专利名称：一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆异黄酮的制备方法，尤其是公开了一种利用乳酸乳球菌工程
菌发酵生产大豆异黄酮的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
大豆异黄酮的英文名是Soybean Isoflavones它是从天然植物大豆中提取的一种生物活性物质，主要分布在大豆种皮、胚轴、子叶中。是一类具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，大豆异黄酮具有多种生理功能，不仅参与调节植物的生长活动，还能对人体发挥有益的生理调节作用。近几年研究发现大豆异黄酮对多种疾病包括肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗起着重要的作用。现在已知的异黄酮有12种。可分为三类染料木黄酮(genistein)、黄豆苷元(daidzein)、黄豆黄素(glycitein)，以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在，以异黄酮葡萄糖苷和丙二酰基异黄酮葡萄糖苷为主要形式，共占异黄酮总量的95% -98% ;而游离型异黄酮(苷元)的含量很低。大豆异黄酮的苷元形式要比糖苷形式活性要高，特别是染料木黄酮的活性更高。染料木黄酮是大豆异常黄酮中的主要活性因子，因此，染料木黄酮是衡量大豆异黄酮产品中最有效的功能成分，作为检测大豆异黄酮的含量标准。
目前，工业上生产大豆异黄酮主要是以大豆作为原料提取，由于大豆异黄酮的市场潜力越来越大，而自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，在含量最高的大豆中所含的大豆异黄酮也仅为0. 1% _0.5%，很大程度的限制了大豆异黄酮的市场开发，也很难满足日益增大的市场需求。
明内容 本发明提供一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，解决了以大豆作为原料提取异黄酮方法其异黄酮含量低的缺欠。 本发明还提供了一种食品级乳酸乳球菌工程菌菌株，用于发酵生产大豆异黄酮。
本发明利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，包括以下步骤 1)设计引物根据GenBank已发表的大豆异黄酮合成酶基因IFS1的DNA序列，应用
PrimerPremier5. 0设计引物引物如下(斜体部分为加入的酶切位点) 上游引物5' TT ACTAGT ATGTTGCTTGAACTTGCACTTGGTTTG 3' (Spel) 下游引物5' TT TCTAGA TTAAGAAAGGAGTTTAGATGCAACGCCG 3' (Xbal) 2)提取大豆吉农17的总RNA，反转录成CDNA ; 3)扩增大豆异黄酮合成酶基因IFS1，构建重组克隆载体pMD18-T-IFSl并进行鉴定； 4)构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFSl，利用电穿孔方法将重组表达载体pNZ8149-IFSl转入到乳酸乳球菌NZ3900中，获得重组乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl并进行鉴定； 5)提取乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl的粗蛋白，利用SDS-PAGE方法对乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl进行蛋白检测； 6)以大豆异黄酮之一染料木黄酮作为标准品，利用高效液相方法检测工程菌发酵 生产大豆异黄酮 利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl发酵柚皮素产生大豆异黄酮；也可 以应用含有柚皮素的自然添加物作为底物利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl 发酵生产大豆异黄酮。 本发明涉及的乳酸乳球菌工程菌，是通过以下方法得到的 构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFSl，利用电穿孔方法将重组表 达载体pNZ8149-IFSl转入到乳酸乳球菌NZ3900即得。 本发明克隆的大豆异黄酮合成酶基因IFS1，来源于大豆吉农17CDNA。是大豆异黄 酮合成途径中的关键酶，属于I型大豆异黄酮成酶基因，在代谢途径中大豆异黄酮合成酶 利用柚皮素(Naringenin)特异的催化产生大豆异黄酮的重要活性成分染料木黄酮。
