豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法

专利名称：豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法
技术领域：
本发明涉及生物制氢技术，具体地说是一种豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵
衣藻制氢产量的方法。
背景技术：
光合生物制氢是未来清洁能源可持续生产的重要途径之一，包括莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)在内的许多微型绿藻和蓝藻可以在缺氧的条件下诱导细胞 内的氢酶(H2ase)基因表达，将光合作用中产生的H+和e—合成H2，释放到细胞外，生物制氢 是利用太阳能生产氢气的理想模式。莱茵衣藻生长速度快，培养成本低，氢酶活性高，是很 有开发潜力的微藻光合制氢藻种。但是，氢酶对氧气极其敏感，很容易受氧气的抑制而失去 活性，而氧气又是衣藻光合作用的主要产物，这一对矛盾限制了衣藻产氢技术的应用。为了 提高衣藻光合产氢的效率，需要尽可能的降低衣藻细胞内的氧气含量或者提高氢化酶的氧 耐受性。目前降低衣藻细胞内的氧气含量的办法是通过抑制光合系统II(PS II)活性进而 抑制光解水放氧来实现，但是该方法同时抑制了光合链电子传递效率，影响了衣藻的产氢 效率，另一方面，缺氧条件下衣藻的生长也受到严重抑制，最终也影响产氢效率。
豆科植物根瘤中的固氮酶与氢酶有相似的特性，也对氧气敏感，但是根瘤中的固 氮酶却有很高的固氮活性，这与根瘤细胞中含有大量的豆血红蛋白(leghemoglobin，简称 Lb)有密切关系。豆血红蛋白有两个亚基构成，一个是球蛋白亚基，由豆科植物合成；另一 个是血红素辅基，由共生的根瘤菌合成，两个亚基结合成为有活性的豆血红蛋白。豆血红蛋 白具有与氧气可逆结合、降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用的特性，既能维持根瘤细胞内 较低的氧气含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中国专利200380107352. 7肯 和02138702. 8分别公开了利用表达豆血红蛋白改变植物贮藏储备物含量和提高植物抗涝 能力。生物发酵工程研究中也有应用其它血红蛋白体外重组表达而使产量提高的报导。
在植物细胞内、尤其是叶绿体中，血红素辅基前体可以通过叶绿素合成途径合成， 只是在最后一步，植物叶绿体中，原扑啉在镁螯合酶的作用下生成叶绿素。在根瘤细胞中， 原扑啉在根瘤菌合成的亚铁螯合酶(ferrochelatase)催化下合成血红素辅基(Sangwan 和0' Brain， 1991 ;Santana等，1998)。在植物细胞内没有亚铁螯合酶基因hemH，但是在植 物细胞中存在着具有与亚铁螯合酶相似功能和相似结构的吡啶核苷酸双硫酸氧化还原酶 (pyridine-nucleotide disulfide oxidoreductase)蛋白酶家族，會g合成与血红素辅基有 相似功能的蛋白。本发明的前期工作表明，单独在莱茵衣藻的叶绿体中表达豆血红蛋白的 球蛋白亚基基因lba可以降低培养体系内的氧气含量和使产氢量提高约50 % 。为了进一步 提高莱茵衣藻的产氢能力，本发明将来源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium J即onicum) 的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和来源于大豆(Glycine max)根瘤的豆血红蛋白球蛋 白亚基基因lba转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，解决衣藻产氢代谢过程中需要尽量降低细 胞内氧气含量、保障细胞内低氧环境又要尽量保证其正常代谢的难题。本发明人曾发明 大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法(中国专利201010107922. 4)，为了更进一步提高莱茵衣藻生物制氢产量，本发明将来源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium J即onicum)的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因和来源于大豆(Glycine max)根瘤的豆血红蛋 白球蛋白亚基基因lba转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，莱茵衣藻制氢产量得到显著提高， 取得了出人意料之外的效果。本发明首次利用豆血红蛋白亚铁螯合酶基因转入莱茵衣藻的 叶绿体内具有新颖性和创造性；本发明解决了衣藻产氢代谢过程中保证其正常代谢的技术 难题，具有实用性。随着生物制氢技术的发展，本发明将愈发显现出越来越大的实用性和重 要性。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用豆血红蛋白亚铁螯合酶基因，更好的提高莱茵衣
藻和各种微藻制氢产量的技术方法。 本发明的目的是这样实现的 豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法，步骤如下
(1)莱茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培养
A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849 ;
B、培养莱茵衣藻藻种 (a)莱茵衣藻正常培养条件温度25 ± 1°C ;日光灯光照强度100 200微摩尔光 量子/平方米 秒(y mol photons m—2s—0 ;50 100ml三羟甲基氨基甲烷_乙酸_磷酸 盐(Tris-Acetate-Phosphate简称TAP)培养基液体培养，初始pH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天1 %接种继代培养； (b)固体平板TAP培养基琼脂粉1. 5% ;挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线 方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次； C、莱茵衣藻产氢培养条件在缺硫培养基中进行，把正常的TAP培养基的硫酸镁、 硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对 数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在 缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条 件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50 100微摩尔光量子/平方 米 秒(ii molphotons m—2s—0 ，温度25±1°C ;每24小时进行气体成分和含量检测一次；
