专利名称：甘蓝型油菜粒重主效QTLs的分子标记及其应用的制作方法
甘蓝型油菜粒重主效QTLs的分子标记及其应用技术领域
本发明属于油菜分子育种和生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜粒重有关QTL 的发现和分离，以及有关分子标记的开发和应用。
背景技术：
甘蓝型油菜(Brassica napus L.，以下简称油菜)是世界上最重要的油料作物之 一。油菜的种子不仅是油和蛋白质的储藏器官，同时也是植物生命周期延续的器官。 种子大小或重量是非常重要的经济性状。首先粒重是构成植物单株产量的三大因素之 一(单株有效角果数、每角果粒数、粒重)，因此也决定着产量(Clarke and Simpson， 1978 ； Butraille et al.，1999 ； Shietal.，2009)；其次，种子大小也与含油量和蛋白质含 量有关系(Morgan et al., 1998 ； Lionneton et al.，2004)；再次，大种子通常在萌发过程 中有更好的适应性。因此，弄清种子大小或重量形成的遗传基础，对油菜产量和品质的 改良十分重要。此外，从进化的角度来看，弄清种子大小的变化也有着非常重要的意 义。
尽管油菜的种子大小非常重要，但目前对其遗传控制仍缺乏深入的了解。和 其它产量相关性状相比，粒重的遗传力较高(Liuet al.，1987 ； Qi et al., 2004 ； Shiet al., 2009)。随着分子标记技术的发展，目前也定位了一些油菜粒重的数量性状位点 (Quantitative Trait Loci, QTL)。Quijada et al. (2006)利用四个群体的二年二点试验定位 了三个和粒重有关的QTLs(位于N7，N17和N19)，但在不同群体间没有相同的QTL存 在；Udall et aU2006)分别在Hua Double Haploid(DH)群体、SYN DH群体和测交群体等 三个不同群体间分别检测到6个、4个和5个粒重有关的QTLs，只有一个位于N14上的 QTL能在不同群体和不同环境间稳定检测到；最近，Shi et al.(2009)利用油菜的二个群 体在10个不同环境下一共检测到159个粒重QTLs，这些QTLs分布在除了 Cl以外的其 它所有染色体上。
利用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，在过去的十多年中利用突变体分 析等手段，对种子大小的分子调控机理进行了研究。Alonson-Blanco et al.，(1999)定 位了 11个和种子大小有关的QTLs，第一次揭示了这个性状在不同材料间的遗传复杂 性。最近，对大量突变体的分析，进一步阐明了许多决定种子大小的分子机理。例 如TTG2 (Transparent Testa Glabrous 2)基因突变体，影响种皮中的类黄酮素的积累，通 常会减少粒重(Debeaujon et al., 2000, 2003)。而 AP2 (APETELA2)或者 ARF2 (Auxin Response Factor 2)等转录因子的突变可使种子变大(Jofuku et al.，2005 ； Ohto et al., 2005 ； Schruffet al., 2005)。Luo et al. (2005)鉴定了二个小种子突变体 IKU2 (HAIKU2) 和MINI3 (MINISEED3)，并首次提出种子大小遗传控制的可能代谢途径。鉴于油菜和拟 南芥非常相近的同源关系，预期可以利用拟南芥的信息，从油菜基因组中获得有关控制 种子大小的同源基因。
过去的几年中，利用不同类型的标记构建了多张遗传连锁图谱。但由于缺乏足够的共线性标记，图谱的整合目前尚进展缓慢。目前，多个从事芸薹属(Brassica)研究的 团体在致力于微卫星标记MSRmarker)的开发。运用SSR标记可使遗传连锁图的构建更 加容易并增强可重复性(Loweet al.，2004 ； Plieske and Strass, 2001 ； Suwabe等，2002; Chen等.，2009)。但是目前为止，由于SSR标记的数目仍有限，使得QTL定位研究在 不同群体间的横向对比还比较困难。
目前在油菜中未见能在不同遗传背景下稳定检测到的粒重有关的主效QTLs的报 道，对粒重有关基因的克隆和分析的报道也非常少。鉴于粒重性状的重要性，对油菜中 粒重有关的QTLs的鉴定，以及紧密连锁分子标记的开发对促进油菜产量和品质育种是十 分必要的。发明内容
本发明的目的是提供甘蓝型油菜粒重主效QTLs及其紧密连锁的分子标记及用于 甘蓝型油菜粒重性状的选育。本发明为油菜粒重育种提供新手段，加速油菜粒重性状改 良进程，提高育种的准确性和选择效率。
