专利名称：自体骨髓间充质干细胞的扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种骨髓间充质干细胞培养扩增方法，具体地说是一种应用自体血清
培养骨髓间充质干细胞的扩增方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)广泛分布于人体各种组织中， 包括骨髓、脂肪、胎盘及骨骼肌等，其中骨髓间充质干细胞被认为是最容易获得、最丰富的 MSCs库。人的骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能、自我更新、归巢到病变组织及免 疫调节的特性，并具有下列优点①在体内外具有良好的增殖能力，易于培养、调控，扩增数 代后仍然能保持其多向分化的潜能；②移植后存活率高，并能根据移植后微环境调节分化 方向，促进损伤组织的修复，同时无免疫排斥反应；③取材简易，符合伦理学原则。因此骨髓 间充质干细胞成为细胞治疗理想的种子细胞，具有广阔的临床应用前景，然而，刚分离出来 的原代间充质干细胞数量太少，难以满足临床治疗和研究方面的需求，因此，需要在体外对 MSCs进行大量培养扩增。 尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基，试图扩增MSCs，但是MSCs在无血清条 件下，增殖较慢，并且存在分化能力消失的问题，至今仍未能获得重大突破。目前广泛应用 的骨髓MSCs培养体系多采用胎牛血清，一般的使用浓度至少要加10%，才能保证细胞的正 常生长传代。然而MSCs在高浓度血清培养时，随着传代次数增加，细胞增值能力下降，形态 由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，血清成分不明确，既包含促进细胞 生长、稳定解毒的物质，也包含低水平的抑制细胞生长的物质。血清还含有潜在的病毒或支 原体污染，存储过程中易受其他微生物污染，不同批次差异大，以及难于从细胞下游产品中 去除等缺点。在培养基中添加自体血清或血浆进行MSCs培养，可以有效避免使用胎牛血清 而带来的各种弊端，获得的MSCs具有增殖快、多向分化潜能。但由于自体MSCs大量培养需 要的血清量大，需要收集更多的自体血清或血浆，使得其应用受到一定的限制。
本领域技术人员为了弥补上述现有技术的缺陷，提出使用与骨髓间充质干细胞同 源的自体血清扩增培养，但是现有技术所需使用的自体血清浓度较大， 一般为10%左右，才 可以保证骨髓间充质干细胞的正常培养生长。由于浓度大，用量多，在培养前需要抽取患者 较多血浆才可达到所需用量，对患者的健康造成了一定的危害。另外，现有技术骨髓间充质 干细胞培养时间较长，通常需要30天左右才能达到需求，因此不能及时的满足临床需求， 延误病情。 因此目前本领域技术人员一直在寻求一种培养方法可以解决上述现有技术的问 题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用低浓度自体血清即可实现快速骨髓干细胞扩增 培养的方法。
本发明的发明思路为采用无血清培养基成分具体的讲是在基础培养基中添加了 胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、亚硒酸纳、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子等细胞生长因 子成分，再补加低浓度的自体血清，建立了一种扩增自体MSCs的方法；改进了原代及P1代 细胞融合单层及细胞接种量，有效解决并提高了自体骨髓MSCs扩增的效率，以满足有关领 域的需要。 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案 —种自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，包括以下步骤 (1)采取骨髓，淋巴细胞分离液分离并收集骨髓间充质干细胞； (2)步骤(1)收集的细胞用添加有O. 5%_2%自体血清的培养基混悬均匀，37t:接
种培养； (3)细胞培养48h换液，去除非贴壁细胞，继续培养，3d换液一次； (4)细胞达50 60 %融合时，用0. 25 %胰蛋白酶-0. 02 % EDTA消化3min，收集细
胞，按l : 2传代培养； (5)细胞达60 80%融合时，用同步骤(4)的方法消化收集细胞，按1 X 104/ml传 代，继续培养。 (6)培养15 20山至80-90%融合时，收获细胞。 所述自体血清为与骨髓间充质干细胞同源的血清。所述自体血清使用的浓度为 1 50ul/ml，优选为1 30ul/ml，最优为10ul/ml。 所述的基础培养基为DMEM低糖、DMEM-F12培养基，优选的是DMEM低糖培养基，培 养基配方为胰岛素1 100ii g/ml ;优选为1 10 ii g/ml ;最优为5ii g/ml 白蛋白1 50mg/ml ;优选为1 10mg/ml ;最优为5mg/ml转铁蛋白1 50ng/ml ;优选为1 10ng/ml ;最优为5ng/ml 亚硒酸钠1 100ng/ml ;优选为:1 30ng/ml ;最优为:10ng/ml 氢化可的松1 100 ii g/ml ;优选为1 40 ii g/ml ;最优为10 ii g/ml碱性成纤维细胞生长因子1 100ng/ml ;优选为1 50ng/ml ;最优为5ng/ml。 上述的基础培养基、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、亚硒酸