本发明选用NICE(NISIN controlled gene expression system)表达系统，本发 明选用的NZ3900/pNZ8149是近年来国际上先进的乳酸乳球菌食品级表达系统。
本发明所提供的大豆异黄酮合成酶基因的表达的方法，是培养重组乳酸乳球菌工 程菌时，需加入NISIN诱导物，可以使大豆异黄酮合成酶基因分泌表达，重组乳酸乳球菌表 达的时间为3-6天。 本发明提供了一种自然添加物作为大豆异黄酮合成酶催化的底物进行发酵生产 大豆异黄酮。
本发明具有以下优点 利用工程菌发酵底物产生异黄酮为大豆异黄酮的来源提供了新的途径，而且克服 了传统大豆异黄酮工业受含量低和大豆原料本身的熟期限制。本发明所用的乳酸乳球菌为 安全的食品级微生物，质粒pNZ8149以LacF基因取代了常用的抗生素抗性基因作为筛选标 记，其宿主菌乳酸乳球菌NZ3900已删除lacF基因，避免了抗生素抗性基因的水平转移，更 加安全，符合临床应用要求，为将来工业开发利用工程菌代谢生产异黄酮开辟了应用前景。
本发明通过乳酸乳球菌发酵获得植物的次生代谢产物 一 大豆异黄酮中的大豆异 黄酮，大豆异黄酮作为豆科植物的一种次级代谢产物，从苯丙氨酸到异黄酮物质，要经过多 个反应步骤，多个酶的参与，研究发现异黄酮合成酶是生成异黄酮的关键酶之一，它的产生 是一个很复杂的催化过程。最后利用一种自然添加物作为底物的优点在于它本身含有的柚 皮素可以经过工程菌发酵作用产生大豆异黄酮。 发明应用于工业化大豆异黄酮的生产，则具有生产规模大，大豆异黄酮活性高，产 酶能力强，生长周期短，底物成本低的优点。
图1为乳酸乳球菌表达载体pNZ8149的物理图谱。 图2为含有大豆异黄酮合成酶IFS1基因的重组乳酸乳球菌表达载体构建流程图。
图3为大豆提取的总RNA的电泳图片。
图4为RT-PCR法扩增IFS1基因的结果； 1、 RT-PCR扩增IFS1的目的条带；2、水样阴性对照；3、2000bp DNAmarker。
图5为重组克隆载体pMD18-T-IFSl的PCR鉴定； 1、重组克隆载体上鉴定IFS1目的条带；2、2000bp DNA marker。 图6为36小时筛选板上生长的乳酸乳球菌转化子。 图7为重组乳酸乳球菌表达载体NZ3900/pNZ8149-IFSl的PCR鉴定； 1、pNZ8149-IFSl表达载体的PCR产物；2、2000DNA marker。 图8为重组乳酸乳球菌表达载体NZ3900/pNZ8149-IFSl的酶切鉴定； 1、pNZ8149-IFSl表达载体的酶切产物；2、2000DNAmarker。 图9为乳酸乳球菌株NZ3900、 NZ3900/pNZ8149及重组乳酸乳球菌株NZ3900/ pNZ8149-IFS 1表达产物的SDS-PAGE分析； 1、 NZ3900 ;2、 NZ3900/pNZ8149 ;3、 NZ3900/pNZ8 149-IFS1 、 4 、 protein molec li larweight marke:r。 图10为NZ3900/pNZ8149-IFSl诱导前后的SDS-PAGE蛋白检测结果； 1、 NZ3900/pNZ8149-IFSl未进行NISIN诱导的蛋白检测结果；2、 NZ3900/
pNZ8149-IFSl进行NISIN诱导后的蛋白检测结果。 图11为大豆异黄酮标准品的HPLC检测结果。 图12为对照品1 (以NZ3900菌株发酵柚皮素)的HPLC检测结果。 图13为对照品2 (以携有载体pNZ8149的NZ3900/pNZ8149菌株发酵柚皮素)的
HPLC检测结果。 图14为样品(乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl发酵柚皮素)的HPLC检 测结果。 图15为大豆异黄酮标准品的HPLC检测结果(自然添加物)。 图16为对照I (NZ3900菌株发酵自然添加物底物)的HPLC检测结果。 图17为样品(乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl发酵自然添加物底物)