D、慢生大豆根瘤菌培养条件用pH 7. 2的酵母提取液_甘露醇液体培养基，温度 28士rC、黑暗条件下200rpm转速震荡培养，至对数生长期，吸光度0D6。。值达到0. 6_0. 8， 1%接种继代；E、用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛5 X 1/8 (0D)，柱长2m，内径3mm，热 导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50°C ，进样温度200°C ，热导检测温度300°C ;
(2)豆血红蛋白hemH基因和lba基因的克隆A、取序列号M92427慢生大豆根瘤茵hemH基因和序列号V00453大豆lba基因；
B、分别提取慢生大豆根瘤菌的总DNA，提取大豆的总RNA，再对大豆总RNA进行浓 度和纯度检测，反转录成cDNA ; C、分别克隆hemH基因和lba基因；反应条件为94"预变性5min， 一个循环；94°C 变性lmin，62。C退火30s，72。C延伸1. 5min ;共30个循环；72。C延伸15min ;反应产物纯化
C、测序鉴定hemH基因、lba基因的特异性引物
hemH基因的特异性引物为 hemH-Pl :5， - GC6^CO^^gggaggg; atgtcgaccgccgctc-3'，斜体表示SacII酶切
位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列； hemH-P2 :5，-^C6KKT6Wctatatccagccctggagctcgcg-3，，斜体表示SacII酶切位 点序列； lba基因的特异性引物为 Lba-Pl :5， _c卵《ctcagggaggg aaa ttt aaa ttt atg gtt get ttc
actgag-3'，斜体表示Small酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序 列； Lba-P2 :5， -tec CCC叙g ata cta att atg cct tct taa tag c-3，，斜体表示 Sacl酶切位点序列； (3)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建 A、用限制性内切酶Small和SacI酶切克隆得到的大豆lba基因片段和载体cg40， 将纯化的lba基因片段通过上述酶切位点用T4 DNA连接酶连接质粒cg40中的aadA基因， 形成aadA-lba融合基因，得到载体cg401-l-lba ;用SacII酶切位点将hemH基因用T4 DNA 连接酶连入到质粒cg401-l-lba中aadA基因之后和lba基因之前，形成aadA-hemH-lba 融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-l-hemH-lba ;转化大肠杆菌DH5 a ，用于保 存、鉴定和大量制备质粒DNA ;
(4)莱茵衣藻叶绿体的转化A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25 °C下3000rpm离心5min收集藻细胞， 用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米 秒 (iimol photons *m—2 s—0和25± TC条件下培养24小时；用基因抢轰击转化；真空 度9. 48192 X 104Pa，轰击距离9cm，氦气压力7. 584236 X 106Pa，金粉子弹经限制性内切酶 EcoRI酶切质粒cg401-l-hemH-lba DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1. 0微米；
B、转化后的衣藻在光照和25± rC条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗， 涂布于含壮观霉素lOOii g/ml的TAP固体选择培养基上，在25士rC和100微摩尔光量子/ 平方米 秒(P mol photons m—2 s—0的连续光照条件下，培养约7 15天；取有抗性的 单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；
(5)分析转基因莱茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表达
A、 hemH-lba基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测 a、hemH基因和lba基因通过同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上，以转基 因衣藻总DNA为模板的PCR产物为8229bp ;未整合的PCR产物是5400bp ;与莱茵衣藻叶绿 体DNA结合的引物是cpDNA-Pl :5， _aga cag cca aca ttt tgtta-3' ;cpDNA_P2 :5， -get tea aaa aca aaa tea aa_3 ^ b、取对数生长后期的衣藻培养液，4t:低速离心收集，加350 ii 1 NET重悬沉淀；加 入25iU 10mg/ml的蛋白酶K及25iU 20% SDS，混匀37。C水浴12小时，冰上冷却；加入200 ill 5mol/L KAc，静置离心；上清中加入等体积25 : 24 : 1的酚/氯仿/异戊醇溶液 抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70%乙醇洗涤，干燥后溶 于30 ill TE缓冲液，用于PCR检测； B、转基因莱茵衣藻中hemH基因和lba基因转录的检测 取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞；提取总 RNA，反转录cDNA ;利用hemH基因和lba基因的特异性引物和克隆hemH基因和lba基因所 述的PCR条件扩增，进行hemH基因和lba基因转录水平的检测；
