专利名称：强旱生植物霸王液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和植物表达载体及其植株遗传转化方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及从中亚荒漠特有古老的强旱生植物 霸王(Zygophyllum xanthoxylum)中克隆的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxNHX，以及该 基因的植物表达载体pCAMBIA1300RBS-ZxNHX和含有该表达载体的工程农杆菌GV3101及其 植株遗传转化方法。
背景技术：
土壤盐渍化是当今世界范围内危害农牧业生产和生态环境的主要非生物因素之 一。中国的盐渍土地约有1亿公顷(王遵亲.1993.中国盐渍土.科学出版社.)。世界粮 农组织和教科文组织的一项统计报告表明，全球灌溉土地面积中，因干旱和不适当的耕作 方式，约50%的耕地遭受着不同程度的次生盐渍化，每年约有1000万公顷的土地由于土壤 的次生盐淸化而丢弃(Greenland & Szabolcs, Soil resilience and sustainable land use. 1994)。此外，在全球气候变暖的背景下，由于高温干燥，蒸发强烈，植被稀少，上升水流 占绝对优势，淋溶和脱盐过程微弱，造成干旱半干旱地区土壤普遍积盐，盐渍荒漠化日益严 重。然而，随着工业飞速发展，人口迅速增长，粮食需求日益高涨；因此，在耕地资源愈趋匮 乏的形势下，对作为重要的土地资源的大面积的盐渍土地的开发利用变得愈加紧迫。尽管可通过工程技术利用盐渍化耕地，但就大农业生产而言耗资不菲。此外，盐渍 化土地多分布在干旱和半干旱地区，由于蒸发量大于降雨量以及土壤自身含有大量的盐分 和矿物质，大量灌溉会加重盐渍化。因此，培育耐盐抗旱性较强的农作物新品种(系)是开 发利用盐渍土的较为理想途径。由于遗传物质的杂合性和优良品种数以及其有限的抗逆 性的限制，因此，传统育种不但费时长而且成功几率小。庆幸的是一方面，植物基因工程 可以突破物种间优良抗逆基因资源转移的障碍，培育出传统育种方法所不能培育的新品种 (系)；另一方面，干旱盐渍生境中的植物却在漫长的生命史中形成了对不良生境的独特适 应机制，进化出了大量对干旱盐渍生境具有强抗性的独特抗逆基因资源，这为农作物抗旱 耐盐性的遗传改良奠定了物质基础。因此，尽管全球植物物种的99%，尤其是农作物对干 旱和盐渍环境的耐受性都不强(Flowers T J and Colmer T D. 2008. New Phytol. 179(4) 945-63 ；Xiong L M and Zhu J K. Salt Tolerance. The Arabidopsis Book. 2002),但可以 从干旱盐渍生境中的植物挖掘独特的抗逆基因，然后利用现代生物技术将其转化到农作物 和优良牧草中以对其进行耐盐抗旱方面的遗传改良。为了在盐渍干旱环境中生存一方面，植物细胞必须维持很低的渗透势以保证在 干旱条件下根系能从土壤中吸收水分以及减少叶片细胞的水分散失。尽管植物可以合成 大量“兼性”有机溶质，如糖类(蔗糖)、糖醇类(山梨醇)、氨基酸类(脯氨酸)、甲基化脯 氨酸类化合物(甲基脯氨酸)、甜菜碱类(甘氨酸甜菜碱)和甲基磺酸化合物(β_ 二甲 基巯基丙酸盐，DMSP) (Hasegawa P M, Bressan R A, Zhu J K, Bohnert H J. 2000. Annual Reviewof Plant Phys iology and Plant Molecular Biology. 51 :463_499 ；RhodesD,Hanson A D.1993. Annual Review of Plant Phys iology and PlantMolecular Biology 44 357-384)等进行渗透调节；但其不仅消耗了大量的C源和N源，而且在合成过程中还需 要耗费相当的能量。因此，合成有机渗透调节物质并不是一种理想的渗透调节方式。研究表明，干旱盐渍生境中的植物可利用大量无机离子如Na+、K+等进行渗透调 节，如Wang等发现霸王可从含盐量极低的生境中吸收并积累大量的Na+以降低细胞渗透 势来适应极端的干旱环境(Wang S Μ, Wang Y R, ChenH, et al. 2004. J. Arid Environ. 56 525539)。霸王作为一种典型的荒漠多浆旱生植物，广泛分布于我国西北荒漠(赵一之，朱 宗元.2003.云南植物研究.25(2) :113121)，在其漫长的生命进化史中孕育出大量而独特 的抗逆基因资源，对极端环境如强光照、极度干旱、强烈温差和贫瘠的荒漠土壤等具有很强 的适应性(周向睿，周志宇，吴彩霞.2006.草业科学，23(6) :38-41)。因此，本发明的动因 就是利用现代生物技术，从具有特殊适应机制的荒漠植物霸王中挖掘其特异的抗逆基因 资源，用于农作物和优良牧草抗逆性的遗传改良，使其能够更有效地利用土壤中的Na+进行 渗透调节，增强其适应干旱盐渍等不良生境的能力。