的HPLC检测结果。
具体实施例方式下述结合附图，对依据本发明提供的具体实施方式
、特征及功效，详尽说明如后
从克隆基因到将携目的基因的表达载体转入到乳酸乳球菌中，最后实现表达，实施例中所
用方法如无特别说明均为常规方法。 本发明实验中使用和涉及的培养基的配制 1、LB培养基 取蛋白胨IO. 0g、酵母粉5g、NaCl 10g加蒸馏水定容至1000ml，用NaOH调节ffl值 至7. 6-7. 8，分装，12rC高压灭菌20min，4t:储存备用，固体培养基添加1. 8%琼脂。
2、乳酸乳球菌培养基1 取胰蛋白胨20. 0g、酵母粉5. 0g、氯化钠4. Og、醋酸钠1. 5g、抗坏血酸0. 5g，定容至 1L蒸馏水中ra 7. 0，加15g琼脂粉/L培养液108°C ，高压灭菌20min，使用前，冷却后加入 终浓度0. 5%的乳糖和0. 004%溴甲酚紫。
3 、乳酸乳球菌培养基2 取胰蛋白胨5. Og、大豆蛋白胨5. Og、酵母粉5. Og、牛肉膏2. 5g、 P -磷酸甘油二钠19. 0g、抗坏血酸0. 5g、七水硫酸镁0. 25g、葡萄糖5g，定容至1000毫升蒸馏水中，pH7. 0，
108°C，20min高压灭菌。 4、乳酸乳球菌培养基3 取胰蛋白胨5. 0g、大豆蛋白胨5. 0g、酵母粉5. 0g、牛肉膏2. 5g、磷酸氢二钠13g、抗
坏血酸0. 5g、七水硫酸镁0. 25g、乳糖5g，定容至1000毫升蒸馏水中，pH7. 0， 108°C， 20min
高压灭菌。 实施例1、 1、引物设计 根据GenBank已发表的大豆异黄酮合成酶基因IFS1 (GenBank的登录号为 AF195798. 1)的DNA序列，应用PrimerPremier5. 0引物设计软件分别设计一对特异性引物， 为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物和下游引物的5'端分别加入限制性内切酶位 点和保护碱基(斜体部分为加入的酶切位点)IFS1 上游引物5' TT ACTAGT ATGTTGCTTGAACTTGCACTTGGTTTG 3' (Spel)
下游引物5' TT TCTAGA TTAAGAAAGGAGTTTAGATGCAACGCCG 3' (Xbal)
2、大豆吉农17总RNA的提取，反转录成CDNA :
大豆吉农17培养2周 1)用大量水冲洗植株，后用蒸馏水浸泡3-4小时。 2)将经高压灭菌后的研钵在研磨之前用液氮充分预冷，取整株植物材料放入装有 液氮的研钵中充分预冷，充分研磨成粉末放到装有lmL RNAiso Reagent的离心管中，立即 放到漩涡震荡器上充分混匀，室温静置5min。按照大连宝生物公司的RNA提取试剂盒说明 书所述步骤进行提取RNA。利用DNA酶除去DNA污染。 3)反转录成cDNA(20iU反应体系)在微量离心管中依次加入下列各种成 分TotalRNA 4ii 1， AMVRT5 X buf f e由1， dNTP4 ii 1， RnasinRibo匿lease Inlubitor 0. 5ii 1， 01ig-dt2ii 1， AMV-RT1. Oii 1， ddH20 4. 5iU。然后将微量离心管放入孵育器中 42°C 1小时，再在85。C水浴放置10min。加入180 y 1DEPC处理过的ddH20至200 yl， -20
保存备用。 4)抽取21!1进行1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度，结果如图3所示(泳道1和2为 大豆总RNA)。有图可以看出，所提的大豆吉农17总RNA为三条带，满足下步实验进行基因 扩增的要求。 3、扩增大豆异黄酮合成酶基因IFS1，构建重组克隆载体pMD18-T-IFSl并进行鉴 定 l)扩增目的基因IFSl 以大豆吉农17的cDNA为模板，通过PCR扩增大豆异黄酮合成酶基因的DNA片段。 反应体系25 ii 1 ;d證Mixture (各10m M) 0. 5 ii 1 ;Sense primer (50pmol/L) 1 ii 1 ;ANT primer (50pmol/L) 1 ii 1 ;cDNA 4 ii 1 ;MgCL22 ii 1 ;硫酸铵2 ii 1 ;Taq酶(5u/ ii 1) 0. 25 ii 1 ;灭 菌ddH20 up to 25 ii 1 ; 反应条件35cycles ;94。C预变性5min ;94。C变性45sec ;53。C退火45sec ;72。C延 伸lminlOsec ;72。C延伸10min。 PCR反应结束后，全量反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，结果见说明
