重组菌丝霉素的制备及其应用的制作方法

专利名称：重组菌丝霉素的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种重组菌丝霉素的制备方法及其应用，具体涉及酵母基因工程菌制备重组菌丝霉素及其在治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域的应用。
背景技术：
菌丝霉素(Plectasin)是Mygind等从真菌(腐生子囊菌，the saprophytic ascomycetePseudoplectania nigrella)中分离得至丨J首例防御素(Mygind et al. ,Nature, 2005,437 :975 980)。菌丝霉素基因开放阅读框编码一个95个残基长的肽，由一个信号肽序列(残基1-2 ，一个前片断(残基23-5 和一个40个残基的C端区域(残基56-95)，与几种无脊椎动物防御素存在50-55%序列相似性。与哺乳动物的α-或β-防御素没有序列相似性。菌丝霉素，有六个半胱氨酸和五个赖氨酸，和一个区别的四肽(DEDD)模式。它的净电荷在+1到+3之间变化，取决于它的两个组氨酸的离子状态。其高级结构包含一个α-β 模型，由一个α-螺旋和两个反平行的β —折叠组成，由三个二硫键稳定(Cys4-Cys30， Cysl5-Cys37,Cysl9-Cys39)。菌丝霉素高抗革兰氏阳性菌、无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，在治疗革兰氏阳性菌病方面具有相当大的潜力，是具有治疗潜能的新的肽抗生
ο直接从P. nigrella菌丝体中提取天然菌丝霉素时，分离提纯存在一定的困难，而且产量有限。化学合成和基因工程法是获得菌丝霉素的主要手段，但化学合成菌丝霉素不仅成本高，而且空间结构难以与天然菌丝霉素完全一致，其分子内含有3对二硫键，难以保证多肽正确配对，限制其抗微生物活性的发挥。通过基因工程在微生物中表达抗菌肽基因是获得菌丝霉素的有效途径。Mygind等2005年从P. nigrella菌丝体中克隆到菌丝霉素的cDNA，将其转化将到Aspergillus oryzae表达系统中，分泌出具有抗菌活性的菌丝霉素 (Mygind et al.，Nature, 2005,437 :975 980)。目前菌丝霉素的表达仅限于在黑曲霉中异源表达，迄今未见其在酵母中的表达研究报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种重组菌丝霉素的制备及应用方法，该方法利用酵母真核表达系统对菌丝霉素基因进行表达，所制备的重组菌丝霉素应用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域。本发明采用如下技术方案，其特征在于该方法，包括以下步骤(一 )菌丝霉素基因的设计和合成所述的菌丝霉素基因为编码菌丝霉素成熟肽的任何核苷酸序列，优选编码序列可根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用的偏爱性(http//www. kazusa. or. jp/codon/)优化设计，所得菌丝霉素基因具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，通过人工方法直接合成获得。
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( 二)重组菌丝霉素表达载体的构建所述的表达载体衍生于pPIC系列表达载体，优选的，所述的表达载体采用 pPICZa A。在菌丝霉素基因的5'-端设计限制性内切酶》101酶切位点，并保留了》101酶切位点后的酵母Kex2切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割获得重组 Plectasin，在基因3'-端设计TAATAA终止子序列及)(ba I酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，菌丝霉素基因片段经 Xho I和)(ba I双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pPICZ α A上，构建重组表达载体 pPICPlectasin。(三)重组菌丝霉素酵母的构建所述的酵母优选为毕赤酵母，所述的毕赤酵母优选毕赤酵母X-33。重组表达载体pPICPlectasin经内切酶Riie I线性化处理，电击转化毕赤酵母 X-33，将电击后的混合液涂布在含ΙΟΟμ g/ml Zeocin的YPDS平板上，29°C培养至出现菌落，经菌落PCR鉴定阳性转化子，甘油管保存阳性转化子。