本发明是通过以下方案实现的。
a)用甘蓝型油菜甲A254(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉 市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO : P200909)与甘 蓝型油菜甲A177(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的 中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNO P200908)杂交，得到Fl ；
b)种植步骤a)的F1，从所述的Fl植株的花蕾中通过小孢子培养(余凤群等， 1997)获得分离的双单倍体(DH)系群体；
C)对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，并对每个株系的基因型进行 描述；具体方法分离DH群体每一个系的基因组DNA，采用SSR引物进行PCR扩增， 扩增产物在6% (100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-双丙烯酰 胺)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，经银染、显影后，获得每个株系基因型；
d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用步骤C)中得到的每个株系基因 型构建甘蓝型油菜遗传连锁图，遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.， 1992)软件进行；
e)测定DH群体每个系的成熟种子的千粒重数值；
f)将DH群体每个株系的千粒重与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁 和QTL分析，QTL检测采用QTL Cartographer V2.0 (Wang et al., 2007)软件中的复合区 间作图法(CIM)进行，以2.0为LOD阈值，大于2.0说明存在一个QTL位点，从而确定 和粒重主效QTLs连锁的SSR分子标记BnEMS1044和BrGMS5M，其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID NO 5 和 SEQ IDNO 6 以及 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示；
g)对上述DH群体检测到的粒重主效QTLs的验证利用和甲A254、甲A177不 同遗传背景和来源的大粒材料甲7046和小粒材料甲7005杂交，得到Fl ；由杂种Fl套袋 自花授粉获得F2代，获得F2群体；利用和上述DH群体同样方法检测粒重QTL;发现 和在DH群体中检测到的二个粒重主效QTLs在不同来源和遗传背景下均能稳定存在；
h)利用上述步骤f)的二个QTLs峰值最近的标记即BnEMS1044和BrGMS5M搜寻白菜数据库(http://www.brassica_rapa.org/BGP/blast.jsp)的同源区段，得到白菜A7上 的二个 BAC KBrB084P16 和 KBrH001J06 ；利用在线软件 Batchprimer3 设计二对 BAC 特异性SSR标记；根据序列表SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的引物对进行PCR扩增，分别得到能够区分甘蓝型油菜大粒种子与小粒种 子的共显性SSR分子标记，即10509和J0609，所述的分子标记10509和J0609的核苷酸 序列分别如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2以及SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
i)利用分子标记10509、J0609对DH系的基因型进行分析，同时存在10509、 J0609标记基因型和甲A2M带纹一致的判定为大粒材料；同时存在10509、J0609标记基 因型和甲A177带纹一致的判定为小粒材料。
在上述方法中，所用分子标记引物对的核苷酸序列如下所示
引物对(1)，编号为10509
正向引物5' -ATCATGATGACTTTTGCAATG-3‘，
反向引物5' -GCTCTTGGTAACATAAAATCG-3‘。
引物对O)编号为J0609