C、转基因莱茵衣藻中亚铁螯合酶和Lba表达量的检测 a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液50mM Tris/HCl pH 8.3 plus l%Triton_X 100 ;上样缓冲液0. 25M Tris-HCl， pH 8. 0 ;25 % glycerol ;7. 5 % SDS ;0. 25mg ml_l bromophenolblue ;12. 5% (v/v) 2-merc即toethano1 ;b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，快速室温3000rpm离心5min收集藻细胞，用
250 iU蛋白提取缓冲液悬浮，加入2iU P-巯基乙醇，液氮冻融三次；4t:条件下离心
20min ;取200 iU蛋白上清液加入100 yl上样缓冲液，用10%的分离胶和5%的浓縮胶进
行凝胶电泳，转PVDF膜；分别用抗豆血红蛋白亚铁螯合酶多克隆抗体和抗大豆Lba多克隆
抗体做性免疫杂交检测，对HRP标记的抗体进行化学发光检测； (6)分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响 A、用TU-1901双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95%乙醇溶液，混合均匀，
室温避光放置20min，4。C下12000rpm离心10min ;取上清，测定0D665及0D649的吸光值； C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L :叶绿素Chi (mg/1)=
20. 04X0D649+6. 10X0D665 ; (7)分析豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影 响 A、缺硫培养基中耗氧量和产氢量的检测
B、含硫培养基中耗氧量和产氢量的检测。 本发明的要点是豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba在莱茵 衣藻产氢中的应用及其实施方法。 本发明过程中通过研究发现，豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基 因lba在莱茵衣藻的叶绿体中表达以后，使转基因衣藻产氢培养体系中的氧气含量较快速 度降低，并维持在较低的氧气含量水平，使产氢量提高4倍左右。这种结果及其用途是人们 在生物制氢领域一直寻求而没有想到的。 本发明提供了一个在莱茵衣藻叶绿体中表达豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和 球蛋白亚基基因lba的转基因莱茵衣藻。 按照本发明，叶绿体中表达了豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基 因lba的转基因莱茵衣藻的产氢培养体系中氧气含量明显降低，产氢量明显提高。
在本发明中，豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH来源于慢生大豆根瘤菌，该基因的 核苷酸序列和氨基酸序列是已知的，其基因库(NCBI GenBank)序列号是M92427。豆血红 蛋白球蛋白亚基基因lba来源于大豆，该lba基因的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的，其NCBI GenBank基因库序列号是V00453。本领域的技术人员可以通过基因序列中的数据信 息进行检索得到该hemH和lba基因的信息。本发明优选具有该序列号信息所示的核苷酸 序列，更优选的是编码具有该序列号信息所示的氨基酸序列的基因。在本发明的具体实例 中，特别提到的豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba分别克隆于慢生大 豆根瘤菌的DNA和大豆根瘤的cDNA。利用本领域技术人员公知的方法，可以直接从慢生大 豆根瘤菌中提取DNA，然后用PCR方法克隆用于本发明的hemH基因；从大豆根瘤细胞中提 取mRNA，再反转录成cDNA，然后用PCR方法克隆用于本发明的lba基因。可选择地、根据已 知的核苷酸序列和氨基酸序列合成该基因。可选择地、利用已有的含有该基因的质粒中提 取该目的基因。 在本发明中，表达载体除了上面特别提到的豆血红蛋白hemH基因和lba基因，还 包括启动子、终止子，选择性标记基因、增加转录和表达稳定性的基因片段以及能够使目的 基因整合到宿主细胞DNA上并稳定表达的基因片段等，这些都是在植物和藻类转基因工作 中常用的基因表达元件。在本发明的具体实例中，用于豆血红蛋白hemH基因和lba基因的 表达载体包括psbB启动子和终止子、3' -rbcL转录稳定性增强元件、aadA筛选性标记基因 和帮助该表达载体整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上的含atpB基因序列的cpDNA-l序列区域 和cpDNA-2序列区域。 本发明提供的启动子、终止子、增加转录稳定性的基因片段和帮助目的基因整合 到叶绿体DNA上的基因片段的种类不受限制，只要能够在豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba 基因导入并整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上并能将该基因稳定表达就可以。优选是psbB启 动子和终止子、3'-rbcL基因序列以及含atpB基因序列的基因序列片段等莱茵衣藻叶绿体 内源基因表达调控元件。 本发明指的转化包括基因枪转化法和电击转化法，更优选的是基因枪转化法。在 利于表达载体导入的条件下，用包被表达载体DNA的金粉轰击衣藻细胞，将含有包括豆血 红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba的表达载体导入莱茵衣藻细胞的叶绿 体中。 本发明通过抗生素的选择性筛选出表达豆血红蛋白亚铁螯合酶和Lba的转基因 莱茵衣藻，并进一步在抗生素平板上多次继代培养，增加目的基因在转基因莱茵衣藻叶绿 体DNA中的整合率；筛选出产氢培养体系中氧气含量低、产氢量高的转基因莱茵衣藻单克 隆。 本发明表达理解为将起始DNA或RNA的遗传信息转移至基因产物多肽或蛋白质 中，即本发明中的豆血红蛋白亚铁螯合酶和球蛋白亚基。 本发明转基因理解为将遗传信息转移至生物体，特别是莱茵衣藻。这意味着包括 引入所有对熟练工作人员所公知信息的方法，例如粒子轰击、电穿孔、化学介导或农杆菌介 导的摄入、显微注射等。遗传信息可引入细胞，例如以DNA、RNA、质粒或以任何其它方式，并 且通过重组掺入宿主基因组的方式。为了本发明目的顺利实现，转基因莱茵衣藻是经过遗 传修饰的莱茵衣藻。 本发明通过使用在莱茵衣藻叶绿体中表达豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球 蛋白亚基lba基因，使莱茵衣藻的产氢能力提高。 