由于Na+会危害细胞质内各种代谢酶的活性(Blumwald E. 2000. CurrOpin Cell Biol. 12(4) :431-4)，因此，植物细胞需要将进入细胞质的Na+进行区隔以维持正常的生 长代谢活动(Frommer W B and Rent sch D. 1999. Science. 285 1222-1223)。由于液泡 占成熟细胞体积的 80-90% (Schmidt UG, Endler A, Schelbert S, et al. 2007. Plant Physiology. 145 :216_229)，因此液泡是Na+的理想区隔场所。研究表明，离子区域化的实 现主要依赖各种离子的膜转运蛋白和为离子膜转运蛋白提供转运动力的质子泵。因此，提 高膜转运蛋白和膜质子泵的活性或增加其表达量均可使离子转运效率提高。液泡膜钠氢 逆向转运蛋白(vacuolar Na+/H+antiporter, NHX)是位于液泡膜上的一种钠泵，它利用液 泡膜H+-ATPase和液泡膜H+-PPase建立的跨液泡膜质子梯度可将细胞质中过多的Na+区 域化到液泡，一方面避免过多Na+对细胞质内各种代谢酶的毒害，另一方面又可将Na+作 为一种有益的渗透调节剂来降低细胞的渗透势，从而使植物能更好地适应盐渍和干旱环境 (Blumwald Ε. 1987. Physiologia Plantarum, 1987,69 :731_734)。大量研究表明，超表达拟南芥AtNHXl可以显著增强转基因植物的耐盐性。1999 年，Apse 等(Apse M P, Aharon G S, Snedden W A, et al.1999.Science. 285 1256-1258) 在拟南芥中鉴定了第一个高等植物的液泡膜Na7H+逆向转运蛋白基因AtNHXl并将其转入 拟南芥，与野生型相比，发现AtNHX蛋白含量显著增加的转基因植株幼苗在200mM NaCl处 理中仍能正常生长发育，而野生植株型则出现黄化枯萎，叶面积变小，生长受抑；进一步分 析发现，转基因植株叶片Na+含量比野生型植株的高。Zhang等(Zhang H X，Hodson J N， Williams J P, et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 12832-12836)将 AtNHXl 转入 油菜，发现超表达该蛋白的转基因油菜在200mM NaCl的环境中也能够正常生长、开花和结 实，但野生型生长严重受阻；此外，分析结果还表明，在高盐条件下，转基因油菜产量和油的 品质不受影响。He 等(He C X，Yan J Q, Shen G X，et al. 2005. Plant Cell Physiol. 46 1848-1854)在棉花中超表达AtNHXl，发现转基因植株在200mM NaCl处理下生物量增加，棉 纤维更多；分析结果还表明转基因棉花的光合速率和氮同化速率均比非转基因植株强；此 外，在大田实验中，转基因棉花同样能够生产更多、质量更好的棉纤维。过量表达AtNHXl的 转基因小麦也具有更强的耐盐性和更高的产量。这些研究结果表明在高盐条件下，超表达液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因，的确可以提高作物的耐盐性。而且，转基因植物为避免Na+ 对胞质酶的危害将更多的Na+区域化到液泡的过程中，提高了液泡渗透势，降低了细胞水 势，促进了细胞的水分吸收，增加了组织保水性，从而使植物在水分亏缺或盐分胁迫下，表 现出更强的耐盐性和抗旱性以及生物产量。然而令人遗憾的是，目前已克隆的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因多来自抗逆能力 弱的模式植物或农作物，如拟南芥、小麦、玉米和水稻等(伍国强，王强龙，包爱科等.2008. 中国农业科技导报.10(2) :13-21)，而液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因在荒漠旱生植物中尚 未见报道。
发明内容
本发明的目的在提供一种强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)液泡膜钠 氢逆向转运蛋白基因和植物表达载体及其植株遗传转化方法。本发明从一种荒漠旱生植物 一霸王中优选了其液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因并提供了它生产方法和用途。本发明提供 了所选基因在获得抗旱耐盐转基因植物方面的应用，其为本发明的优选应用。本发明以霸王为材料，首次克隆出第一个荒漠强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxNHX，以及该基因的植物表达载体pCAMBI A1300RBS-ZxNHX和含有该表达载体的工程农杆菌GV3101及其植株遗传转化方法，用于培 育耐盐抗旱的农作物和优良牧草新品种(系)。