正向弓丨物5' -GTTGGTTAAAATCGTGTATGC-3‘，
反向引物5' -CCTACAAAAAGCAATAACGTG-3‘。
其中，引物对10509是序列表中SEQ IDNO 1和SEQ IDNO 2所示的核苷酸 序列，引物对J0609是序列表中SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
本发明的积极效果
本发明的油菜粒重主效QTLs及其位点特异性标记与现有技术报道的不同，运用 这些标记可鉴别甘蓝型油菜粒重主效QTLs位点，从而可以克服传统育种中依靠表型进行 选择的缺点。利用本发明制备的分子标记可进行甘蓝型油菜粒重性状的分子标记辅助选 择，其中本发明设计的两对引物10509和J0609还可以用于甘蓝型油菜粒重性状的精细定 位和图位克隆，可以明显减少育种工作量，缩短育种年限，加快油菜育种的进程。
更详细的技术方案如《具体实施方式
》所述。
图1 本发明的技术流程图。
图2:利用引物对10509、J0609在甘蓝型油菜甲A2M和甘蓝型油菜甲A177及其 Fl的基因组DNA中的扩增结果。10509和J0609引物对的PCR扩增产物是在6% (IOOml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶 上电泳分离的图片。
图3:不同群体间A7连锁群上粒重QTL的定位结果。左图为本发明涉及的DH 群体的A7遗传连锁图和粒重QTL的定位结果；右图为Shietal. ^)09)报道的TN群体上 A7遗传连锁群上的粒重QTL区间qSW.A7-2的定位结果。图中带下划线的标记为不同 群体间的共同标记，虚线为不同群体间的共线性关系。
具体实施方式
实施例1 甘蓝型油菜中粒重主效QTLs位点特异性分子标记的获得
(1)甘蓝型油菜粒重定位群体甲A254/甲A177的DH群体的构建及田间试验和 千粒重分析采用以甘蓝型油菜甲A254(大粒纯系)为母本，甘蓝型油菜甲A177(小粒纯 系)为父本进行杂交得到Fl，种植F1，从Fl植株上取花蕾进行小孢子培养得到双单倍体 (DH)分离群体，共得到238个系的DH系，随机选取190个系用于全基因组的遗传连锁 图的构建和粒重QTL的定位。
将上述得到的DH系和其亲本甲A254/甲A177及F1，于2007-2008年度和 2008-2009年度种植到田间，田间试验采取完全随机区组设计，三次重复，每一个系种二 行，每行11-12个单株，株距平均Mcm左右，行间距30cm。所有材料种植于武汉华中 农业大学油菜试验田，为冬油菜种植环境。田间管理按一般育种大田管理。
每年5月份从田间收割回成熟的试验材料，从自由授粉的单株上脱下种子，清 理掉杂质和不饱满的种子，至少放置4周以上，在空气中自然干燥。每个单株随机取500 粒饱满种子，三次重复，单株内误差不超过O.lg，超过后放回混勻再取，然后算取平均 值折算成千粒重(1000粒种子的重量)数值，亲本、Fl和DH每个系取10-15个单株， 算取平均值为其千粒重值(相关数据见表1)。
(2) DH群体的遗传连锁图构建和粒重QTL分析
选取在二个亲本间具有扩增多态性的SSR引物对190个DH系根据已有方法 (Plieske and Strass, 2001 ； Suwabe et al.，2002 ； Lowe et al.，2004 ； Chen et al.，2009) 进行分析，分离每个DH系的基因组DNA，采用上述筛选得到的有多态性的SSR引物进 行PCR扩增，扩增产物在6% (100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克 甲叉-双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，经银染、显影后，获得每个株系基 因型和群体的分子标记多态性数据，将获得的群体基因型数据构建甘蓝型油菜遗传连锁 图。遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.，1992)软件进行，连锁群划 分的参数设置为LOD值为9.0，最大距离为30cM，每一个连锁群的确定利用order，try 和ripple等命令。作图群体中连锁群中的共同标记和锚定标记来自Parkin et al. (1995)， Lowe et al. (2004)，Piquemal et al. (2005)，Qiu et al. (2006) and Chen et al. (2009)等文章中 的信息，二个位点间的遗传距离的计算采用“hsambi”参数(Lincoln等，1992 ； Lowe 等，2004 ； Chen 等，2009)。