本发明所述的在其叶绿体中表达豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基lba基因的转基因莱茵衣藻，其分类命名为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) cg401_l_hemH_lba。 本发明所述的转基因莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) cg401-l-hemH-lba，其密闭培养体系中的氧气含量下降地明显比未转基因莱茵衣藻的快， 并且氧气含量能维持较低水平，产氢量明显增加。 本发明所述的方法也适用于包括莱茵衣藻在内的其它微型绿藻和蓝藻产氢能力 的提高。 本发明指出了豆血红蛋白基因不曾发现的和记载的新性能和用途；特别指出了豆 血红蛋白亚铁螯合酶基因对于提高莱茵衣藻产氢量的用途；本发明提供了一种降低绿藻产 氢培养体系中氧气含量和提高产氢量的新方法；提供了一个在叶绿体中表达豆血红蛋白 hemH基因和lba基因的和产氢量增加的转基因莱茵衣藻藻种。 本发明目的生物体是更多具有光合活性的产氢微藻和需要呼吸提供能量产氢的 微藻或微生物，如微型绿藻、蓝藻、光合细菌。优选的藻类是微型绿藻如莱茵衣藻和蓝藻如 集胞藻属(Synechocystis)。
本发明具有如下优点 1、本发明方法显著降低绿藻产氢培养体系中氧气含量。
2、本发明能够显著提高生物产氢量。
3、本发明方法适用于各种产氢绿藻和蓝藻。 本发明在世界上首次将豆血红蛋白亚铁螯合酶基因应用于莱茵衣藻及其它各种 产氢微藻，使得产氢微藻产氢量得到显著的提高，取得了出人意料的效果，具有新颖性、创 造性和实用性。本发明方法利用转基因的方法取得了生物制氢技术的突破；是制备人类迫 切需要的氢气能源的突破；本发明对未来的生物技术、能源技术和环境技术的发展都具有 不可忽视的重大影响。


图1为莱茵衣藻叶绿体转化载体cg401-l-hemH-lba主要基因元件结构图。
图2为莱茵衣藻叶绿体表达载体cg40-l-l-hemH-lba的酶切鉴定电泳图。图 中l为分子标记AHindIII图；2为质粒cg40-l-l-lba DNA经SacII酶切图；3为质粒 cg40-l-l-hemH-lba DNA经SacII酶切图；4为分子标记DL2000。 图3为叶绿体转化hemH-lba基因的莱茵衣藻在含lOOmg. L_l壮观霉素的TAP平 板上筛选图。图A为阴性对照组未转基因的莱茵衣藻849 ;图B为阳性对照组转化载体 cg401-l的莱茵衣藻；图C为转化lba基因的莱茵衣藻。 图4为莱茵衣藻叶绿体中转化hemH基因和lba基因的PCR鉴定图。图A为以总 DNA为模版的PCR电泳图。其中l为分子标记AHindIII ;2为不含模版的阴性对照组；3为 未转基因莱茵衣藻；4为转基因莱茵衣藻；图B为以cDNA为模版的PCR电泳图其中1为分 子标记DL2000 ;2和4为转基因莱茵衣藻；3和5为未转基因莱茵衣藻。
图5为对叶绿体中转化hemH和lba基因的莱茵衣藻中hemH表达量进Western Blot检测图。前一组数字0、3、5、6和7分别指转基因莱茵衣藻开始进行产氢培养的天数； 后一组数字3和5分别指阴性对照组未转基因的莱茵衣藻开始进行产氢培养的天数。
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图6为叶绿体中转化hemH和lba基因的莱茵衣藻与未转基因莱茵衣藻849的生 长情况的比较图。 图7为叶绿体中转化hemH和lba基因的莱茵衣藻与未转基因莱茵衣藻849在培 养基中分别含0， 12. 5， 25和50i！ M硫酸盐的产氢培养条件下耗氧量和产氢量的比较图。
具体实施方式

实施例1 : 莱茵衣藻和慢生大豆根瘤菌及其培养 因为莱茵衣藻生长速度快、培养成本低、氢化酶活性高，所以是微藻光合制氢的代 表物种。为了使转基因容易操作，本发明优选细胞壁缺欠型的莱茵衣藻藻种cc849。
①莱茵衣藻正常培养条件按照Harris主编的《The ChlamydomonasSourcebook : a comprehensive guide to biology and laboratory use.New York :Academic Press. 1989》，优选条件25±1°C，日光灯光照强度(100 200 ii molphotons m—2s—0 ;液体 培养是在50 100ml Tris-Acetate-Phosphate (TAP)培养基，初始pH7. 2，水平摇床转速 100 130rpm，每5 6天1%接种继代培养；固体平板培养基(TAP)含1. 5%的琼脂粉，藻 种的保存和纯化是挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上，每3周继代 一次。 ②莱茵衣藻产氢培养条件按照Melis等(Plant Physiology. 2000， 122 : 127-136)的方法，莱茵衣藻的产氢培养是在缺硫培养基(TAP-S)中进行。缺硫培养基 (TAP-S)是把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔浓度 的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌。本发明为了将来在工业化生产中应用，有目的的简化 了其产氢培养的操作步骤即将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收 集藻细胞并用TAP-S培养基洗3次，然后悬浮在TAP-S或者含有不同浓度硫酸盐的TAP-S 培养基内，分别装在50ml的培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞塞紧培养 瓶密闭培养。放在黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50 lOOiimol photons m—2s—、温度25± 1°C 。每24小时用微量气密进样器抽取瓶中气体，进行 气体成分和含量检测。 ③慢生大豆根瘤菌培养条件按照Regensburger等(Arch. Microbiology. 1986， 144:355-366)的方法，用YEM(yeast extract-mannitol) (pH 7. 2)液体培养基，在黑暗条 件下、温度28± 1°C 、200rpm转速震荡培养，当吸光度0D6。。值达到0. 6_0. 8 (即对数生长期) 时，1%接种继代。 ④按照冉春秋等(高等学校化学学报，2006， 27 :62-66.)的方法用GC测定氢气和 氧气含量。气相色谱仪为Agilent Technologies GC 7890A, USA，分子筛5 X 1/8 (0D)，柱 长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气。进样体积0. 5ml，柱温5(TC，进样温度 20(TC，热导检测温度300°C。用本领域熟练技术人员公知的外标法计算氢气和氧气体积。