(四)重组菌丝霉素的表达将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至OD = 5-6,离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其OD值达到1. 0，在下进行甲醇诱导。每隔M小时补加甲醇至甲醇终浓度为0. 5%，在摇瓶水平筛选表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌进行高密度发酵。所述的高表达重组菌丝霉素酵母菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，该菌株已于2010年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，其保藏号为CGMCC No. 3564。将筛选获得的表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌Pichia pastoris X33 pPICPlectasin用5L发酵罐进行高密度发酵挑取单菌落到YPD培养基中培养至菌体浓度 0D_在4 6之间，得到一级种子培养液；按接种量(V/V)转接至YPD培养基中培养至菌体浓度0D_约3. 3，得到二级种子培养液；按照10%接种量接入到2 L上罐基料培养基中。菌体初生长阶段转速为900rpm，pH 5. 0，温度^°C，通气量8L/min，生长至葡萄糖基本耗尽。进入补料生长阶段流速35%，补加50%葡萄糖(含12%。PMT1)，转速调至lOOOrpm， pH调至5. 5，温度29°C，通气量8L/min，添加时间5h，共补加200mL。补料结束后，饥饿Ih 后，进入甲醇过渡诱导阶段，甲醇的添加量由第一小时的lml/h/L逐渐增加到第六小时的 5.9ml/h/L，接着以恒定的流速(5.9ml/h/L)，在转速llOOrpm，pH 5. 5，温度，通气量 8L/min，溶氧约40%，连续诱导120h，发酵结束上清中总蛋白浓度达到7 μ g/mL，收集上清透析冻干备用。(五)重组菌丝霉素的纯化重组菌丝霉素的凝胶过滤层析分离步骤色谱柱材为葡聚糖凝G-25， 纯化条件柱床体积40mL，径高比1 10，上样量为lmg/mL，用去离子水进行洗脱，流速为 0. 5mL/min,得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干。将凝胶过滤层析分离所得的重组菌丝霉素冻干物溶解在超纯水中(lmg/mL)，使用 C18(5ym,4. 6mmX 250mm)色谱柱，以含0. 1 % TFA的乙腈水溶液为流动相，以梯度洗脱模式进行分离(8% 80%，0. 8mL/min)，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干，获得高纯度的重组菌丝霉素，MALDI-T0F质谱仪测定其分子量是否与理论分子量吻合。(六)重组菌丝霉素的应用重组菌丝霉素无溶血性，具有较好的pH稳定性、热稳定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长，与万古霉素具有相同抗肺炎链球菌活性，优于青霉素，因此，在治疗革兰氏阳性菌病尤其是链球菌病方面具有相当大的潜力，具有抗菌药物开发价值。通过附图和实施例对本发明具体实施方式
进行说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。


图1摇瓶水平下重组菌丝霉素表达的Tricine-SDS-PAGE检测图泳道1-6 分别为诱导 0，24，48，72，96，120h 样品；泳道7:protein marker 分子量从上至下依次为94. 0，66. 2，45. 0，35. 0，26. 0， 20. 0，14. 4kDa图2.纯化的重组菌丝霉素的MALDI-TOF MS3.不同pH处理对重组菌丝霉素的抑金黄色葡萄球菌ATCC 25923活性影响1-5 重组菌丝霉素分别在 Glycin-HCl buffer (pH 2. 0)，sodium acetate buffer(pH 4.0), sodiumphosphate buffer(pH 6. 0), tris-HCl buffer(pH 8. 0)禾口 Glycin-NaOH buffer (pH 10. 0)下的抑菌活性6-10 分别为对应缓冲液 Glycin-HCl buffer (pH 2. 0)，sodium acetate buffer(pH 4.0), sodiumphosphate buffer(pH 6. 0), tris-HCl buffer(pH 8. 0)禾口 Glycin-NaOH buffer (pH 10. 0)的抑菌活性图4.不同温度处理对重组菌丝霉素的的抑金黄色葡萄球菌ATCC 25923活性影响1-4 重组菌丝霉素分别在30，60，80，100°C中处理1小时下的抑菌活性5-8 是缓冲液分别在30，60，80，100°C中处理1小时下的抑菌活性图5.