纳、氢化可的松均为市售产品，可从公司购买得到。自体血清为与骨髓间充质干细胞同一来
源的血清。 用超纯水溶解基础培养基，并加入碳酸氢纳、庆大霉素、碱性成纤维细胞生长因 子、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、亚硒酸纳、氢化可的松，搅拌混均，0.22ii滤膜过滤除菌，4t: 存放1 3个月。 本发明利用培养基与少量自体血清的复配，找出细胞生长最佳的环境，以及在方 法中对细胞融合度的严格控制，最终实现快速培养骨髓间充质干细胞的目的，并且自体血 清的使用弥补了胎牛血清存在的缺陷。经过反复实验验证，培养效果极佳。
本发明的优点与效益 利用本发明所述培养基，添加低浓度的自体血清，成功培养了骨髓间充质干细胞。 从促进细胞增殖方面达到了与高浓度胎牛血清相同效果，在维持间充质干细胞干性方面优 于胎牛血清。骨髓间充质干细胞培养时间大大縮短，有利于临床应用。由于采用了低浓度自体血清的浓度，避免了高浓度胎牛血清存在的批次间不稳定、细胞毒性、大量异源蛋白等 缺陷，为骨髓间充质干细胞的基础研究和临床治疗提供了很好的工具。同时，本发明建立的 方法用于培养骨髓间充质干细胞，抽取5ml骨髓，在约20天的内，可以扩增收获间充质干细 胞的1. 5 2 X 107个细胞。如果临床治疗方案按每公斤体重1 X 106个细胞计算，只需抽取 50ml患者的骨髓，就可以获得满足临床治疗需求的细胞量。而本方法建立的低浓度的自体 血清培养方法，只需抽取患者少于10ml血液得到的血清量就可以满足扩增的需要，1%的 血清量，明显优于先前报道建立的10%自体血清的培养方法，大大减少的血清的用量，从而 加少采集患者的血液量。得到的骨髓间充质干细胞，从细胞形态、生长周期、表型、诱导分化 能力方面等都具有干细胞的特征。
图1为人骨髓间充质干细胞的形态特征；(a :培养2d ;b :培养7d ;C :培养12d) 图2人骨髓间充质干细胞生长曲线； 图3人骨髓间充质干细胞细胞表型检测； 图4人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化； (a :诱导10d ;b :诱导20d ;C :诱导20d经油红0染色) 图5人骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化 (a :诱导10d ;b :诱导20d ;C :诱导20d经肌钙蛋白间接免疫荧光染色)
具体实施例方式
下面以具体实施方式
对发明作进一步详细说明。
实施例l自体骨髓间充质干细胞培养 (1) 1000ml自体骨髓间充质干细胞培养基的配制 称取10g的DMEM低糖，溶于950ml超纯水中，加入3. 7g碳酸氢纳、10万U的庆大 霉素、5ug碱性成纤维细胞生长因子、5mg胰岛素、5ug转铁蛋白、5g白蛋白、10ug亚硒酸纳、 10mg氢化可的松，搅拌混均，调pH至7. l，补水至lOOOml，O. 22 y滤膜过滤除菌，4t:存放 1 3个月。 (2)人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增无菌抽取骨髓约5ml，移入含lml (500u/ml肝素)生理盐水的50ml离心管内，再加
等量含20u/ml肝素的生理盐水稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加到等体积的人淋巴细胞分离
液上，2000r/min离心30min，用毛吸管吸取云雾状白膜层(单个核细胞)。用生理盐水离心洗涤2次，每次1000r/min离心10min，弃上清，收集细胞，计数有
核细胞，以5X 106/ml个细胞接种于25cm2承装有上述培养基的培养瓶中。37°C 、5% 0)2、饱
和湿度下培养，48h全量换液去除非贴壁细胞，以后每3 4d换液一次。 当细胞达50 60%融合时，以0. 25%胰蛋白酶_0. 02XEDTA消化细胞，以1 : 2
传代培养，并标记为P1。 当细胞达70 80%融合时，同上消化细胞并计数，以1 X 10Vml接种细胞，继续培 养，标记为P2。 当细胞达80 90%融合时收获细胞。5ml骨髓经分离扩增，约15 20天左右可
6以得到骨髓间充质干细胞数目约1. 5 2X 107个细胞。
图1显示骨髓间充质干细胞的形态。
实施例2细胞生长性能检测
(1)细胞生长曲线 取2、3代的培养细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5X10Vml，接种于 24孔细胞培养板中，24h后用胰酶消化孔板中3个孔中的细胞并计数，连续每天取3孔，直 至细胞长满孔时停止计数，以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。
结果如图2所示，在接种后的第1，2天细胞数没有明显的变化，从第3天起，细胞 大量增加，至第6天细胞量达到高峰，以后细胞增长速度减慢。
(2)表型检测 取P3代细胞悬液lml (1 X 106细胞/ml)，在每一管中分别加入2mlPBS洗液，并充 分混匀，室温中静置5min。 1000转/min离心5min，用PBS缓冲液冲洗重悬。加入连接有荧 光素的单克隆抗体及其同型对照进行免疫标记反应，暗箱室温下孵育30min。 1000转/min 离心10min。用PBS缓冲液冲洗重悬，重复冲洗一次，上机检测。结果如图3， CD45、 CD34、 CD14阴性；CD44， CD29， CD54阳性，符合人B匪SCs表面抗原特征。