实施例2 : 豆血红蛋白hemH基因和lba基因的克隆 通过本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)以及所用试剂盒制造商的产品说明书(QIAGEN , Promega )分别提取慢生大豆根瘤菌的总DNA和提取大豆的总RNA，再 对大豆总RNA进行浓度和纯度检测，反转录成cDNA。具体地当慢生大豆根瘤菌液的0D6。。 为0. 6-0. 8时，取10ml菌液，4。C下10000rpm离心15min，收集菌细胞，用400 y 1TE溶菌， 加40ii 110% SDS和Proteinase K(20mg/ml)，然后56。C水浴45min，加400 ii 1苯酚，4。C下 10000rpm离心10min，上清液分别用酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)抽提2次、用氯仿 抽提1次，无水乙醇沉淀总DNA，溶于30 ii L TE缓冲液。取lg大豆根瘤细胞，按照QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit试剂盒制造商说明书提取大豆的总RNA，其浓度和纯度用紫外分光 光度法检测。并用DNase I (Fermentas ) 37。C水浴30min，去除RNA中混杂的DNA ;然后 加入25mMEDTA， 65。C水浴10min，终止DNase I的活性。单链cDNA的合成是按照Promega AMV RT protocol制造商说明书进行在25 反应体系中含2 y g的总RNA禾P 1 y g Radom Primer, 37。C水浴60min。 本发明根据NCBI GenBank中慢生大豆根瘤菌hemH基因(序列号M92427)和大豆
lba基因(序列号V00453)的核苷酸序列设计特异性引物，并在引物前分别添加相应的特异
性限制内切酶位点序列，用ExTag进行PCR反应分别克隆hemH基因和lba基因。hemH基因
和lba基因可共用PCR反应条件为94t:预变性5min，一个循环；94"C变性lmin，62t:退火
30s，72。C延伸1. 5min ;共30个循环；72。C延伸15min。 PCR产物分别用QIAGEN试剂盒纯化
回收，并测序鉴定正确性。 hemH基因的特异性引物如下 hemH-Pl :5， - G"C(7GCC( Clagggagggl atgtcgaccgccgctc-3，，斜体表示SacII 酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列。 hemH-P2 :5' _ GCGGCC( C ctatatceagccctggagctcgcg-3'，斜体表示SacII酶 切位点序列。 lba基因的特异性引物如下 Lba-Pl :5' _cCfeagggaggg aaa ttt aaa ttt atg gtt get ttc act
gag-3'，斜体表示Smal I酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列。
Lba-P2 :5'-tccCCCg欲ata cta att atg cct tct taa tag c-3'，斜体表示Sacl 酶切位点序列。
实施例3 : 莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建 通过本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)禾口 Vaistij等对莱茵衣藻口十 绿体表达载体cg40描述的方法(The Plant Journal, 2000， 21 (5) :469-482)进行载体构 建。分别用限制性内切酶Small和Sacl来酶切上述克隆得到的大豆lba基因片段和载体 cg40，将纯化的lba基因片段通过上述两个酶切位点用T4 DNA连接酶连接在质粒cg40中 的aadA基因之后形成aadA-lba融合基因，得到载体cg401-l-lba，再用SacII酶切位点将 hemH基因用T4 DNA连接酶连入到质粒cg401-l_lba中aadA基因之后和lba基因之前，形 成aadA-hemH-lba融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-l-hemH-lba(图1)，转化 大肠杆菌DH5a ，用于保存、鉴定(图2)和大量制备质粒DNA。
实施例4 : 莱茵衣藻叶绿体的转化 通过Boynton等(Science, 1988， 240 (4858) :1534-1538)的方法对莱茵衣藻 叶绿体进行转化。取100ml生长至对数期中后期(约4 5X106)的莱茵衣藻，25t:下 3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上，在光照 lOO践ol m—2 s—1和25士TC条件下培养1天，用基因抢(BioRad ， Model :PDS1000/He Biolistic particle delivery system)进行轰击转化。参数为真空度9. 48192X 104Pa， 轰击距离9cm，氦气压力7. 584236 X 106Pa，金粉颗粒直径1. 0 y m。金粉子弹用EcoRI酶切 的线性化质粒cg401-l-hemH-lba DNA包裹。 转化后的衣藻在25t:和光照下经过18h过渡培养后，用TAP液体培养基冲洗，涂布 于含壮观霉素100 ii g/ml的TAP固体选择培养基上，在25t:和100 y mol *m—2 *s—1的连续光 照条件下，培养7 15天，挑取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养(图3)， 然后分别进行产氢培养并检测产氢量和耗氧量，使用上海基量标准气体有限公司生产的标 准品定义所测气体的组成和含量。
实施例5: 分析转基因莱茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表达
①hemH-lba基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测 测定hemH-lba基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的合适方法是实施下文所述的 PCR法，如果hemH基因和lba基因通过同源重组交换的方式整合到莱茵衣藻叶绿体DNA 上，则以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物应该是8229bp，而未整合的PCR产物应该是 5400bp(图4， A)。其中与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-Pl :5' -aga cag cca aca ttt tgt ta_3， ；cpDNA_P2 :5， -get tcaaaa aca aaa tea aa_3，。