不同蛋白酶处理重组菌丝霉素的抑金黄色葡萄球菌ATCC 25923活性影响1-3:分别为用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶处理后的菌丝霉素的抑菌活性4 未处理的对照；5-7 为分别只含胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的对照图6.菌丝霉素对兔血红细胞的溶血测验结果图7. Plectasin表达产物对金黄色葡萄球菌抑菌活性A :20 μ L 重组表达产物(1280yg/mL) ；B :10 μ L 青霉素标准品(80 μ g/mL) ；C 10 μ L氨苄青霉素钠盐(80 μ g/mL) ；D 对照20 μ L无菌水图8. Plectasin表达产物对表皮葡萄球菌抑菌活性A :20 μ L 重组表达产物(1280 μ g/mL) ；B :40 μ L 重组表达产物(1280 μ g/mL) ；C IOyL青霉素标准品(320 μ g/mL) ；D =IOyL氨苄青霉素钠盐(320 μ g/mL) E 对照20 μ L无菌水
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如“分子克隆实验室手册” (New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。本发明的实施例中使用的毕赤酵母X33及pPIC系列表达载体pPICZ α A均购自 hvitrogen公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)，限制性内切酶购自 NEB 公司(New England Biolabs)。实施例1菌丝霉素基因工程菌的构建1. 1基于酵母偏爱密码子设计Plectasin的基因根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用的偏爱性(http://WWW. kazusa. or. jp/codon/)人工设计Plectasin的基因，所得序列如SEQ ID NO. 1所示。1. 2重组菌丝霉素表达载体的构建在Plectasin基因的5’ -端设计了 Plectasin基因中不具备但载体多克隆位点上具有的限制性内切酶》ιοΙ酶切位点，并保留了 BioI酶切位点后的酵母Kex2切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割，获得重组Plectasin，在基因3’ -端设计TAATAA终止子序列及^CbaI酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建所设计用于表达的Plectasin基因，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，Xho I和)(ba I双酶切后克隆至》ιοΙ和)(ba I双酶切后的表达载体pPICZ α A上，构建重组表达载体 pPICPlectasin,测序正确后转化并保存在大肠杆菌DH5 α中。1. 3重组毕赤酵母的转化和筛选将鉴定正确的重组表达载体pPICPlectasin经内切酶Riie I线性化处理，电击转化(1.2Κν，25μΡ，400Ω)处理好的感受态毕赤酵母Χ_33，电击结束后，加入冰预冷的 IM山梨醇，混勻后转入离心管中，30°C静止浊；取适量样品涂YPDS平板(含100yg/mL Zeocin)，倒置培养至出现菌落。根据优化的菌丝霉素基因序列设计上下游引物Fl, -GTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCA-3~ ；Rl，-ACCACCCTTAGCACAGTAACCACCCTTGTAACCCTTAATA-3~。煮冻煮菌落PCR法检测转化子。琼脂糖凝胶(1 % )电泳检测PCR结果，甘油管保存阳性转化子。实施例2重组菌丝霉素的诱导表达2. 1摇瓶水平下的诱导表达将筛选获得的表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌用以甘油为碳源的BMGY培养基下250rpm振荡培养至OD6c 为2-6时；5000rpm离心5min，收集菌体，用含甲醇的 BMMY培养基重悬菌体至0D_为1. 0，下250rpm进行诱导培养；每24h加甲醇至终浓度为0. 5%，诱导120h时取发酵液离心，收集上清冻干备用。如图1所示，诱导表达后"Tricine-SDS-PAGE电泳表明，分泌蛋白中含有4. 4kDa肽。2.2 5L发酵罐水平下的诱导表达使用Sartorius Bplus 5L发酵罐(德国赛多利斯公司)对摇瓶水平筛选的高表达菌株进行高密度发酵。取冻存的甘油保藏菌株，YPDS平板(含lOOyg/mL Zeocin)划线，挑取Pichia pastoris X33pPICPlectasin单菌落到YPD培养基中，，250rpm，活化培养至菌体浓度 OD6tl。在4 6之间，制备一级种子培养液；按接种量(V/V)转接至YPD培养基中，29°C， 250rpm,培养至OD6tltl约3. 3，制备二级种子培养液；按照10%接种量接入到2L上罐基料培养基中(每升基料培养基含45g葡萄糖， 50g磷酸二氢铵，15g七水硫酸镁，6g磷酸二氢钾，0. 4g硫酸钙，1. 5g氢氧化钾，并含有