(3)向脂肪细胞诱导分化 收集消化后的第4代BM-MSC，按2 X 104/cm2接种于6孔板，待细胞融合达50%以 上后，用含10% FCS的低糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系(地塞米松1 y mol/L、人胰岛 素5mg/L、 IBMX 0. 5mmol/L、消炎痛100 y mol/L)，每3天全量换液，维持3周。细胞经油红 O染色，镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。结果如图4，加入脂肪诱导体系后约7天，少数 细胞内就出现微小明亮的脂肪滴。随着诱导时间延长，出现脂滴的细胞增多，细胞也变成方 形或角形。培养至3周，融合的脂肪滴几乎充满整个细胞，油红0染色呈明亮的橙红色。
(4)向心肌细胞诱导分化 收集消化后的第4代BM-MSC，按2X 104/cm2接种于6孔板，待细胞融合达50%以 上后，用含10% FCS的低糖DMEM培养液，加入心肌诱导体系(5、10iimol/L5-氮胞苷)，每 3天全量换液，维持3周。行肌钙蛋白间接免疫荧光染色细胞爬片经4%的多聚甲醛固 定，PBS洗涤，正常羊血清封闭30min，一抗为兔抗人肌钙蛋白多抗，湿盒中4。C过夜，二抗为 FITC-抗兔IgG，室温孵育30min，荧光显微镜下镜检。结果如图5，细胞培养至3周，出现典 型的心肌样细胞，且肌钙蛋白为阳性着色。
权利要求
一种自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤(1)淋巴细胞分离液分离骨髓并收集单个核细胞；(2)步骤(1)收集的细胞用添加有0.5％-2％自体血清的培养基混悬均匀，37℃接种培养；(3)细胞培养48h换液，去除非贴壁细胞，继续培养，3～4d换液一次；(4)细胞达50～60％融合时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化3分钟，收集细胞，按1∶2传代培养；(5)细胞达60～80％融合时，用同步骤(4)的方法消化收集细胞，按1×104/ml传代，继续培养；(6)培养15～20d，至80～90％融合时，收获细胞。
2. 根据权利要求书l所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述自体血清为与骨髓间充质干细胞同源的血清。
3. 根据权利要求书2所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述自体血清使用的浓度为1 50ul/ml。
4. 根据权利要求3所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述自体血清使用浓度为10ul/ml。
5. 根据权利要求书1至4中任意一项所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基配方为胰岛素:1 lOOii g/ml白蛋白1 50mg/ml转铁蛋白1 50ng/ml亚硒酸钠1 100ng/ml氢化可的松1 100ii g/ml碱性成纤维细胞生长因子1 100ng/ml。
6. 根据权利要求书5所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基配方为胰岛素1 10ii g/ml白蛋白1 10mg/ml转铁蛋白1 10ng/ml亚硒酸钠1 30ng/ml氢化可的松l 40iig/ml碱性成纤维细胞生长因子l-50ng/ml。
7. 根据权利要求书6所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基配方为胰岛素5iig/ml白蛋白5mg/ml转铁蛋白5ng/ml亚硒酸钠10ng/ml氢化可的松10ii g/ml碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml。
8. 根据权利要求7所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基终浓度为1 30ng/ml。
9. 根据权利要求8所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基终浓度为5ng/ml。
10. 根据权利要求9所述的自体骨髓间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤(5)细胞融合度为70% 80%。
全文摘要
本发明涉及一种骨髓间充质干细胞培养扩增方法，具体地说是利用培养基与少量自体血清的复配，找出细胞生长最佳的环境，以及在方法中对细胞融合度的严格控制，最终实现快速培养骨髓间充质干细胞的目的，并且自体血清的使用弥补了胎牛血清存在的缺陷。骨髓间充质干细胞培养时间大大缩短，有利于临床应用。同时，本发明建立的方法用于培养骨髓间充质干细胞，抽取5ml骨髓，在约20天的内，可以扩增收获间充质干细胞的1.5～2×107个细胞。大大减少的血清的用量，从而加少采集患者的血液量。得到的骨髓间充质干细胞，从细胞形态、生长周期、表型、诱导分化能力方面等都具有干细胞的特征。
文档编号C12N5/0775GK101760445SQ20101011180
公开日2010年6月30日 申请日期2010年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者伍志强, 司艺玲, 赵亚力, 郝好杰, 韩为东 申请人:中国人民解放军总医院