专利名称：Vangl2突变基因及其检测方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因检测技术领域，涉及VANGL2突变基因，具体涉及神经管畸形相关 VANGL2突变基因及其检测方法，尤其是VANGL2基因三个潜在致病突变位点的检测，本发明还提供了该检测方法的潜在用途，即应用于神经管畸形孕前预警基因检测及相关基因芯片中。
背景技术：
神经管畸形(Neural tube defects, NTDs)是由于胚胎发育早期(通常为受精后观天)因神经管不闭合或闭合不全所造成的一组严重出生缺陷。常见为开放型，即受累神经组织暴露于体表，主要包括无脑儿和脊柱裂。前者因头部神经管不闭合，表现为严重脑发育不全、发育颅骨损伤，一般在出生前或出生后一段时间内死亡，而很多脊柱裂患儿可以存活，却造成终身残疾和生活质量低下，给社会、家庭和个人带来沉重的精神压力和经济负担。神经管畸形世界范围内的平均发病率为1-2%。，而我国是神经管畸形的高发国之一，高发区山西省的发病率据1996年的统计结果高达9. 7%。，开展三级预防后到2004年仍然有 3. 5%。，严重影响我国优生优育和人口质量。Kibar Z.等人2001年发现神经管畸形动物模型圈尾小鼠是由于Vangl2基因的错义突变造成的。Vangl2基因编码了一个胞内区含有PDZ结合位点的四次穿膜蛋白，在神经管闭合过程中发挥重要作用。2005年Doudney K.在66名神经管畸形患者中进行的筛查没有在VANGLl或VANGL2基因中找到突变。2007年Kikir Z.等在新英格兰医学杂志上发表文章，报道了他们在神经管畸形患者VANGLl和VANGL2突变筛查中发现了 3个引起VANGLl 氨基酸序列改变的突变，但研究中并未找到VANGL2上的基因突变。目前国内外的神经管畸形检测/预警技术，都是在孕后，胎儿发育到一定程度(妊娠11-20周)，采用甲胎蛋白含量测定、B超或彩超观察、胎儿镜、X光照射等方法对神经管畸形进行检测，达不到孕前预警的目的，而且有些方法对胚胎发育有一定的影响。因此需要寻求能够更加早期、安全、灵敏的检测方法对神经管畸形的发生进行预警。VANGL2基因突变位点的检测将有利于进一步认识神经管畸形的发生机理，并通过在临床上开展孕前VANGL2 突变筛查工作对神经管畸形的发生进行预警。
发明内容
本发明的目的在于提供神经管畸形相关VANGL2突变基因及其检测方法，尤其涉及VANGL2基因三个潜在致病突变位点的检测。本发明通过检测VANGL2基因突变能进行神经管畸形孕前早期预警。本发明的进一步目的是提供上述检测方法的用途，所述检测方法能应用于神经管畸形孕前预警基因检测及相关基因芯片中。本发明通过对从我国神经管畸形高发区山西收集到的神经管畸形散发和家系患者中进行的VANGL2基因突变筛查发现了 3个引起氨基酸序列改变的VANGL2突变，经体外实验证实所述的突变的VANGL2部分或完全丧失了与下游DVL家族基因的结合能力。结果提示，VANGL2基因突变是潜在的神经管畸形致病风险因素。可建立涉及VANGL2基因潜在致病突变位点的检测方法以及应用于神经管畸形孕前预警基因检测及相关基因芯片中，应用于神经管畸形孕前早期预警措施。本发明中，所述的神经管畸形相关基因VANGL2的突变基因，该VANGL2突变基因含有VANGL2基因序列，并且还含有18487C — T，20598C — T或MM9T — C杂合或纯合突变中的一种或一种以上。上述神经管畸形相关基因VANGL2突变基因的编码蛋白质具有84S — F，353R — C 或者437F — S突变位点中的一种或一种以上。本发明提供了一种检测上述神经管畸形相关基因VANGL2突变基因的方法。具体而言，本发明提供的检测神经管畸形相关基因VANGL2突变基因的方法，其包括从待测样品中得到核苷酸序列与VANGL2正常基因的序列进行比较，核对突变是否为 18487C — T, 20598C — T 或 24549T — C 中的一种。