4.8ml/L微量元素溶液PMTl (每升微量元素溶液含65g七水硫酸铁，20g氯化锌，6g五水硫酸铜，3g五水硫酸锰，0. 5g氯化钴，0. 2g钼酸钠，0. 08g碘化钾，0. 02g硼酸，0. 2g生物素， 5ml浓硫酸)，发酵初始体积为2.2L。菌体初生长阶段转速为900rpm，pH 5.0，温度^°C， 通气量8L/min，生长至葡萄糖基本耗尽(DNS法检测，约17h)，此时菌体湿重为87mg/ml。进入补料生长阶段流速35%，补加50%葡萄糖(含12%。PMT1)，转速调至1000rpm，pH调至
5.5，温度29°C，通气量8L/min,添加时间5h,共补加200ml。补料结束后，饥饿Ih后，菌体湿重为186mg/ml。进入甲醇过渡诱导阶段，甲醇的添加量由第一小时的lml/h/L逐渐增加到第六小时的5. 9ml/h/L，接着以恒定的流速(5. 9ml/h/L)，在转速IlOOrpm, pH 5. 5，温度 ^°C，通气量8L/min，溶氧维持在40%左右的条件下，连续诱导120h，发酵结束时菌体湿重为330mg/ml，上清中蛋白浓度达到7 μ g/mL收集上清透析冻干备用。实施例3重组菌丝霉素的纯化3. 1重组菌丝霉素的凝胶过滤层析分离色谱柱材为葡聚糖凝胶kphadex G_25 (购自华美生物工程公司)，分离范围 1000-5000Da，纯化条件柱床体积40mL，径高比1 10，用去离子水进行洗脱，流速为 0. 5mL/min，检测波长280nm，纯化后经抑菌试验检测，收集抑菌活性最高的组分进一步进行反相高效液相色谱。3. 2重组菌丝霉素的反相高效液相色谱色谱柱为XBridge BEH300 C18 (5 μ m, 4. 6匪X 250匪)，使用含TFA的水和乙腈为流动相，以梯度洗脱模式进行分离，将样品溶解在超纯水中(lmg/mL)，0. 45 μ m滤膜过滤， 上样量为20 μ L，以含0. 1 % TFA的乙腈水溶液，逐渐增加乙腈的体积百分比，从8 %到80 % 按0. 8mL/min的流速洗脱，收集纯化的重组肽，冻干后，进行抑菌检测，收集抑菌活性最高的组分进一步进行MALDI-T0F质谱分析(中国科学院生物物理研究所蛋白质组学平台)， 测定纯化的Plectasin分子量0404. 256Da)与Plectasin的理论分子量0407. 9Da)相同 (图幻，获得高纯度的重组菌丝霉素。实施例4重组菌丝霉素的性质4. 1重组菌丝霉素的pH稳定性将纯化的重组菌丝霉素分别溶解到IOOmM不同pH的缓冲液中=Glycin-HCl buffer(pH2. 0), sodium acetate buffer(pH 4.0), sodium phosphate buffer(pH 6. 0), tris-HCl buffer (pH 8.0) and Glycin-NaOH buffer (pH 10. 0)。采用琼脂扩散抑菌试验鉴定重组菌丝霉素的pH稳定性，将保存的金黄色葡萄球菌ATCC25923接种于30mL MHB培养基中，37°C摇床培养过夜；取培养物0. 5mL转接入新鲜的50mL MHB中，继续37°C培养2. 5h 至对数生长中期；用新鲜无菌MHB培养基调整OD5tltl至0. 4 (1. 44X 109CFU/mL)，事先准备好灭菌的42°C的MHA培养基，向50mL该培养基中加入上述菌液500 μ L，立即轻轻混勻，到入培养皿中；待培养基凝固后，在培养基表面放置牛津杯，加入溶解纯化重组菌丝霉素的不同 PH缓冲液样品，将平板正面向上37°C培养12 Mh，观察抑菌效果。结果发现，重组菌丝霉素具有较好的PH稳定性，不同的pH缓冲液对纯化产物抑菌活性的影响不大(图3)。4. 2重组菌丝霉素的热稳定性将重组菌丝霉素分别溶解于的IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0)中，分别在30°C、60°C、 80°C和100°C下处理lh，采用琼脂扩散抑菌试验鉴定重组菌丝霉素的热稳定性，鉴定的模式菌采用金黄色葡萄球菌(S. aureus)，结果发现，重组菌丝霉素具有较高的热稳定性，菌丝霉素在30°C和60°C处理Ih可保持高的抑菌活性，在80°C处理后活性有所降低，大约是原抑菌活性的80%，即使是在100°C下处理lh，具有原抑菌活性50% (图4)。