甲基化，得到相同的结果(图1)。验证2 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得甲状腺癌切缘组织中同样存在 SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。验证3 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得口腔癌切缘组织中同样存在 SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。验证4 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得肝癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。验证5 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得乳腺癌切缘组织中同样存在 SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。验证6 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得结肠癌切缘组织中同样存在 SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。验证7 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得胰腺癌切缘组织中同样存在 SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。验证8 本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得肺癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。基于以上结果，本发明提供了一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其 中，该方法包括以下步骤a)从手术切缘组织或癌旁活检组织中提取DNA ；b)检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5，-端CpG岛中胞 嘧啶的甲基化程度；c)当步骤b)中测得存在5’ -端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA 序列时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。对于步骤a)中的DNA的提取可以采用本领域任何常规的方法进行提取，还可以采 用DNA提取试剂盒进行提取，例如Qiagen公司提供的DNA提取试剂盒。当步骤b)中测得 存在5’ -端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列时，完全可以预测组织具 有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力，例如，图3显示当检测的组织中的血清反应因子基因DNA 序列中存在一个5’ -端CpG岛中甲基化胞嘧啶时，就能确定该组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭 和转移能力。为了进一步提高检测准确率，作为一种优选的实施方式，在上述步骤b)中检测步 骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’ -端关键性CpG岛中胞嘧啶的甲基 化程度，即检测5’ -端第86-161位中的CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度或者在步骤b)中检 测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5，-端的367-505位中的CpG岛 中胞嘧啶的甲基化程度。所述血清反应因子基因DNA序列5，-端的片段具有SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列，具体如下；所述5’ -端关键性CpG岛的位点所在位置在以下序列中用下划线表示5’- IgccacaggggcaggaaagtgagI'ggcccaggtcggcccgggcgtgcaggggccccgggttc
gcagcggcggccgcggcagcgatagcggcactagcagcagcgggagtgccgggttgagccgggaagccgatggcggc ggctgcggcggctccgattcctcgctgactgcccgtccgccctcctgcatcgagcgccatgttaccgacccaagctg gggccgcggcggctctgggccggggctcggccctggggggcagcctgaaccggaccccgacggggcggccgggcggc ggcggcgggacacgcggggctaacgggggccgggtccccgggaatggcgcggggctcgggcccggccgcctggagcg ggaggctgcggcagcggcggcaaccaccccggcgcccaccgcgggggccctctacagcggcagcgagggcgactcgg agtcgggcgaggaggaggagctgggcgccgagcggcgcggcctgaagcggagcctgagcgagatggagatcggtatg gtggtcggtgggcccgaggcgtcggcagcggccaccgggggctacgggccggtgagcggcgcggtgagcggggccaa gccgggtaagaagacccggggccgcg |tgaagatcaagatggagttcat| -3，对于上述步骤b)中的血清反应因子基因DNA序列5’ -端CpG岛中胞嘧啶的甲基 化程度的检测可以采用本领域任何常规的DNA甲基化检测技术进行检测。