6书附图图4为IFS1基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为水样对照，泳道3为 DNA分子量标准)泳道1在1566bp处有一条清晰条带，而泳道2无条带，扩增基因的结果与 预期结果相符。 2)重组克隆载体pMD18-T-IFSl的构建及鉴定 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit回收目的片断。将回收的目的片段分别克隆到pMD18-T Vector,进行蓝白斑筛选。在 E卯endorf管内配制10 y 1反应体系，混匀16。C反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5 a 感受态细胞，用含50mg/mlAmp+的LB抗性平板37。C培养过夜进行筛选。挑取阳性菌落提取 质粒。以重组质粒DNA为模板，分别PCR扩增大豆异黄酮合成酶基因，反应体系和反应条件 同上，反应结束后，对PCR产物进行1% Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果如 图所示图5为IFS1基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳 道1在1566bp处有一条清晰条带，IFS1基因的PCR结果与预期结果相符，初步证明克隆载 体构建成功。 将PCR鉴定都正确的重组克隆载体分别命名为pMD18-T-IFSl，然后将保存的菌 液送去测序，测序由北京三博远公司完成。IFS1与Genebank AF195798. 1大豆异黄酮合成 酶IFSl基因的mRNA同源性达99% ，表明所克隆的基因正确，达到预期目的。
4、构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFSl，利用电穿孔方法将重组 表达载体pNZ8149-IFSl转入到乳酸乳球菌NZ3900中，获得重组乳酸乳球菌工程菌NZ3900/ pNZ8149-IFSl并进行鉴定； 含有目的基因的重组乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-IFSl的构建过程如图2所示， 具体步骤如下 1)重组表达载体pNZ8149-IFSl的构建 碱裂解法大量提取重组克隆载体pMD18-T-IFSl和表达载体pNZ8149 (本实验 室保存)质粒DNA，然后分别双酶切重组克隆载体pMD18-T-IFSl和乳酸乳球菌表达载体 pNZ8149。 pMD18-T-IFSl和pNZ8149用限制内切酶Xbal和Spel双酶切，37。C酶切3h。反 应结束后，全量反应液于1 %的琼脂糖凝胶电泳，分别回收DNA。最后分别用T4DNA连接酶 连接目的片段和载体，反应体系10 y 1，混匀，16t:反应16h。
2)电穿孔转化法 (1)利用乳酸乳球菌感受态细胞常规的准备方法制备乳酸乳球菌NZ3900的感受 态细胞； (2)用BIO-RAD MicroPluser进行电击，将预转化的质粒DNA(约1 y g)加入到
200 ii 1感受态细胞中，混均。将MicroPluser设为"EC1"。将DNA细胞样品转入0. 2cm已
预冷的电击杯中，轻轻敲打管底悬浮液，2kv，25iiF，200Q，4.48ms电击一次。将杯拿出，加
入冰冷的乳酸乳球菌培养基IO. 8ml，然后将稀释的细胞转入到灭菌的离心管中。室温下，将
离心管室温放置40-60min，使电击细胞在乳酸乳球菌培养基1中培养生长。将液体平铺于
乳酸乳酸乳球菌培养基1平板上，3(TC培养2天，直到长出单菌落。 结果如图所示图6为pNZ8149-IFSl筛选出的乳酸乳球菌转化子， 3)乳酸乳球菌转化子的分子鉴定 (1)提取乳酸乳球菌转化子表达载体的质粒DNA ;