所述检测方法主要包括以下步骤1)提取待检测样本中的DNA ；2)以该DNA为模板，以针对VANGL2基因或者VANGL2突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；4)将核苷酸序列与VANGL2正常基因的序列进行比较，确定是否有18487C — T， 20598C — T 或 24549T — C 突变。所述测出PCR反应产物的核苷酸序列组成可以使将PCR反应产物在测序仪测序或进行SNaPshot分型。进一步地，通过数据库BLAST比对功能，按照正常读码框架进行翻译以确定是否存在84S — F，353R — C或者437F — S氨基酸突变位点。本发明中，待检测样本可为血液、唾液、体液或者毛发、皮肤组织等。另外，还可以用其他方法实现突变位点的检出，包括=SNaPshot,荧光定量PCR，变性高效液相色谱 (dHPLC)技术，限制性片段长度多态性(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP)，芯片检测等。本发明的进一步目的是提供了一种用于检测神经管畸形相关基因VANGL2突变基因的试剂盒，其主要包括以针对VANGL2基因编码区或者上述VANGL2突变基因附近编码区设计的PCR引物，SNaPshot延伸引物，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲体系和延伸反应体系。本发明的进一步目的是提供所述的神经管畸形相关基因VANGL2的突变基因在应用于神经管畸形的孕前预警基因检测或制备基因芯片中用途。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
图1 VANGL2正常与突变基因测序结果。图2 VANGL2正常与突变基因SNaPshot检测结果。
具体实施例方式下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring harbor Labortory Press，1989)，分子克隆实验室指南(第三版，科学出版社，200 中所述的条件，或按照生产厂商所建议的条件。实施例1山西神经管畸形高发地区VANGL2基因突变的检测一、提取待检测样本中的DNA对象在中国神经管畸形(NTDs)高发地区山西收集一个NTD家系患者，包括2例 NTD患者，4例流产胎儿，21例正常家庭成员，另有无亲缘关系的508例正常对照。对NTD胎儿进行病理解剖确诊，胎儿样本的采集通过伦理委员会批准并获得胎儿父母的同意，由胎儿父母签署知情同意书，对所有正常家庭成员及对照参与者进行详细体格检查，在签署知情同意书后每人采集血样5ml。基因组DNA提取采用常规酚氯仿抽提法。具体步骤如下1)抗凝血用TE做1倍稀释，取SOOul稀释后的样品于2毫升印pendorf管，加入 8ul proteinase KQOmg/ml)，1/10 体积 10% SDS，55°C温育过夜。2)在消化液中加入等体积Tris饱和酚，然后轻柔的来回颠倒印pendorf管，混勻 10分钟。3) 12000rpm室温离心5分钟。4)用200ul吸头缓慢的将上层水相吸入对应编号的新离心管，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。5)在水相中加入等体积(400ul)酚-氯仿，轻柔的上下颠倒混勻5分钟。6) 12000rpm室温离心5分钟，重复步骤4。7)在水相中加入等体积氯仿-己戊醇04 1)，轻柔的上下颠倒混勻5分钟，静置1分钟。8) 12000rpm室温离心5分钟，重复步骤4。9)水相加入1/10体积3M NaAC (冰醋酸调PH到5. 2),2.5倍体积水相的(冰冻) 无水乙醇，来回颠倒充分混勻，置_20°C，沉淀30分钟。10) 12000rpm，4°C，离心 10 分钟。11)弃上清，加入750ul 75%乙醇，稍做摇晃，12000rpm离心5分钟。12)轻柔地弃上清，在吸水纸上扣干乙醇，55°C烘干残余乙醇，根据沉淀的多少加入80-IOOuITE溶解DNA。4°C放置48小时，或50°C水浴促溶4小时。13) 1 %琼脂糖电泳检测，Nanodrop定量，标化到20ng/ul，_20°C保存。二、VANGL2基因编码区PCR扩增1.引物序列VANGL2E3F1 :5，-TTCCCATGTGTTCTTCTCTGTCTC-3‘