但为了提高准确 率，作为一种优选的实施方式，其中，步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是 通过以下步骤实现的1)通过化学修饰方法将步骤a)中所获得的DNA中未被甲基化的胞嘧啶转化为尿 嘧啶，获得含有甲基化的胞嘧啶的DNA和不含有胞嘧啶和甲基化胞嘧啶的DNA的混合物；2)根据SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO 3所示的核苷酸序 列设计的引物对对步骤1)所获得的混合物进行PCR扩增；3)通过变性高效液相色谱法或测序法测定是否存在5’ -端CpG岛中甲基化胞嘧 啶的血清反应因子dna片段；或者步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是通过以下步骤实现 的1)将步骤a)中所获的DNA超声碎裂或酶切裂解成200bp左右大小的片断；2)用甲基化DNA结合蛋白或者5_甲基胞嘧啶抗体富集甲基化DNA的方法，富集 步骤1)中的甲基化DNA;3)以步骤2)所获DNA为模板，利用根据SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列设计的对胞嘧啶甲基化特异性引物对进行PCR扩增，如果能够 扩增出血清反应因子基因DNA的5’ -端片段，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者 将步骤2~)所获DNA直接进行序列测定，如果能够检测到血清反应因子基因DNA的5’ -端 片段的存在，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者将步骤幻所获DNA进行标记，然后 与能与血清反应因子基因DNA的5’ -端片段结合的探针进行杂交，如果能够检测到杂交信 号，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是通过以下步骤实现 的将步骤a)所获DNA利用甲基化敏感酶进行酶切消化，然后与带标记的能与血清反 应因子基因DNA的5’-端片段结合的DNA探针杂交，如果能够检测到杂交信号，则存在所述 CpG岛中胞嘧啶的甲基化。尽管所述引物对可以为任何基于所述序列设计的通用引物对，但为了进一 步提高检测准确率，作为一种优选的实施方式，所述根据seq id no :1所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列设计的引物对为可以为通用引物对， 且该引物对的上游引物可以为5，-gttataggggtaggaaagtgag-3',下游引物可以为 5，-ataaactccatcttaatcttcac-3，；或者上游弓I物可以为 5，-atgaattttattttgattttta-3，， 下游引物可以为5’在本发明的一种实施方式种，所述根据SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或者根 据SEQ ID Ν0:3所示的核苷酸序列设计的引物对可以为胞嘧啶甲基化特异性引物对， 且胞嘧啶甲基化特异性引物对的上游引物可以为5，-ggtattagtagtagcgggagtgtc-3 ’， 下游引物可以为5，-ccaacttaaatcgataacataacg-3‘。为了排除假阴性结果，可 以涉及针对未被甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶的引物对，其上游引物可以为
-gtattagtagtagtgggagtgttgg-3'，下游引物可以为 -ccccaacttaaatcaataac为了进一步提高诊断准确率，作为一种优选的实施方式，其中，当步骤b)中所测 得存在5’-端片段的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于4的血清反应因子DNA序列 时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。更优选为当步骤b)中所测得存在 5’ -端片段的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于6的血清反应因子DNA序列时，则 推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。或者更优选当测得存在血清反应因子基 因DNA序列5，-端的第86-161位中的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于4的DNA 片段时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。或者更优选当测得存在血清 反应因子基因DNA序列5’-端的367-505位中的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于 4的DNA片段时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。尽管本文中所述恶性肿瘤可以为任何表达血清反应因子的癌症，但作为一种优选 的实施方式，其中，所述恶性肿瘤可为实体瘤，更优选为胃癌、甲状腺癌、口腔癌、肝癌、乳腺 癌、肺癌、胰腺癌或结肠癌等。所述SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列为CpG岛中胞嘧啶被全部甲基化和非CpG位 点胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应因子DNA序列的正意义链的5’ -端片段。该序 列可以用于在检测血清反应因子DNA序列的5’ -端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方 法中。具体地说，该序列可以用作设计PCR引物的基准，以便检测血清反应因子DNA序列的 5’ -端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶。所述SEQ ID NO :2所示的核苷酸序为CpG岛中胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血 清反应因子DNA序列的正意义链的5’-端片段。该序列可以用于在检测血清反应因子DNA 序列的5’ -端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中。具体地说，该序列可以用作设计 PCR引物的基准，以便排除检测血清反应因子DNA序列的5’ -端不存在CpG岛中甲基化胞 嘧啶的假阴性结果。所述SEQ ID NO :3所示的核苷酸序为CpG岛中胞嘧啶被全部甲基化和非CpG位点 胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应因子DNA序列的反意义链的5’-端片段。该序列的 作用与SEQ ID NO 1相同。SEQ ID NO 4所示的核苷酸序为CpG岛中胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应 因子DNA序列的反意义链的5，-端片段。该序列的作用与SEQ ID N0:2相同。上述SEQ ID NO :1_4所示的核苷酸序分别如下文所示。
SEQ ID NO 1所示的核苷酸序如下所示(下划线标出的为关键性CpG位点的胞嘧 啶被甲基化的区域；加框序列为通用引物匹配部位。)5' - Iguuauagggguaggaaagtga^gguuuaggtcgguucgggcgtguagggguuucgggttc