(2)重组乳酸乳球菌乳球菌表达载体的PCR和酶切鉴定 以重组表达载体质粒DNA为模板，分别对表达载体质粒进行PCR扩增和限制性内 切酶双酶切，反应体系和反应条件同重组克隆质粒的PCR检测和酶切检测。反应结束后，对 PCR和酶切产物进行1% Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果如图所示图7 为pNZ8149-IFSl的PCR电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳道 1在1566bp处有一条清晰条带，图8为pNZ8149-IFSl为Xbal和Spel酶切检测结果(泳道 1在1560bp有一条清晰条带；泳道2为DNA分子量标准)，基因的PCR和酶切结果与预期结 果相符，证明重组表达载体pNZ8149-IFSl构建成功，同时证明了 NZ3900/pNZ8149-IFSl的 成功构建。 5、提取乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl的粗蛋白，利用SDS-PAGE方法对 工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl进行蛋白检测
1)乳酸乳球菌培养的准备 (1)将含有重组表达载体的乳酸乳球菌pNZ8149-IFSl转化子及含有空载体 pNZ8149的乳酸乳球菌转化子细胞及乳酸乳球菌NZ3900接种到含5ml乳酸乳球菌培养基2 中，3(TC下过夜培养。 (2)接种约lml过夜培养乳酸乳球菌于含25ml乳酸乳球菌培养基2的50ml的三 角瓶中过夜培养，直到OD = 0. 2-0. 4。 (3)分装菌液5ml，为进行未诱导的乳酸乳球菌转化子的蛋白检测准备；
(4)对余下的20ml分别加入50 ii 1 0. 5ng/ml NISIN i秀导培养至OD = 0. 6。
(5)6000g、室温下离心5min，收集乳酸乳球菌沉淀。 (6)弃上清，每管中加入50ml的去离子水洗涤乳酸乳球菌沉淀，6000g、室温下离
心5min弃上清。 (7)重复一次步骤5。 2)乳酸乳球菌粗蛋白的提取 (1)向分装后的未诱导的乳酸乳球菌和经过NISIN诱导后的乳酸乳球菌沉淀中加
入50mmol/L Tris-HCl (PH = 7. 5)和1Ommol/L叠氮化钠溶液悬浮沉淀。 (2) 12000rpm，5min，4。C离心收集沉淀细胞。 (3)弃上清，用30 iU去离子水悬浮细胞。 (4) IO(TC保温3min，使蛋白酶失活之后，将样品存放于_20°C 。 (5)加入0. 3g直径0. 2mm的玻璃珠，剧烈振荡混合2min。 (6)加入150 iil去离子水，稍加振荡，置IO(TC保温lmin。 (7)取5 20 iil抽提液上样进行SDS凝胶电泳。 3) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 将上述所提蛋白进行SDS-PAGE，结果如图9 (所示泳道1为NZ3900空菌；泳道2为 未进行诱导的NZ3900/pNZ8149-IFSl ;泳道3为NISIN诱导后的NZ3900/pNZ8149-IFSl ;泳 道4为protein moleciUar weight marker)在约50KD左右处有一特异蛋白带，与已知的 理论分子量一致，说明大豆异黄酮合成酶基因IFS1在乳酸乳球菌中得到表达。并且图10 泳道2是经过诱导的，泳道1是未经诱导的，表明乳酸乳球菌转化子NZ3900/pNZ8149-IFSl 诱导和未经诱导的目的蛋白的表达量是有很大差异的，诱导后比诱导前蛋白质分泌量宏观上可以看出大很多。 6. 1、利用工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl发酵柚皮素产生大豆异黄酮，并做对照 1NZ3900/pNZ8149和对照2NZ3900与工程菌NZ3900/pNZ8149-IFSl在同等条件下进行发酵培养。利用工程菌发酵生产大豆异黄酮主要分以下四步1乳酸乳球菌培养活化；
2NISIN诱导工程菌催化底物柚皮素产生大豆异黄酮；3超声波方法破碎菌体；4高效液相方