VANGL2E3R1 :5’ -AGCAGGAAAACCAGCACCAT-3‘ VANGL2E5F 5' -TTCCTATGGCCTCTCCCAGA-3’VANGL2E5R :5’ -CAGCAACGGAAAACAAGCAC-3， VANGL2E7F :5’ -GCTCAGGGACGTCCTTCTTG-3’ VANGL2E7R :5’ -AGAAGAAGAAGGGTGGCAGGA-3‘
2.反应体系反应体系
权利要求
1.一种神经管畸形相关基因VANGL2的突变基因，其特征在于，其含有VANGL2基因序列，还含有18487C — T，20598C — T或MM9T — C杂合或纯合突变中的一种或一种以上。
2.根据权利要求1所述的神经管畸形相关基因VANGL2的突变基因，其特征在于，所述 VANGL2突变基因的编码蛋白质具有84S — F，353R — C或者437F — S突变位点中的一种或一种以上。
3.—种检测如权利要求1所述的VANGL2突变基因的方法，其特征是，从待测样品中得到核苷酸序列与VANGL2正常基因的序列进行比较，核对突变是否为18487C —T， 20598C — T 或 MM9T — C 中的一种。
4.根据权利要求3所述的检测VANGL2突变基因的方法，其特征是，所述检测方法包括以下步骤1)提取待检测样本中的DNA；2)以该DNA为模板，以针对VANGL2基因或者VANGL2突变基因附近的编码区设计的PCR 引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；4)将核苷酸序列与VANGL2正常基因的序列进行比较，确定是否有18487C—T， 20598C — T 或 24549T — C 突变。
5.根据权利要求3所述检测VANGL2突变基因的方法，其特征是，该方法还包括步骤通过数据库BLAST比对功能，按照正常读码框架进行翻译以确定是否存在84S — F， 353R — C或者437F — S氨基酸突变位点。
6.根据权利要求3所述检测VANGL2突变基因的方法，其特征是，所述测出PCR反应产物的核苷酸序列组成可以使将PCR反应产物在测序仪测序或进行SNaPshot分型。
7.一种用于检测神经管畸形相关基因VANGL2突变基因的试剂盒，其特征在于，其主要包括有以针对VANGL2基因编码区或者权利要求1中所述VANGL2突变基因附近编码区设计的PCR引物，SNaPshot延伸引物，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲体系和延伸反应体系。
8.权利要求1所述神经管畸形相关基因VANGL2的突变基因在应用于神经管畸形的孕前预警基因检测或基因芯片中的用途。
全文摘要
本发明属基因检测技术领域，涉及神经管畸形相关VANGL2突变基因及其检测方法和用途，所述的VANGL2突变基因，其含有VANGL2基因序列，并且还含有18487C→T，20598C→T或24549T→C杂合或纯合突变中的一种或一种以上；本发明从待测样品中得到核苷酸序列与VANGL2正常基因的序列进行比较，核对突变是否为18487C→T，20598C→T或24549T→C中的一种或多种，以及按照正常读码框架进行翻译以确定是否存在84S→F，353R→C或者437F→S氨基酸突变位点；本发明还公开了通过测序或SNaPshot检测所述VANGL2突变基因的试剂盒。本发明所述VANGL2突变基因及检测方法将有利于进一步认识神经管畸形的发生机理，并通过在临床上开展孕前VANGL2突变筛查工作对神经管畸形的发生进行孕前预警。
文档编号C12N15/12GK102168087SQ201010115179
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者杨雪艳, 王红艳, 金力, 雷云平 申请人:复旦大学