guagcggcggucgcgguagcgatagcgguautaguaguagcgggagtcucgggttga⑶cgggaa⑶cgatggcggc ggutgcggcg⑶tucgattuutcgutgautguucgtucguuutuutguatcgagc⑶uatgttaucgauuuaa⑶tg gg⑶cgcggcggututgg⑶cggg⑶tcgguuutggggggua⑶utgaaucggauuucgacggggcggucgggcggc ggcggcgggauacgcggggutaacgggg⑶cgggtuuucgggaatggcgcggggutcggguucg⑶cguutggagq^ ggaggutgcgguagcggcg⑶aauuauuucggcguuuaucgcgggg⑶uututauagcgguagcgagggcgautcgg agtcgggcgaggaggagga⑶tgggcgucgagcggcgcg⑶utgaagcgga⑶utgagcgagatggagatcggtatg gtggtcggtgg⑶ucgaggcgtcgguagcg⑶uaucgggggutacgg⑶cggtgagcggcgcggtgagcggg⑶uaa gucgggtaagaagauucggggucgcg |tgaagatuaagatggagttual1 _3，SEQ ID NO :2所示的核苷酸序如下所示，SEQ ID NO :1中的未被甲基化的胞嘧啶 被修饰成尿嘧啶(下划线标出的为关键性CpG位点未被甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶区 域，加框序列为通用引物匹配部位)5' - iguuauagggguaggaaagtgagigguuuaggtugguuugggugtguagggguuuugggttu
guagug⑶gguu⑶ggua⑶gata⑶gguautaguagua⑶gggagtcuugggttga⑶ugggaa⑶ugatggug⑶ ggutcuggug ⑶ tuugattuutugutgautguuugtuuguuutuutguatuga ⑶⑶ uatgttauugauuuaa ⑶ tg gg⑶ugug⑶ggututgg⑶uggg⑶tugguuutggggggua⑶utgaauuggauuuugauggg⑶gguugg⑶ggu ggug ⑶ gggauau ⑶ ggggutaaugggg ⑶ ugggtuuuugggaatg ⑶⑶ ggggutuggguuug ⑶ uguutggagu￡ ggaggutcuggua⑶ggug⑶aauuauuuugguguuuauu⑶gggg⑶uututaua⑶ggua⑶gagg⑶gautugg agtugg⑶gaggaggagga⑶tggguguuga⑶ggugug⑶utgaagugga⑶utga⑶gagatggagatuggtatg gtggtuggtgg⑶uugaggugtugguagug⑶uauugggggutaugg⑶uggtga⑶gguguggtgaguggg⑶uaa guugggtaagaagauuugggguugu igtgaagatuaagatggagttuati _3，SEQ ID NO 3所示的核苷酸序如下所示(下划线标出者为关键性CpG位点甲基化 区域)5 ’ -atgaautuuatuttgatuttuacgcg⑶uucgggtuttuttauucg⑶ttgguuuc⑶tuaucgc ⑶cgutuaucgguucgtaguuuucggtgguc⑶tgucgacguutcgg⑶uuaucgauuauuataucgatutuuatu tcgutuaggutuc⑶ttuaggucgc⑶cgutcggc⑶uuagutuutuutuutc⑶ucgautucgagtcguuutcg utguc⑶tgtagagg⑶uuucgcggtgggcgucggggtggttguc⑶cgutcucguaguutuuc⑶tuuaggcgg ucgg⑶ucgaguuucgc⑶uattuucggggauucg⑶uuucgtta⑶uucgcgtgtuuc⑶cguc⑶cguucg⑶ cguuucgtcggggtucggttuaggutcuuuuuuagggucgaguuucgguuuagaguc⑶cgcg⑶uuua⑶ttgg gtcggtaauatggc⑶tcgatguaggagggcggacggguagtuagcgaggaatcggaguc⑶cguaguc⑶cguu atcg⑶ttuucg⑶tuaauucgguautuuc⑶tgutcutagtcucgutatcgutcucgcg⑶cguc⑶tgcgaau ucgggguuuutguac⑶ucg ggucgauutggguuutuautttuutcuuuutgtgg-3 ’SEQ ID NO 4所示的核苷酸序如下所示，它为SEQ ID NO 3中的未被甲基化的胞 嘧啶被修饰成尿嘧啶的相应序列(下划线标出的为未被甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶 区域)5， -atgaautuuatuttgatuttuaugug⑶uuugggtuttuttauuugguttg⑶uuugutuauu⑶gUUGUTUAUUGGUUUGTA⑶UUUUGGTG⑶UGUTCUUGAU⑶UTUGGGUUUAUUGAUUAUUATAUUGATUTUUATUI^ GUTUAGGUTUU⑶TTUAG⑶UGUGUU⑶TUGGUGUUUAGUTUUTUUTUUTU⑶UUGAUTUUGAGTUGUUUTUGUTCU U⑶TGTAGAGG⑶UUUU⑶GGTGGGUGUUGGGGTGGTTGUU⑶UGUTCUUGUAGUUTUUU⑶TUUAGGUG⑶UGGGU UUGAGUUUU ⑶⑶ UATTUUUGGGGAUUUG ⑶ UUUUGTTA ⑶ UUUGUGTGTUUU ⑶ UGUU ⑶ UGUUUG ⑶ UGUUUUGT UGGGGTUUGGTTUAGGUTCUUUUUUAGGGUUGAGUUUUGGUUUAGAGUU⑶UGUG⑶UUUA⑶TTGGGTUGGTAAUA TG ⑶⑶ TUGATGUAGGAGGGUGGAUGGGUAGTUAGUGAGGAATUGGAGUU ⑶ UGUA ⑶ UGUU ⑶ UATUG ⑶ TTUUUG GUTUAAU UUGGUAUTUUUGUTCUTGUTAGTGUU⑶TATU⑶TGUU⑶GGUU⑶UGUTCUGAAUUUGGG⑶UUUTCU AUGUUUGGGUUGAUUTGGGUUUTUAUTTTUUTGUUUUTGTGG-3’本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 5 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO 1中的接近5，-端的划线部分，也即SEQID NO 1中 的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID N0:1相同。