法检测大豆异黄酮。 具体的方法如下 (1)先将生长在固体筛选培养基1的重组乳酸乳球菌转化子NZ3900/ pNZ8149-IFSl、 NZ3900/pNZ8149和NZ3900分别接种于5mL乳酸乳球菌培养基2液体培养 基中3(TC过夜培养。 (2)将lml菌液转入50ml乳酸乳球菌3培养基中150rpm， 30°C培养至OD = 0. 2-0. 4。 (3)此时分别加入50iU 0. 5ng/ml NISIN诱导培养至OD = 0. 6。 (4)分别加入lml柚皮素0. 002g/ml的底物前处理液(底物前处理液为底物柚皮
素溶于5%的乙醇水溶液)。 (5)150rpm下22。C培养48小时。 (6)6000g， 10min于50ml离心管中收集菌体， (7) 30ml70 %乙醇悬浮菌体，利用超声波破碎菌体，功率为800W，破碎总时间
15min(超声10s，间隔5s)。 (8)8000g，15min离心收集上清。 (9)HPLC法鉴定大豆异黄酮，通过对照品的保留时间，判断上清样品中单体组分的
存在，应用的是以下色谱条件色i普柱agilent c18 (4. 6mmX 150mm， 5um)流动相:0-10min 15% -40%甲醇10-40min 40% -55%甲醇流速0. 6ml/min ;柱温25。C ;进样量20 ii 1 ;检测波长260nm ; 将标准品大豆异黄酮之一染料木黄酮溶于甲醇浓度为100. Omg/L，按照上述酶活
检测方法获得的对照样品和乳酸乳球菌工程菌发酵催化的样品进行HPLC检测，如图11所
示染料木黄酮标准品的HPLC检测的结果，由图中可以清楚地得到染料木黄酮的保留时间
为32. 476min及其峰面积9569826 ;图12所示为对照品1的HPLC检测结果，由图可以看
出对照品保留时间在32. 264min有峰面积为1141，浓度为0. 238mg/L ;图13所示为对照品
2的HPLC检测结果，由图可以看出对照品保留时间在32. 190min有峰面积为2658，浓度为
0. 554mg/L ;由图14为乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-IFSl的发酵样品的HPLC酶切检测结果
可以看到在32. 372min有峰面积26429，浓度为5. 52mg/L。有数据结果得知相同时间内，相
同条件下转入PNZ8149-IFS1的乳酸乳球菌工程菌是对照品1的催化柚皮素产生大豆异黄
酮的单体之一染料木黄酮的能力的18倍；相同条件下的乳酸乳球菌工程菌是对照品2的催
化柚皮素产生大豆异黄酮的单体之一染料木黄酮的能力的10倍。并且证明了大豆异黄酮
合成酶基因能够利用柚皮素发酵产生大豆异黄酮。 6.2、由于提取高纯的柚皮素进行发酵无疑给大豆异黄酮的发酵生产提高了成本增加了繁杂的工序，应用含有柚皮素的自然添加物作为底物利用工程菌NZ3900/ pNZ8149-IFSl发酵生产大豆异黄酮，并作对照NZ3900/pNZ8149，在同等条件下进行发酵培 养，利用自然添加物做底物利用工程菌催化产生大豆异黄酮主要分以下五步，1底物的前处 理，2乳酸乳酸乳球菌培养活化；3NISIN诱导工程菌催化底物产生大豆异黄酮；4超声波方 法破碎菌体；5高效液相方法检测大豆异黄酮。具体的步骤如下 (1)首先选新鲜的或冷冻保藏的自然添加物，称取50g进行研磨处理成糊状物，以 便其中的色素物质充分的释放出来，以蒸馏水定容至1L， 10『C高压灭菌20min，之后4t:保 存备用。 (2)先将生长在固体筛选培养基上的重组乳酸乳球菌转化子NZ3900/ pNZ8149-IFSl和NZ3900/pNZ8149分别接种于5mL乳酸乳球菌培养基3液体培养基中30°C 过夜培养。 (3)分别将lml菌液转入50ml乳酸乳球菌培养基中150rpm， 30°C培养至OD = 0. 2-0. 4。 (4)此时分别加入50 iil 0. 5ng/ml NISIN i秀导培养至OD = 0. 6。 (5)分别加入50ml的底物处理液。 (6)150rpm下22。C培养48小时。 (7)6000g， 10min于50ml离心管中收集菌体， (8) 30ml70 %乙醇悬浮菌体，利用超声波破碎菌体，功率为800W，破碎总时间 15min(超声10s，间隔5s)。
(9)离心收集上清。 (IO)HPLC法鉴定大豆异黄酮，通过对照品的保留时间，判断上清样品中单体组分