通过Rochaix禾口 Erickson的方法(Trends in Biochemistry Science, 1988， 13 : 56-59)提取衣藻总DNA。取10ml处于对数生长后期的衣藻培养液，4。C低速离心收集，加 350 ill NET(0.1mol/L NaCl， 50mmol/L EDTA， 20mmol/LTris-HCl， pH 8.0)重悬沉淀，加入 25 ii 1 10mg/ml的蛋白酶{((Proteinase K)及25 y 1 20% SDS，混匀并于37。C水浴过夜，冰 上冷却，加入200iU 5mol/L KAc，冰上静置后离心，上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊 醇(25 : 24 : 1)抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70X乙 醇洗涤，干燥后溶于30 iU TE缓冲液，用于上述PCR检测。
②转基因莱茵衣藻中hemH基因和lba基因转录的检测 检测hemH基因和lha基因在转基因莱茵衣藻中是否转录的合适方法是按照本领 域熟练技术人员所公知的反转录PCR的标准方法(Sambrook等，Molecular Cloning. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)或参照上述的hemH基因禾口 lba基 因克隆方法的实施部分。莱茵衣藻的取样是取对数生长期中期的莱茵衣藻1ml左右，室温 3000rpm离心5分钟收集藻细胞。按照试剂盒制造商的产品说明书(QIAGEN ,Promega )提 取莱茵衣藻的总RNA和按照Promega AMV RT Protocol说明书合成cDNA，利用上述hemH 基因和lba基因的特异性引物和上述克隆hemH基因和lba基因所述的PCR条件进行扩增， 进行hemH基因和lba基因转录水平的检测(图4， B) ， PCR产物回收纯化，送基因测序公司 证明所得核苷酸序列正确。
③转基因莱茵衣藻中亚铁螯合酶和Lba表达量的检测 参照Hemschemeier等(Planta， 2008， 227 :397-407)的方法提取莱茵衣藻总蛋白和进行Western blot检测。取30ml进行产氢培养的莱茵衣藻培养液，快速室温3000rpm离心5min收集藻细胞。用250 蛋白提取缓冲液(50mMTris/HCl pH 8. 3， 1% Triton-X100)悬浮，加入2iU P-巯基乙醇，液氮冻融三次；在4。C，14000g离心20min，取100 y g的蛋白上清液加上样缓冲液(0. 25M Tris-HCl， pH 8. 0 ;25% glycerol ;7. 5% SDS ;0. 25mgml-1 bromophenolblue ;12. 5% (v/v) 2-mercaptoethanol)于10%的分离胶禾口 5%的浓縮胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜(Millipore，USA)， 一抗分别用抗豆血红蛋白亚铁螯合酶多克隆抗体和抗大豆Lba多克隆抗体(上海中科蛋白抗体制备公司)进性免疫杂交检测，按照ECL Plus (Amersham公司)说明书对HRP标记的抗体进行化学发光检测(图5)。对于蛋白质的定量和SDS-PAGE凝胶电泳以及western blot实验中的转膜、封闭、杂交、洗膜、显影等操作技术均为本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)或按照试齐U盒制造商说明书(Bio-Rad Bradford kit禾P GE Healthcare)操作。
实施例6: 分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响
本发明通过测量转基因藻前后莱茵衣藻的细胞数和叶绿素含量的变化来比较在叶绿体中表达豆血红蛋白亚铁螯合酶和球蛋白亚基Lba对莱茵衣藻生物量的影响。藻细胞数和叶绿素含量的测定参照Harris主编的《TheChlamydomonas Sourcebook :acomprehensive guide to biology andlaboratory use. New York :Academic Press. 1989》方法。莱茵衣藻在750nm处的吸光度(0D75。)与莱茵衣藻的细胞数正相关，用TU-1901双光束紫外可见光光度计直接检测培养的莱茵衣藻在750nm处的吸光度作为莱茵衣藻细胞数的生长指标。叶绿素含量的测定是取1ml藻液，3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95%乙醇溶液，混匀，室温避光放置20min， 4。C下12000rpm离心10min，取上清，按比例稀释后，测定0D665及0D649的吸光值，根据下列公式计算出总叶绿素的含量，单位是mg/L。
叶绿素Chi (mg/1) = 20. 04 X (0D649) +6. 10 X (0D665)。 结果表明在叶绿体中表达hemH基因和lba基因未使转基因莱茵衣藻的生长受到抑制(图6)。
实施例7: 分析豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响
①在缺硫培养基中对耗氧量和产氢量的检测 在缺硫培养基中，莱茵衣藻PSII的活性受到抑制，但是呼吸作用不受影响。在密封条件下莱茵衣藻液体培养基中的氧气含量因为呼吸消耗而快速下降，致使液体培养基中出现缺氧状态，诱导莱茵衣藻氢酶表达而开始产生氢气，通过检测密封瓶子上方封存的空气中的氧气和氢气含量变化情况就能反映出莱茵衣藻的耗氧和产氢情况。结果表明(图7， A、 B)，转hemH-lba基因的莱茵衣藻培养体系中的氧气含量从进行产氢培养开始就很快下降，在第二天的时候就降到4.6%，第三天至第五天达到最低，为2.9%。未转基因的莱茵衣藻培养体系中的氧气含量在第二天仅降到9. 5%，直到第六天才达到最低，为3. 7%。转hemH-lba基因莱茵衣藻的产氢最大速率出现在第5天，为47. 0 ig—^hl 『、比未转基因莱茵衣藻在第7天的最大产氢速率16. 7iU *mg—^hl *h—'高2.8倍。相应的，转hemH-lba 基因的莱茵衣藻培养体系的最大产氢量为3. 3ml，比未转基因莱茵衣藻的最高值O. 8ml高4倍。 Western blot检测发现(图5)，转hemH-lba基因莱茵衣藻中重组hemH-Lba的 表达量在产氢培养的第3天开始被检测出来，在第5天达到最大，在第6天和第7天又迅 速下降到几乎检测不到。结果表明，转hemH-lba基因莱茵衣藻的氧气含量下降快与重 组hemH-Lba的表达量呈正相关；而且转hemH-lba基因莱茵衣藻的最大产氢速率出现在 产氢培养的第5天，这个时间与重组hemH-Lba的最大表达量出现的时间一致，说明重组 hemH-Lba对转基因莱茵衣藻的耗氧和产氢产生影响。