但当该序列用于在检测血清反应因 子DNA序列的5’ -端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中时，其准确率更高。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 6 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO 2中的接近5，-端的划线部分，也即SEQID NO 2中 的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID N0:2相同。但当该序列用于在检测血清反应因 子DNA序列的5’ -端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中时，其准确率更高。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 7 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO 3中的接近3，-端的划线部分，也即SEQID NO 3中 的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO :5相同，并具有相同的效果。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 8 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO 4中的接近3，-端的划线部分，也即SEQID NO 4中 的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO :6相同，并具有相同的效果。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 9 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO :1中的接近3’-端的一个关键片段。该序列的作用 与SEQ ID NO :5相同，并具有相同的效果。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 10 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO :2中的接近3’-端的一个关键片段。该序列的作用 与SEQ ID NO :6相同，并具有相同的效果。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 11 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO :3中的接近5’-端的一个关键片段。该序列的作用 与SEQ ID NO :5相同，并具有相同的效果。本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO 12 所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO :4中的接近5’-的一个关键片段。该序列的作用与 SEQ ID NO :6相同，并具有相同的效果。上述SEQ ID NO :5_12所示的核苷酸序分别如下文所示。SEQ ID NO 5具有以下具体序列5 ’ -CGGUAUTAGUAGUAGCGGGAGTCUCGGGTTGAGUCGGGAAGUCGATGGCGGCG⑶TGCGGCGGUTU CGATTUUTC-3'SEQ ID NO 6具有以下具体序列
5， -UGGUAUTAGUAGUA⑶GGGAGTCUUGGGTTGAGUUGGGAAGUUGATGGUG⑶GGUTCUGGUG⑶TU UGATTUUTU ⑶-3'SEQ ID NO 7具有以下具体序列 5’ -CGAGGAATCGGAGUC⑶CGUA⑶CGUC⑶UATCGGUTTUUCGGUTUAAUUCGGUAUTUUC⑶TGUT ⑶TAGTCUCG-3'SEQ ID NO 8具有以下具体序列5 ’ -UGAGGAATUGGA⑶UGUUGUAGUUGUU⑶UATUGGUTTUUUGGUTUAAUUUGGUAUTUUUGUT ⑶TGUTAGTGUUG-3’SEQ ID NO 9具有以下具体序列5’ -CGGGAGGUTGCGGUAGCGGCGGUAAUUAUUUCGGCGUUUAUCGCGGGG⑶UUTUTAUAGCGGUAGC GAGGGCGAUTCGGAGTCGGGCGAGGAGGAGGA ⑶ TGGGCGUCGAGCGGCGCG ⑶ UTGAAGCGGA ⑶ UTGAGCG-3’SEQ ID NO 10具有以下具体序列5 ’ -UGGGAGGUTCUGGUAGUG⑶GGUAAUUAUUUUGGUGUUUAUU⑶GGGG⑶UUTUTAUA⑶GGUA⑶ GAGG⑶GAUTUGGAGTUGG⑶GAGGAGGAGGA⑶TGGGUGUUGA⑶GGUGUG⑶UTGAAGUGGA⑶UTGA⑶G-3’SEQ ID NO 11具有以下具体序列5 ’ -CGUTUAGGUTUC⑶TTUAG⑶CGCGUC⑶TCGGCGUUUAGUTUUTUUTUUTC⑶UCGAUTUCGAGT C⑶UUTC⑶TGUC⑶TGTAGAGG⑶UUUCGCGGTGGGCGUCGGGGTGGTTGUC⑶CGUTCUCGUA⑶UTUUCG-3'SEQ ID NO :12具有以下具体序列5 ’ -UGUTUAGGUTUU⑶TTUAG⑶UGUGUU⑶TUGGUGUUUAGUTUUTUUTUUTU⑶UUGAUTUUGAGT U⑶UUTU⑶TGUU⑶TGTAGAGG⑶UUUU⑶GGTGGGUGUUGGGGTGGTTGUU⑶UGUTCUUGUA⑶UTUUUG-3'实施例实施例1 通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力1、实验对象102对胃癌及其手术切缘配对冷冻组织，其中50%的患者存在淋巴 结转移灶和脉管癌栓(或远处转移灶)，50%的配对患者胃癌组织既无淋巴结转移也未见 脉管癌栓(或远处转移灶)，均有完整的临床病理资料和随访资料；2、获取组织细胞从上述手术切缘组织的不同部位切取米粒体积大小(15 20mm3)的5块冷冻组织，收集到硅化的微型离心管(1.5ml)中；3、提取细胞DNA 向上述离心馆中加入300 μ 1组织细胞裂解液(含IOmMTris. Cl/ ρΗ 7. 6、IOmM NaClUOmM EDTA 和 0. 5% SDS)，再加入蛋白酶 K 10 μ 1 (20mg/ml)，37°C过夜 消化，酚氯仿抽提DNA约IOyg ；4、化学修饰未甲基化胞嘧啶1)用18 μ 1去离子蒸馏水将约1 μ g上述DNA溶解于1. 