4. 3重组菌丝霉素的抗蛋白酶消化稳定性将重组菌丝霉素分别于含有胃蛋白酶pH2.0的Glycin-HCl缓冲液，木瓜蛋白酶 pH 6. Osodium phosphate缓冲液，pH 8.0 tris-HCl缓冲液中37°C温浴4h，采用琼脂扩散抑菌试验鉴定重组菌丝霉素的抗蛋白酶消化稳定性，鉴定的模式菌采用金黄色葡萄球菌 (S. aureus)，未用蛋白酶处理的纯化产物和只加蛋白酶的缓冲液作为对照。结果发现，菌丝霉素对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的降解具有较强的抗性，处理4h后依然保持较高的抑菌活性，而用胰蛋白酶处理4小时后发现，菌丝霉素的抗菌活性基本丧失(图5)。实施例5重组菌丝霉素的溶血性使用IOmL真空采血管(含有肝素钠作为抗凝剂)在日本长耳白兔的耳边缘静脉采血，IOmM磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.3)重复洗涤细胞三次，然后于4°C，1500rpm，离心 lOmin，至上清无色透明。取180 μ L红细胞IOmM PBS悬浮液(红细胞的浓度大约为2% )， 与20 μ L不同倍比稀释的纯化重组菌丝霉素混合，混合体系在37°C保温30min后，1500rpm 离心5min。取上清转移至96孔板，使用酶标仪在540nm下测定吸光值。溶血百分比0%和 100%的值分别使用IOmM PBS和0.1% (v/v)Triton X-100在相同条件下同步测定。每个测试做三个平行，取测定值的平均值。结果发现与对照相比，菌丝霉素无溶血性(图6)。实施例6重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌的抑菌活性实验采用琼脂扩散法测定重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌的抑菌活性，测试菌种金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923、表皮葡萄球菌S. epidermidis 26069 ；培养基MH肉汤培养基、MH肉汤琼脂培养基。取经过透析，G-25葡聚糖凝胶纯化的Plectasin发酵产物溶于无菌水水中(1280 μ g/ml)，同时配制浓度相同浓度(1280yg/ml)的氨苄青霉素钠盐、青霉素溶液，将配置的抗生素及肽溶液进行2倍梯度稀释，其浓度分别为1观0、640、 320、160、80、40、20、10、5、2. 5,1. 25,0. 625 μ g/ml 挑取金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌的单菌落至MH培养基中，37度摇培至OD6tltlnm为0. 4，向15mL两种菌相应的培养基里加入 150 μ L的上述菌液，轻轻混勻，倒入培养皿中，待培养基凝固，在培养基表面放置牛津杯，加入20 μ L(USOygAil)的肽溶液，其余加入10μ L的(80 μ g/ml)抗生素作为对照，其中金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌分别用氨苄青霉素钠盐、青霉素作为对照，37度培养16-18 小时，观察抑菌活性。结果表明对重组表达的菌素霉素进行抑菌圈实验表明其对金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC25923 (图7)、表皮葡萄球菌S. epidermidis 26069(图8)均存在抑菌活性。
实施例7重组菌丝霉素的应用本发明的重组菌丝霉素可应用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要书及其等同物界定。
权利要求
1.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素基因的设计。根据菌丝霉素成熟肽氨基酸序列，按毕赤酵母偏爱密码子，优化设计出的菌丝霉素基因具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素表达载体的构建。在如1所述的菌丝霉素基因的5'-端设计限制性内切酶Bio I酶切位点，并保留了 Bio I酶切位点后的酵母Kex2 切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割，在基因3'-端设计TAATAA终止子序列及)(bal酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建，经Β ο I和)(ba I双酶切后克隆至经相同双酶切后的表达载体PPICZ α A上，构建重组表达载体pPICPlectasin，经测序正确。