的存在，应用的是以下色谱条件色i普柱agilent c18 (4. 6mmX 150mm， 5um)流动相0-10min 15%_40%甲醇10-40min 40%_55%甲醇流速0. 6ml/min ;柱温25。C ;进样量20 ii 1 ;检测波长260nm ; 大豆异黄酮之一染料木黄酮标准品，对照品1(NZ3900发酵底物处理液的产物)与
样品(NZ3900/pNZ8149-IFSl发酵处理液的产物)的HPLC检测的结果如下图15为大豆异
黄酮标准品的HPLC检测结果。保留时间在31. 635min的峰面积为41142857 ;图16为对照
品I的HPLC检测结果，保留时间在31. 870min的峰面积为50237 ;图17为样品的HPLC检
测结果，保留时间在31. 895min的峰面积为67367.由利用自然添加物做底物的对照与样品
的峰面积的差值17130，与利用柚皮素直接做底物的样品与对照1的峰面积的差值25288相
比，大约是其三分之二，这表明乳酸乳球菌工程菌能够利用自然添加物中的柚皮素产生大
豆异黄酮，而且大豆异黄酮合成酶活性稳定。 另外自然添加物本身含有大豆异黄酮，利用乳酸乳球菌发酵底物可以增加混物中 的大豆异黄酮的含量，为将来工业开发生产大豆异黄酮进行了新的探索。
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权利要求
一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，包括以下步骤1)设计引物根据GenBank已发表的大豆异黄酮合成酶基因IFS1的DNA序列，应用PrimerPremier5.0设计引物引物如下上游引物5′TT ACTAGT ATGTTGCTTGAACTTGCACTTGGTTTG 3′(SpeI)下游引物5′TT TCTAGA TTAAGAAAGGAGTTTAGATGCAACGCCG 3′(XbaI)2)提取大豆吉农17的总RNA，反转录成CDNA；3)扩增大豆异黄酮合成酶基因IFS1，构建重组克隆载体pMD18-T-IFS1并进行鉴定；4)构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFS1，利用电穿孔方法将重组表达载体pNZ8149-IFS1转入到乳酸乳球菌NZ3900中，获得重组乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1并进行鉴定；5)提取乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1的粗蛋白，利用SDS-PAGE方法对乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1进行蛋白检测；6)以大豆异黄酮之一染料木黄酮作为标准品，利用高效液相方法检测工程菌发酵生产大豆异黄酮利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1发酵柚皮素产生大豆异黄酮；也可以应用含有柚皮素的自然添加物作为底物利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1发酵生产大豆异黄酮。
2. 权利要求1中涉及的乳酸乳球菌工程菌，是通过以下方法得到的构建含有IFS1基 因的重组表达载体为pNZ8149-IFSl，利用电穿孔方法将重组表达载体pNZ8149-IFSl转入 到乳酸菌NZ3900即得。
全文摘要
本发明涉及一种大豆异黄酮的制备方法，尤其是公开了一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，利用工程菌发酵底物产生异黄酮为大豆异黄酮的来源提供了新的途径，而且克服了传统大豆异黄酮工业受含量低和大豆原料本身的熟期限制。本发明所用的乳酸乳球菌为安全的食品级微生物，质粒pNZ8149以LacF基因取代了常用的抗生素抗性基因作为筛选标记，其宿主菌乳酸乳球菌NZ3900已删除lacF基因，避免了抗生素抗性基因的水平转移，更加安全，符合临床应用要求，为将来工业开发利用工程菌代谢生产异黄酮开辟了应用前景。
文档编号C12R1/01GK101792779SQ20101011150
公开日2010年8月4日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者付永平, 刘洪禹, 曲静, 王丕武, 王鑫雨, 马建 申请人:吉林农业大学