5ml EP管中；95°C水浴变 性20min,冰浴；2)力口 2 μ 1新鲜配制的3Μ NaOH,混勻，42°C水浴20min，以使DNA变性解链；3)各管加入新鲜配置的5. OM NaHSO3 380 μ 1，混勻，再加入200 μ 1液体石蜡阻止 管内液体蒸发，置50°C 55°C水浴中过夜修饰(12-1 )，未甲基化胞嘧啶修饰为尿嘧啶；4)吸去顶层液体石蜡，用 DNA纯化试剂盒(Promega Wizard DNA Clean-UpSystem， A7280)，按说明书所示提取修饰后DNA 加入混勻的树脂1ml，混勻后静置5分钟；将树脂-DNA混合物转移至下接微柱的注射管内，抽真空法滤去液相，并将DNA等固相转移到微 柱滤膜上；加入80%异丙醇anl，抽真空；弃注射管，将微柱套入1. 5ml离心管上，高速离心 (10000g20秒)去除柱内残留液体；将微柱转移至新离心管上，向微柱内加入80°C无菌三蒸 水50μ1，静置15分钟，高速离心(IOOOOg 20秒)，收集洗脱液；再向微柱内加入80°C无菌 三蒸水50μ1，静置15分钟，高速离心(IOOOOg 20秒)，合并洗脱液；5)向各管加入3Μ NaOH 11 μ 1，混勻，37°C温浴15分钟，以终止修饰反应；6)向各管加入5M醋酸铵166 μ 1，100%冰乙醇750 μ 1，混勻，_20°C沉淀4小时， IOOOOg离心30分钟，弃上清；向各管加入200 μ 1 80%冰乙醇，混勻，再离心，弃上清；7)干燥后用60 μ 1无菌三蒸水溶解修饰纯化后样品DNA，_20°C保存备用；5、PCR引物对的设计根据SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序，设 计、合成不含CpG位点的通用型PCR引物对。根据SEQ ID NO :1设计的引物对的上游引物 5，-gttataggggtaggaaagtgag-3，；下游弓丨物 5，-ataaactccatctta atcttcac-3，；6、PCR扩增采用步骤5所设计的引物对步骤4中所获得的DNA样品进行热启动 PCR扩增。其中PCR扩增扩增条件是95°C保持15分钟；然后进行40个以下的循环95°C 保持30秒，58°C保持30秒，72°C保持1分钟；最后在72°C保持10分钟。7、然后利用变性高效液相色谱(DHPLC，Transgenomic, Inc.，0M, USA)测定是否存 在5’ -端甲基化CpG岛特异性的SRF DNA序列色谱峰(图1C)，克隆测序法验证甲基化胞 嘧啶位点的存在(图3)；8、结果在51例转移性胃癌切缘组织中只有4例(7. 8% )存在SRF甲基化，而51例非 转移性胃癌切缘组织中有16例(31. 4% )存在SRF甲基化，差异存在统计学显著性(p = 0. 003)。在30例胃癌 Μ分期为T4期的胃癌切缘组织中只有1例存在SRF甲基化，而72 例IV3的切缘组织中有19例存在SRF甲基化(p = 0. 014)；切缘组织SRF甲基化阳性者手术后总生存率明显高于甲基化阴性者，中位生存时 间分别为32个月和23个月，在单因素和多因素分析中差异有统计学显著性(p = 0. 006和 0. 040 ；图 2)。9、结论胃癌手术切缘组织中甲基化SRF CpG岛序列是一种能够用来测定胃癌侵 袭和转移能力的标志物。实施例2 通过测定是否存在甲状腺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞 嘧啶的甲基化预测甲状腺癌侵袭和转移能力1、实验对象20对甲状腺癌冷冻组织，其中50%的患者存在淋巴结转移灶和脉管 癌栓(或远处转移灶)，50%的配对患者组织既无淋巴结转移也未见脉管癌栓(或远处转移 灶)，均有完整的临床病理资料和随访资料；2、步骤2-7与实施例1相同；3、结果(图4)和结论与实施例1相同。实施例3 通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力步骤1-5与实施例1相同；在步骤6中除了测定是否存在5’ -端CpG岛中甲基化的血清反应因子基因DNA序列外，其余与实施例1中的步骤6 相同；测得的结果的特异性高于实施例1，为100%。实施例4 通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化存在预测胃癌侵袭和转移能力步骤1-4与实施例1相同；5、PCR引物对的设计上游引物为5，-atgaattttattttgattttta-3，，下游引物为 5 — 3 ；6、PCR扩增采用步骤5所设计的引物对步骤4中所获得的DNA样品进行热启动 PCR扩增。其中PCR扩增扩增条件是95°C保持15分钟；然后进行40个以下的循环95°C 保持30秒，54°C保持30秒，72°C保持1分钟；最后在72°C保持10分钟。7、结果和结论与实施例1相同。实施例5 通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力步骤1-4与实施例1相同；5、PCR引物对的设计胞嘧啶甲基化特异性引物对的上游引物为 5，-ggtattagtagtagcgggagtgtc-3，，下游弓 I物为 5，-ccaacttaaatcgataaca taacg-3，；采用步骤5所设计的引物对步骤4中所获得的DNA样品进行热启动PCR扩增。其 中PCR扩增扩增条件是95°C保持15分钟；然后进行40个以下的循环95°C保持30秒， 57°C保持30秒，72°C保持30秒；最后在72°C保持10分钟。7、结果和结论与实施例1相同。实施例6 通过测定是否存在口腔癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧 啶的甲基化预测口腔癌侵袭和转移能力用口腔鳞癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实 验，得到的结果如图5所示。实施例7 通过测定是否存在胰腺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧 啶的甲基化预测胰腺癌侵袭和转移能力用胰腺癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实 验，得到相似的结果。实施例8 通过测定是否存在结肠癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧 啶的甲基化预测结肠癌侵袭和转移能力用结肠癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实 验，得到相似的结果。实施例9 通过测定是否存在乳腺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧 啶的甲基化预测乳腺癌侵袭和转移能力用乳腺癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实 验，得到相似的结果。