本发明采取的技术方案为一种强旱生植物霸王的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因 ZxNHX核酸分子，包含下属核酸分子(a) ·核酸编码链SEQID NO 1及其互补链；(b).能编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c). (a)和(b)所述核酸分子的一部分。上述核酸分子序列可以是DNA、cDNA或RNA，且本领域的技术人员在知道SEQ ID NO 1后，可以通过多种途径获得，如通过本发明所述的cDNA克隆、基因组重组、DNA合成、 PCR技术或这些技术的组合。本发明的核酸分子并不受限于任何特殊途径的获得方式。更 进一步地说，本发明提供的霸王的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxHNX核酸分子还包括 在严格条件下，可以与核酸分子编码链SEQ ID NO :1以及其互补链杂交的核酸分子及其互 补序列，其中这些核酸分子编码具有液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白活性的蛋白。所述严格条 件为在0. IX SSPE或0. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本发明核酸分子编码的多肽蛋白，其包括序列表SEQ ID NO 2中所示全部或部分 氨基酸序列。本发明蛋白或蛋白片段可以很容易通过本领域技术人员所熟知的方法制备重 组蛋白或天然蛋白。由所述强旱生植物霸王的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxNHX编码蛋白所获得 的单克隆抗体和多克隆抗体。本发明还涉及霸王的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX核酸分子的生产和使 用，尤其是利用该基因植物表达载体如pCAMBIA1300RBS-ZxNHX产生耐盐抗旱的转基因植 物的方法。含有所述核酸分子的载体，所述核酸分子包括(a).核酸编码链SEQ IDNO :1及其互补链；(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c). (a)和(b) 所述核酸分子的一部分。含有所述核酸分子的宿主菌，所述核酸分子包括(a).核酸编码链SEQID NO :1及 其互补链；(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c). (a)和 (b)所述核酸分子的一部分。含有所述核酸分子的转基因细胞系或转基因植物及其后代，所述核酸分子包括 (a).核酸编码链SEQ ID NO :1及其互补链；(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸 分子以及其互补链；(c). (a)和(b)所述核酸分子的一部分。得到所述核酸分子在植物中超表达的遗传转化方法，其包括有(a)克隆或合成本发明的核酸分子；(b)将(a)步骤的核酸分子插入到可使其在转基因植物中超表达的载体中并将获 得的表达载体转入根癌农杆菌，以获得转基因用工程农杆菌(c)通过(b)步骤的工程农杆菌将本发明所述基因转入植物细胞或组织或种子；(d)将(C)步骤植物细胞或组织或者种子进行植株再生，其中转基因植株与野生型植株相比耐盐抗旱性提高或其它性状发生改良。
图1 霸王Na+/H+逆向转运蛋白核心片段核酸序列及其推测的氨基酸序列。图中 灰色阴影表示扩增核心片段的PCR上下游引物。图2 霸王Na+/H+逆向转运蛋白核心片段核酸序列在GenBank中同源性比较。图3 霸王Na+/H+逆向转运蛋白核心片段氨基酸序列在GenBank中同源性比较。图4 霸王Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX核酸序列及其预测的氨基酸序列。图 左侧和右侧的数字分别代表核苷酸和氨基酸的位点，浅色阴影处为起始密码子(ATG)和终 止密码子(TGA)，方框处为两个糖基化位点。图5 霸王ZxNHX疏水性分析。图中横坐标上从左到右的数字表示氨基酸残基的位 点，纵坐标上、下的数字分别表示亲水和疏水位点。图内的数字表示ZxNHX跨膜片段结构。图6 霸王ZxNHX与其它植物NHX氨基酸序列的多重比较。Na+/H+逆向转运蛋 白的来源和基因库登录号分别为霸王(Zygophyllumxanthoxylum)ZxNHX :EU103624，拟 南芥(Arabidopsis thaiiana)AtNHXl :AY685183，北滨藜(Atriplex gmelini)AgNHXl AB038492,胡杨(Populuseuphratica)PeNHX2 :DQ414512，白杨(Populus tomentosa) PtNHXl :AY660749，盐地碱篷(Suaeda salsa) Ss NHXl :AF370358，水稻(Oryza sativa) OsNHXl :AY324877。不同颜色背景分别表示氨基酸的不同保守性，其中黑色表示100%保 守，深灰色、灰色阴影分别表示75%、50%以上的保守性；方框表示氨氯吡嗪脒结合位点； ZxNHX 12个跨膜区序列用线条表示。图7 霸王Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX —价表达载体pCAMBIA1300RBS_ZxNHX 的构建流程。图8 构建一价表达载体的电泳检测；其中M =DNA Marker 200Ladder ； 1 以霸王cDNA为模板的PCR扩增ZxNHX基因ORF框；2 =PCR检测 pMD19-T-ZxNHX 载体；3 :PCR 检测 pCAMBIA1300RBS_ZxNHX。