3.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素酵母的构建。重组表达载体 pPICPlectasin经内切酶Riie I线性化处理，电击转化毕赤酵母X_33，将电击后的混合液涂布在含ΙΟΟμ g/ml Zeocin的YPDS平板上，29°C培养至出现菌落，经菌落PCR鉴定阳性转化子，甘油管保存阳性转化子，摇瓶水平筛选高表达重组菌丝霉素毕赤酵母。
4.如权利3所述的高表达重组菌丝霉素毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris X33pPICPlectasin，该菌株已于2010年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，其保藏号为 CGMCCNo. 35640
5.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素的高密度发酵表达。将筛选获得的表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌Pichia pastoris X33 pPICPlectasin用5L发酵罐进行高密度发酵挑取单菌落到YPD培养基中培养至菌体浓度0D_在4 6之间，得到一级种子培养液；按接种量(V/V)转接至YPD培养基中培养至菌体浓度0D600约3. 3，得到二级种子培养液；按照10%接种量接入到2L上罐基料培养基中。菌体初生长阶段转速为900rpm，pH 5. 0，温度，通气量8L/min，生长至葡萄糖基本耗尽。进入补料生长阶段流速35%，补加50%葡萄糖(含12%。PMT1)，转速调至1000rpm，pH调至5. 5，温度^°C，通气量8L/min， 添加时间证，共补加200mL。补料结束后，饥饿Ih后，进入甲醇过渡诱导阶段，甲醇的添加量由第一小时的lml/h/L逐渐增加到第六小时的5. 9ml/h/L，接着以恒定的流速(5. 9ml/h/ L)，在转速llOOrpm，pH 5. 5，温度，通气量8L/min，溶氧约40 %，连续诱导120h，发酵结束上清中总蛋白浓度达到7 μ g/mL，收集上清透析冻干备用。
6.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素的纯化。重组菌丝霉素的凝胶过滤层析分离步骤为色谱柱材为葡聚糖凝胶kphadex G-25，纯化条件柱床体积40mL，径高比 1 10，上样量为lmg/mL，用去离子水进行洗脱，流速为0.5mL/min，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干。将凝胶过滤层析分离所得的重组菌丝霉素冻干物溶解在超纯水中(lmg/mL)，使用C18 (5 μ m，4. 6mmX 250mm)色谱柱，以含0· TFA的乙腈水溶液为流动相，以梯度洗脱模式进行分离(8% 80%，0. SmL/min)，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干，MALDI-T0F质谱仪验证其分子量与菌丝霉素理论分子量吻合。
7.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素的应用。重组菌丝霉素无溶血性，具有较好的PH稳定性、热稳定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌和的生长，因此，重组菌丝霉素在治疗革兰氏阳性菌病尤其是链球菌病方面具有相当大的潜力，具有潜在的抗菌药物开发价值。
全文摘要
本发明公开重组菌丝霉素的制备及其应用，按毕赤酵母偏爱密码子设计的菌丝霉素基因具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，构建重组表达载体pPICPlectasin和基因工程菌毕赤酵母X33pPICPlectasin(CGMCC No.3564)，经高密度发酵，上清中总蛋白浓度达到729μg/mL，上清透析冻干依次进行凝胶过滤层析和反相高效液相色谱，获得高纯度重组菌丝霉素，重组菌丝霉素无溶血性，具有较好的pH稳定性、热稳定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长，可用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌，具有潜在的抗菌药物开发价值。
文档编号C12R1/84GK102191255SQ201010115149
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者张军, 杨雅麟, 滕达, 王少然, 王建华, 田子罡 申请人:中国农业科学院饲料研究所