实施例10 通过测定是否存在肝癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化预测肝癌侵袭和转移能力用肝癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到相似的结果。实施例11 通过测定是否存在肺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化预测肺癌侵袭和转移能力用肺癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验， 得到相似的结果。实施例12 通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶 的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力步骤1-6与实施例1相同；7、直接采用克隆测序法对步骤6所获得的PCR产物进行克隆测序，每个样品测定 至少10个克隆，测定是否存在5’ -端CpG岛中关键性区域甲基化胞嘧啶的SRFDNA序列的 克隆；步骤8-9与实施例1相同。序列表<110>北京市肿瘤防治研究所<120>体外预测肿瘤转移和侵袭能力的方法及核苷酸片段<160>13<210>1<211>647<212>DNA<213>人工序列<400>1GUUAUAGGGGUAGGAMGTGAGGGUUUAGGTCGGUUCGGGCGTGUAGGGGUUUCGGGTTC60
GUAGCGGCGGUCGCGGUAGCGATAGCGGUAUTAGUAGUAGCGGGAGTGUCGGGTTGAGUC120
GGGMGUCGATGGCGGCGGUTGCGGCG⑶TUCGATTUUTCGUTGAUTGUUCGTUC⑶UUT180
UUTGUATCGAGC⑶UATGTTAUCGAUUUMGUTGGGGUCGCGGCG⑶TUTGGGUCGGGGU240
TCG⑶UUTGGGGGGUAGUUTGMUCGGAUUUCGACGGGGCGGUCGGGCGGCGGCGGCGGG300
AUACGCGGGGUTMCGGGGGUCGGGTUUUCGGGMTGGCGCGGG⑶TCGGGUUCGGUCGU360
UTGGAGCGGGAGGUTGCGGUAGCGGCGGUAAUUAUUUCGGCGUUUAUCGCGGGGGUUUTU420
TAUAGCGGUAGCGAGGGCGAUTCGGAGTCGGGCGAGGAGGAGGAGUTGGGCGUCGAGCGG480
CGCGGUUTGAAGCGGAGUUTGAGCGAGATGGAGATCGGTATGGTGGTCGGTGGGUUCGAG540
GCGTCGGUAGCGGUUAUCGGGGGUTACGGGUCGGTGAGCGGCGCGGTGAGCGGGGUUMG600
UCGGGTMGAAGAUUCGGGGUCGCGTGMGATUMGATGGAGTTUAT647<210>2<211>647<212>DNA<213>人工序列<400>2GUUAUAGGGG UAGGAMGTGGUAGUGGUGG UUGUGGUAGU
AGGGUUUAGG GATAGUGGUA
TUGGUUUGGG UTAGUAGUAG
UGTGUAGGGG UGGGAGTGUU
UUUUGGGTTU GGGTTGAGUU
60 120
GGGMGUUGATGGUGGUGGUTGUGGUGGUTUUGATTUUTUGUTGAUTGUUUGTUUGUUUT180
UUTGUATUGAGUGUUATGTTAUUGAUUUMGUTGGGGUUGUGGUGGUTUTGGGUUGGGGU240
TUGGUUUTGGGGGGUAGUUTGMUUGGAUUUUGAUGGGGUGGUUGGGUGGUGGUGGUGGG300
AUAUGUGGGGUTMUGGGGGUUGGGTUUUUGGGMTGGUGUGGGGUTUGGGUUUGGUUGU360
UTGGAGUGGGAGGUTGUGGUAGUGGUGGUAAUUAUUUUGGUGUUUAUUGUGGGGGUUUTU420
TAUAGUGGUAGUGAGGGUGAUTUGGAGTUGGGUGAGGAGGAGGAGUTGGGUGUUGAGUGG480
UGUGGUUTGAAGUGGAGUUTGAGUGAGATGGAGATUGGTATGGTGGTUGGTGGGUUUGAG540
GUGTUGGUAGUGGUUAUUGGGGGUTAUGGGUUGGTGAGUGGUGUGGTGAGUGGGGUUMG600
UUGGGTMGAAGAUUUGGGGUUGUGTGMGATUMGATGGAGTTUAT647
<210>3
<211>647
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ATGMUTUUATUTTGATUTTUACGCGGUUUCGGGTUTTUTTAUUCG⑶TTGGUUUCGUTU60
AUCGCGUCGUTUAUCGGUUCGTAGUUUUCGGTGGUCGUTGUCGACGUUTCGGGUUUAUCG120
AUUAUUATAUCGATUTUUATUTC⑶TUAGGUTUC⑶TTUAGGUCGCGUCGUTCGGC⑶UU180
A⑶TUUTUUTUUTCGUUCGAUTUCGAGTCGUUUTC⑶ TCUCGUTGTAGAGGGUUUUCGCG240
GTGGGC⑶CGGGGTGGTTGUCGUCGUTGUCGUAGUUTUUCGUTUUAGGCGGUCGGGUUCG300
AGUUUCGCGUUATTUUCGGGGAUUCGGUUUUCGTTAGUUUCGCGTGTUUCGUCGUCGUCG360
UUCGGUCGUUUCGTCGGGGTUCGGTTUAGGUTGUUUUUUAGGGUCGAGUUUCGGUUUAGA420
GUCGUCGCGGUUUUAGUTTGGGTCGGTMUATGGC⑶TCGATGUAGGAGGGCGGACGGGU480
AGTUAGCGAGGMTCGGAGUCGUCGUAGUCGUCGUUATCG⑶TTUUCG⑶TUMUUCGGU540
AUTUUCGUTGUTGUTAGTGUCGUTATCGUTGUCGCGGUCGUC ⑶ TGCGMUUCGGGGUUU600
UTGUACGUUCGGGUCGAUUTGGGUUUTUAUTTTUUTGUUUUTGTGGU647
<210>4
<211>647
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ATGMUTUUATUTTGATUTTUAUGUGGUUUUGGGTUTTUTTAUUUGGUTTGGUUUUGUTU60
AUUGUGUUGUTUAUUGGUUUGTAGUUUUUGGTGGUUGUTGUUGAUGUUTUGGGUUUAUUG120
AUUAUUATAUUGATUTUUATUTUGUTUAGGUTUU⑶TTUAGGUUGUGUUGUTUGGUGUUU180