②在含硫培养基中对耗氧量和产氢量的影响 控制培养基中硫元素的浓度在一定范围内，可以部分恢复PSII的活性，但仍使呼 吸作用耗氧速率大于光合放氧速率，仍然可以使培养体系处于缺氧状态，但是光合电子效 率会增加，理论上可以增加产氢量(Woykoff等，1998 ;Melis等，2000)。
本发明的结果表明(图7， C、D、E、F、G、H)，在培养基中含有12. 5、25和50iiM硫 酸盐时，莱茵衣藻培养体系的产氢量没有提高，但转hemH-lba基因莱茵衣藻培养体系的氧 气含量下降速度仍然较快，在产氢培养第2天时候分别下降到5. 1%、8.9%和15.0%。未 转基因莱茵衣藻分别下降到10. 1%、11.9%和18. 2X;转hemH-lba基因莱茵衣藻培养体系 的氧气含量最低点分别为3. 1%、4. 1%和4. 3%，而且能维持在3. 1-4. 3%的低氧状态达两 天之久，比未转基因莱茵衣藻的最低点10. 1%、11.9%和11.2%分别低了 2. 26倍、1.90倍 和1. 60倍；而且未转基因莱茵衣藻因为培养基中含硫元素恢复了部分PSH活性而使氧气含 量在照光后迅速回升到21 % ，转hemH-lba基因莱茵衣藻的氧气含量在培养基中硫元素含 量大于25 ii M时才在照光后出现逐渐上升趋势。在培养基中含有12. 5、25和50 y M硫酸盐 时，转hemH-lba基因莱茵衣藻培养体系的最大产氢量分别为1. 2、0. 68和0. 41ml，而未转基 因莱茵衣藻培养体系的最大产氢量仅分别为0. 46、0. 47和0. 22ml。 本发明前期工作结果显示，单独在莱茵衣藻的叶绿体中表达豆血红蛋白的球蛋白 亚基基因lba可以降低培养体系内的氧气含量和使产氢量提高约50X。本发明的上述结果 表明，在莱茵衣藻叶绿体中增加表达合成豆血红蛋白血红素辅基的hemH基因能显著加快 莱茵衣藻产氢培养体系的氧气消耗速度和在培养体系内维持较低的氧气含量，能进一步提 高莱茵衣藻的氢气产量达4倍多。并且重组hemH-Lba在莱茵衣藻中的最大表达量出现时间 与其最大产氢速率出现的时间一致，说明转hemH-lba基因莱茵衣藻产氢培养体系中耗氧 速度的增力n、氧气含量的降低以及产氢量的增加是与重组hemH-Lba的表达联系在一起的。 提高该转基因莱茵衣藻中hemH-Lba的表达量，进一步增加产氢培养体系内的耗氧能力，本 发明方法可以用于进一步提高微型绿藻和蓝藻的产氢能力。 上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内， 所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。
权利要求
豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法，步骤如下(1)莱茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培养A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；B、培养莱茵衣藻藻种(a)莱茵衣藻正常培养条件温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons m-2s-1)；50～100ml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐(Tris-Acetate-Phosphate简称TAP)培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、莱茵衣藻产氢培养条件在缺硫培养基中进行，把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons m-2s-1)，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；D、慢生大豆根瘤菌培养条件用pH 7.2的酵母提取液-甘露醇液体培养基，温度28±1℃、黑暗条件下200rpm转速震荡培养，至对数生长期，吸光度OD600值达到0.6-0.8，1％接种继代；E、用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛5×1/8(OD)，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；(2)豆血红蛋白hemH基因和lba基因的克隆A、取序列号M92427慢生大豆根瘤菌hemH基因和序列号V00453大豆lba基因；B、分别提取慢生大豆根瘤菌的总DNA，提取大豆的总RNA，再对大豆总RNA进行浓度和纯度检测，反转录成cDNA；C、分别克隆hemH基因和lba基因；反应条件为94℃预变性5min，一个循环；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸1.5min；共30个循环；72℃延伸15min；反应产物纯化回收；C、测序鉴定hemH基因、lba基因的特异性引物hemH基因的特异性引物为hemH-P15’-atgtcgaccgccgctc-3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；hemH-P25’-tatatccagccctggagctcgcg-3’，斜体表示SacII酶切位点序列；lba基因的特异性引物为Lba-P15’-c aaa ttt aaa ttt atg gtt gct ttc actgag-3’，斜体表示SmalI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；Lba-P25’-tcc ata cta att atg cct tct taa tag c-3’，斜体表示SacI酶切位点序列；(3)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建A、用限制性内切酶SmalI和SacI酶切克隆得到的大豆lba基因片段和载体cg40，将纯化的lba基因片段通过上述酶切位点用T4 