具体实施例方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。实施例1 霸王Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆方法根据其它植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的保守序列设计一对简并性引物， 以霸王叶片总RNA为模板，采用RT-PCR的方法扩增出Na+/H+逆向转运蛋白基因片段并克隆 到pUCm-Τ载体。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序，序列分析结果表明克隆到一个序列长 度为432bp同源的片段(图1)，将该序列及其推测氨基酸序列输入GenBank进行Blast分 析(图2和图3)，结果显示这一序列与许多植物的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因具有较 高的同源性，表明所得到的核心片段的确是霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的序列。以获得的核心片段为模板，设计末端快速扩增(RACE)引物，获得该片段的3’端和 5’端的序列。将克隆到的霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的核心片段、3’端和5’端 的序列进行拼接，得到一个全长2127bp霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(图 4)。该cDNA包含一个1599bp开放阅读框(ORF)，编码532个氨基酸。起始密码子ATG前面 有213bp长的5’非翻译区(5’ -UTR)，终止密码子TGA后面有315bp包含p0ly(A)尾巴的 3，非翻译区(3，-UTR)。本发明将该基因命名为ZxHNX (SEQ ID NO 1)，并在GenBank注册， 登录号为EU103624 ；其编码的蛋白质命名为ZxNHX(SEQ ID NO :2)，注册号为ABU92562。霸王ZxHNX cDNA编码一个由532个氨基酸残基构成的多肽蛋白，推测其分子量 为58.8KDa，等电点为7.23。疏水性分析表明，ZxNHX蛋白含有12个跨膜片段(图5)， 其中TM5、TM6似乎没有跨过液泡膜，是Na+/H+逆向转运蛋白转运活性的重要功能区域 (Yamaguchi，et al. 2003. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 :12510_12515)；此外，该蛋白含有 2个N-糖基化位点Asn44、Asn287，表明ZxNHX蛋白是糖基化的蛋白(图4)；另外，ZxNHX 有一个长的C末端亲水性“尾巴”，其可调节Na+/H+逆向转运蛋白转运活性(图5)。将推测 的ZxNHX与其他植物NHXs的氨基酸序列进行同源比较发现它与胡杨PeNHX2(DQ414512) 的同源性最高(80. 7% )，其次是拟南芥AtNHXl(AY685183)，同源性为79.6%，接下来 依次是白杨 PtNHXl (AY660749) (78. 6 % ),滨藜 AgNHXl (AB038492) (77. 7 % )，盐地碱蓬 SsNHXl (AF370358) (74. 3% )，水稻 OsNHXl ((AY324877) (72. 7% ) 在进化上，ZxNHX 可能与 其生境相似的胡杨PeNHX2关系较近，而与单子叶植物水稻OsNHXl的关系较远；比较还发 现，ZxNHX中同样含有高度保守的Na+/H+逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪脒结 合位点(amiloride binding sites)78LFFIYLLPPI87,其与 PeNHX2、PtNHXl、SsNHXl、 AgNHXl、AtNHXl、OsNHXl的序列完全一致(图6)。这些结果表明克隆到的ZxHNX基因的确 是霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。其具体的克隆方法如下(1)总RNA的提取采用《一种改进的多浆旱生植物霸王叶和根总RNA提取方法》 (伍国强，席杰军，周向睿等.2008.