A⑶TUUTUUTUUTUGUUUGAUTUUGAGTUGUUUTU⑶ TCUU⑶TGTAGAGGGUUUUUGUG240
GTGGGUGUUGGGGTGGTTGUUGUUGUTGUUGUAGUUTUUUGUTUUAGGUGGUUGGGUUUG300
AGUUUUGUGUUATTUUUGGGGAUUUGGUUUUUGTTAGUUUU⑶GTGTUUUGUUGUUGUUG360
UUUGGUUGUUUUGTUGGGGTUUGGTTUAGGUTGUUUUUUAGGGUUGAGUUUUGGUUUAGA420
GUUGUUGUGGUUUUAGUTTGGGTUGGTMUATGGUGUTUGATGUAGGAGGGUGGAUGGGU480
AGTUAGUGAGGMTUGGAGUUGUUGUAGUUGUUGUUATUGGUTTUUUGGUTUMUUUGGU540
AUTUUU⑶TG UTGUTAGTGUUGUTATUGUT GUUGUGGUUG UUGUTGUGM UUUGGGGUUU600
UTGUAUGUUU GGGUUGAUUTGG⑶UUTUAU TTTUUTGUUU UTGTG⑶647
<210>5
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
CGGUAUTAGU AGUAGCGGGAGTGUCGGGTT GA⑶CGGGM GUCGATGGCG GCG⑶TGCGG60
CG⑶TUCGAT TUUTCG76
<210>6
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
UGGUAUTAGU AGUAGUGGGAGTGUUGGGTT GAGUUGGGM GUUGATGGUG GUGGUTGUGG60
UG⑶TUUGAT TUUTUG76
<210>7
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
CGAGGMTCG GAGUCGUCGUAGUCGUCGUU ATCG⑶TTUU CG⑶TUMUU CGGUAUTUUC60
GUTGUTGUTA GTGUCG76
<210>8
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
UGAGGMTUG GAGUUGUUGUAGUUGUUGUU ATUG⑶TTUU UGGUTUMUU UGGUAUTUUU60
GUTGUTGUTA GTGUUG76
<210>9
<211>139
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
CGGGAG⑶TG CGGUAGCGGCGGUMUUAUU UCGGCGUUUA UCGCGGGGGU UUTUTAUAGC60
GGUAGCGAGG GCGAUTCGGAGTCGGGCGAG GAGGAGGAGU TGGGCGUCGA GCGGCGCGGU120
UTGMGCGGA GUUTGAGCG139
<210>10
<211>139
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
UGGGAGGUTGUGGUAGUGGUGGUMUUAUUUUGGUGUUUAUUGUGGGGGUUUTUTAUAGU60
GGUAGUGAGGGUGAUTUGGAGTUGGGUGAGGAGGAGGAGUTGGGUGUUGAGUGGUGUGGU120
UTGMGUGGAGUUTGAGUG139
<210>11
<211>139
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
CGUTUAGGUTUCGUTTUAGGUCGCGUCGUTCGGCGUUUAGUTUUTUUTUUTCGUUCGAUT60
UCGAGTCGUUUTC⑶ TCUCGUTGTAGAGGGUUUUCGCGGTGGGCGUCGGGGTGGTTGUCG120
UCGUTGUCGUA⑶UTUUCG139
<210>12
<211>139
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
UGUTUAGGUTUUGUTTUAGGUUGUGUUGUTUGGUGUUUAGUTUUTUUTUUTUGUUUGAUT60
UUGAGTUGUUUTU⑶ TCUUGUTGTAGAGGGUUUUUGUGGTGGGUGUUGGGGTGGTTGUUG120
UUGUTGUUGUAGUUTUUUG139
<210>13
<211>647
<212>DNA
<213>天然序列
<400>13
GCCACAGGGGCAGGAMGTGAGGGCCCAGGTCGGCCCGGGCGTGCAGGGGCCCCGGGTTC60
GCAGCGGCGGCCGCGGCAGCGATAGCGGCACTAGCAGCAGCGGGAGTGCCGGGTTGAGCC120
GGGMGCCGATGGCGGCGGCTGCGGCGGCTCCGATTCCTCGCTGACTGCCCGTCCGCCCT180
CCTGCATCGAGCGCCATGTTACCGACCCMGCTGGGGCCGCGGCGGCTCTGGGCCGGGGC240
TCGGCCCTGGGGGGCAGCCTGMCCGGACCCCGACGGGGCGGCCGGGCGGCGGCGGCGGG300
ACACGCGGGGCTMCGGGGGCCGGGTCCCCGGGMTGGCGCGGGGCTCGGGCCCGGCCGC360
CTGGAGCGGGAGGCTGCGGCAGCGGCGGCAACCACCCCGGCGCCCACCGCGGGGGCCCTC420
TACAGCGGCAGCGAGGGCGACTCGGAGTCGGGCGAGGAGGAGGAGCTGGGCGCCGAGCGG480
CGCGGCCTGAAGCGGAGCCTGAGCGAGATGGAGATCGGTATGGTGGTCGGTGGGCCCGAG540
GCGTCGGCAGCGGCCACCGGGGGCTACGGGCCGGTGAGCGGCGCGGTGAGCGGGGCCMG600
CCGGGTMGAAGACCCGGGGCCGCGTGMGATCMGATGGAGTTCAT64权利要求