DNA连接酶连接质粒cg40中的aadA基因，形成aadA-lba融合基因，得到载体cg401-1-lba；用SacII酶切位点将hemH基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401-1-lba中aadA基因之后和lba基因之前，形成aadA-hemH-lba融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-hemH-lba；转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA；(4)莱茵衣藻叶绿体的转化A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃下3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons·m-2·s-1)和25±1℃条件下培养24小时；用基因抢轰击转化；真空度9.48192×104Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×106Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401-1-hemH-lba DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，在25±1℃和100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons·m-2·s-1)的连续光照条件下，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；(5)分析转基因莱茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表达A、hemH-lba基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测a、hemH基因和lba基因通过同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上，以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物为8229bp；未整合的PCR产物是5400bp；与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-P15’-aga cag cca aca ttt tgtta-3’；cpDNA-P25’-gct tca aaa aca aaa tca aa-3’；b、取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl NET重悬沉淀；加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％SDS，混匀37℃水浴12小时，冰上冷却；加入200μl 5mol/L KAc，静置离心；上清中加入等体积25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl TE缓冲液，用于PCR检测；B、转基因莱茵衣藻中hemH基因和lba基因转录的检测取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞，提取总RNA，反转录cDNA；利用hemH基因和lba基因的特异性引物和克隆hemH基因和lba基因所述的PCR条件扩增，进行hemH基因和lba基因转录水平的检测；C、转基因莱茵衣藻中亚铁螯合酶和Lba表达量的检测a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液50mM Tris/HCl pH 8.3plus 1％Triton-X 100；上样缓冲液0.25M Tris-HCl，pH 8.0；25％ glycerol；7.5％SDS；0.25mg ml-1 bromophenolblue；12.5％(v/v)2-mercaptoethanol；b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，快速室温3000rpm离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μl β-巯基乙醇，液氮冻融三次；4℃条件下离心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上样缓冲液，用10％的分离胶和5％的浓缩胶进行凝胶电泳，转PVDF膜；分别用抗豆血红蛋白亚铁螯合酶多克隆抗体和抗大豆Lba多克隆抗体做性免疫杂交检测，对HRP标记的抗体进行化学发光检测；(6)分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响A、用TU-1901双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃下12000rpm离心10min；取上清，测定OD665及OD649的吸光值；C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L叶绿素Chl(mg/l)＝20.04×OD649+6.10×OD665；(7)分析豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响A、缺硫培养基中耗氧量和产氢量的检测B、含硫培养基中耗氧量和产氢量的检测。FSA00000045598700021.tif,FSA00000045598700022.tif,FSA00000045598700023.tif,FSA00000045598700024.tif
全文摘要
本发明涉及生物制氢技术，一种豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法。现有莱茵衣藻制氢的缺点是莱茵衣藻氢酶对氧气敏感，容易受氧气的抑制而失去活性；限制了衣藻的产氢效果。本发明公开了一种豆血红蛋白亚铁螯合酶基因和球蛋白亚基基因在莱茵衣藻产氢中的应用，将豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba构建在莱茵衣藻叶绿体表达载体中，并将该表达载体转入莱茵衣藻叶绿体中，使hemH-lba基因在莱茵衣藻叶绿体中表达。本发明的优点是转化的莱茵衣藻的密闭培养体系中氧气含量下降地明显比未转基因莱茵衣藻快，并且氧气含量能维持较低水平，产氢量明显增加。
文档编号C12N15/79GK101775407SQ20101011501
公开日2010年7月14日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者吴双秀, 王全喜, 王荣荣, 许丽丽, 黄瑞 申请人:上海师范大学