分子植物育种.6(1) 1-4) 一文所述方法提取总RNA。(2)cDNA第一条链的合成①于冰上将7 μ 1 总重 RMA，1 μ 1 Oligo (dT) 18 (0. 5 μ g/ μ 1)禾口 4 μ 1 ddH20 按总体积12 μ1轻轻混勻，瞬时离心液体。②反应混合物在70°C水浴5分钟后，冰浴30秒，然后瞬时离心。③在冰上按顺序加入下列组分5XReaction Buffer4μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1)1 μ 1dNTP Mix(IOmmo 1/L)2μ 1④轻轻混勻后瞬时离心，37°C水浴5分钟，加入1 μ IM-MuLV RT (20U/ μ 1)，终体积 为 20 μ1。⑤反应混合物37°C水浴60分钟(如果采用随机六合引物则预先在25V温育10 分钟，然后37°C水浴60分钟)。⑥在70°C加热10分钟结束反应，置冰上进行后续实验或_4°C冷冻保存。(3) PCR 扩增①在50 μ 1 PCR管中混合如下组分Taq DNA Polymera se (5U/ μ 1)10 □ PCR Buffer2mmol/L dNTP25mmol/L MgCl2Primer Pl (10 μ Μ)Primer Ρ2(10μΜ)cDNASterilized ddH20Total VolumePl 5' -CATCDGTGGTKCTTTTCAATGC-3P2 5' -CRAATCTCCACTTCTCAATGTC-3其中D = A+G+T ；R = A+G ；K = G+T②轻轻混勻并短暂离心将管壁上的液体收到管底，然后按下列条件进行反应
权利要求
一种强旱生植物霸王的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxNHX核酸分子，包含下属核酸分子(a).核酸编码链SEQ ID NO1及其互补链；(b).能编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c).(a)和(b)所述核酸分子的一部分。
2.根据权利要求1所述的强旱生植物霸王的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxNHX核酸 分子的编码蛋白，其包括SEQ ID NO :2中全部或部分氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述强旱生植物霸王的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxNHX的编码 蛋白所获得的单克隆抗体和多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的强旱生植物霸王的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因ZxHNX核酸 分子还包括在严格条件下，与核酸分子编码链SEQ ID NO :1以及其互补链杂交的核酸分子 及其互补序列，其中这些核酸分子编码具有液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白活性的蛋白；所述 严格条件为在0. IX SSPE或0. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
5.含有权利要求1中所述核酸分子的表达载体。
6.含有权利要求1中所述核酸分子的宿主菌。
7.含有权利要求1的转基因细胞系或转基因植物及其后代。
8.得到超表达权利要求1所述的核酸分子的植株遗传转化方法，其中植物的耐盐抗旱 性提高，该方法包括(a).克隆或合成权利1中的核酸分子；(b).将(a)步骤的核酸分子插入到可使其在转基因植物中超表达的载体中并将获得 的表达载体转入根癌农杆菌，以获得转基因用工程农杆菌；(c).通过(b)步骤的工程农杆菌将权利要求1中基因转入植物细胞或组织或种子；(d).将(c)步骤植物细胞或组织或者种子进行植株再生，其中转基因植株与野生型植 株相比耐盐抗旱性提高或其它性状发生改良。
全文摘要
本发明涉及从中亚荒漠特有的多浆旱生植物霸王(Zygophyllumxanthoxylum)中克隆的液泡膜钠氢逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporter)基因ZxNHX，以及该基因的植物表达载体pCAMBIA1300RBS-ZxNHX和含有该表达载体的工程农杆菌GV3101。本发明属于分子生物学和生物技术领域，主要用于农作物的遗传改良，可以提高农作物的耐盐、抗旱、抗寒和产量等性状，具有重要的社会、经济和生态效益。
文档编号C12N5/10GK101942450SQ20101012025
公开日2011年1月12日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者伍国强, 席杰军, 王茜, 王锁民 申请人:兰州大学