1.一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)从手术切缘或癌旁活检组织中提取DNA;b)检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’-端CpG岛中胞嘧啶 的甲基化程度；c)当步骤b)中测得存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列 时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤b)中检测步骤a)中所获得的DNA中血清 反应因子基因DNA序列5’ -端的86-161位中的CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度或者在步骤 b)中检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5，-端的367-505位中的 CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的 检测是通过以下步骤实现的1)通过化学修饰方法将步骤a)中所获得的DNA中未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶， 获得含有甲基化的胞嘧啶的DNA和不含有胞嘧啶和甲基化胞嘧啶的DNA的混合物；2)根据SEQID NO :1所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列设 计的引物对对步骤1)所获得的混合物进行PCR扩增；3)通过变性高效液相色谱法或测序法测定是否存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的 血清反应因子DNA片段；或者步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是通过以下步骤实现的1)将步骤a)中所获的DNA超声碎裂或酶切裂解成200bp左右大小的片段；2)用甲基化DNA结合蛋白或者5-甲基胞嘧啶抗体富集甲基化DNA的方法，富集步骤 1)中的甲基化DNA;3)以步骤2)所获DNA为模板，利用根据SEQID NO 1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列设计的对胞嘧啶甲基化特异性的引物对进行PCR扩增，如果能够扩增 出血清反应因子基因DNA的5’ -端片段，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者将步 骤2)所获DNA直接进行序列测定，如果能够检测到血清反应因子基因DNA的5’-端片段的 存在，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者将步骤幻所获DNA进行标记，然后与能与 血清反应因子基因DNA的5’-端片段结合的探针进行杂交，如果能够检测到杂交信号，则存 在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是通过以下步骤实现的将步骤a)所获DNA利用甲基化敏感酶进行酶切消化，然后与带标记的能与血清反应因 子基因DNA的5’-端片段结合的DNA探针杂交，如果能够检测到杂交信号，则存在所述CpG 岛中胞嘧啶的甲基化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述根据SEQID NO :1所示的核苷酸序列或者根 据SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列设计的引物对为通用引物对，且该引物对的上游引物为 5，-gttataggggtaggaaagtgag-3，，下游弓I物为 5，_ataaactccatcttaatcttcac_3，；或者上 游弓丨物为5，-atgaattttattttgattttta-3，，下游弓丨物为5，
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述根据SEQID NO :1所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列设计的引物对为胞嘧啶甲基化特异性的引物对，且胞 嘧啶甲基化特异性的引物对的上游引物为5，-ggtattagtagtagCgggagtgtC-3，，下游引物为 5' -ccaacttaaatcgataacataacg-3‘；。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，当步骤b)中所测得存在5’-端片段的CpG岛中 甲基化胞嘧啶的数目大于或等于4的血清反应因子DNA序列时，则推定被测组织具有抵抗 恶性肿瘤侵袭和转移能力。
7.—种人工核苷酸片段，其特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO :5所示的核 苷酸序，或者具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序。
8.—种人工核苷酸片段，其特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO :7所示的核 苷酸序，或者具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序。
9.一种人工核苷酸片段，其特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO :9所示的核 苷酸序，或者具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序。
10.一种人工核苷酸片段，其特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID N0:11所示的 核苷酸序，或者具有SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序。
全文摘要
本发明通过了一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其中，该方法包括以下步骤a)从手术切缘或癌旁组织中提取DNA；b)检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’-端CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度；c)当步骤b)中测得存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。另一方面，本发明还提供了四种人工核苷酸片段。本发明的发明人首次发现通过检测组织中是否存在CpG岛中的甲基化胞嘧啶的血清反应因子核苷酸序列以快速并准确地预测恶性肿瘤的侵袭和转移的能力。此外，本发明提供的人工核苷酸片段可以用于准确快速检测血清反应因子核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化。
文档编号C12N15/11GK102140498SQ201010111138
公开日2011年8月3日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者刘兆君, 邓大君 申请人:北京市肿瘤防治研究所