将DH群体每个株系的千粒重数据与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连 锁和QTL分析，QTL的检测采用QTL Cartographer V2.0 (Wanget al.，2007)软件中的复合 区间作图法(CIM)进行，QTL检测前，其参数设定为选择“forward-backward stepwise regression”模式，检测间隔的窗口大小选择10cM，参数设定为模式6 Pin = 0.05, Pout =0.05，检测时，LOD值默认为2.0，QTL的置信区间的确定以在峰值所在的LOD-I所 包含的峰值二端所对应在遗传连锁图上的位置。置信区间有重叠部分认为是在不同的环 境和群体间有相似位置的QTL。
在二年的试验中，一共在6条染色体上(Al，A2，A5，A7，AlO和C4)检 测到9个千粒重的QTLs，这些QTLs分别能解释3.66-20.76 %的表型变异(表2)。特 别指出的是，在A7染色体上的TSW7a和TSW7b，在二年中都能检测到，而且表现出最大的效应，一共能解释所有粒重变异的27.64-37.90%。TSW7a的QTL位点位于 BoGMS715-BnEMS858区间内，在2007年能解释千粒重性状的17.14%,在2008年能 解释18%左右。二年的QTL峰值有些微移动，但都共同的置信区间。在二年中来自甲 A254的等位基因能对千粒重增加0.14-0.17g。TSW7b位点同样有相当大的效应，在2007 年能解释20.76%的变异，2008年能解释9.86%的变异，来自甲A254的等位基因能对千 粒重增加0.12-0.15g，在二年中此QTL的位点都稳定的存在于IOUcM处。除此之外仍 然还有7个QTLs仅在其中的一年能检测到，这些QTLs位点的效应都非常的小，仅能解 释表型变异的3.66%到8.86%。来自甲A254的等位基因对TSW5a，TSW5b, TSW5c, TSWlO和TSW14起正向作用，对TSWl和TSW2起负向作用。
(3)对DH群体中发现的粒重主效QTLs位点的验证
搜寻粒重定位有关的文献和最近的文章(Shi et al.，2009)，有一些粒重QTLs定 位在A7染色体上，其中有一个在共同的标记SR0282R上，和本研究中发现的TSW7b的 QTL位点吻合(见图3)。
以上的结果说明在不同的遗传背景下均能在A7染色体上检测到千粒重的主效 QTLs,说明A7染色体上的千粒重位点是保守的，可以用来后续的粒重主效QTLs位点特 异性的标记开发。
(4)粒重主效QTLs位点特异性标记的获得
为了开发A7连锁群上离粒重主效QTLs位点连锁更加紧密的标记，利用离这 二个粒重主效QTLs峰值最近的二个标记BnEMS1044和BrGMS5M搜寻白菜数据库 (http://www.brassica-rapa.org/BGP/blast.jsp)的同源区段，位于白菜 A7 上的二个 BAC KBrB084P16和KBrH001J06分别位于TSW7a和TSW7b 二个主效QTLs区段附近。因 此禾1J用在线软件(http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)设计了 二对BAC特异性SSR标记。来自KBrB084P16的10509和来自KBrHOO 1J06的J0609通 过按上述同样的方法重新构建遗传连锁图和QTL扫描，发现这二个标记分别定位在这二 个粒重主效QTLs位点峰值处。10509和J0609分别和这二个粒重主效QTLs位点紧密连 锁；结果还显示这二个标记分别对TSW7a (从10.36增加到11.4 和TSW7b (从10.37增 加到11.13)的LOD值有所增加。
实施例2 甘蓝型油菜中粒重主效QTLs位点特异性标记的有效性验证
(1)甘蓝型油菜中粒重主效QTLs位点特异性标记的验证
为了检测在表型变异上10509和J0609 二个标记的主要效果，在DH群体中，每 一个系以这二个位点的基因型进行分组，并进行千粒重的平均值进行计算。对于10509位 点，在AA基因型(来自于甲A254的等位基因位点)组1在二年中包含来自于甲A254的 正向加性效应的等位基因数目明显比来自于甲A177的要高。对于J0609有同样的趋势(表 3)。从表中的结果可以看出，在甘蓝型油菜中位于A7的二个位点是决定粒重的主要因子。
(2)甘蓝型油菜中粒重QTLs位点的组合效应验证
在DH群体中检测粒重QTLs位点的组合效应，DH群体的系以A5和A7上的 QTLs的基因型进行分组并比较其粒重的变化(表4)。由于A5上的三个QTLs紧密的连 锁在一起，在DH群体中很少获得重组系，则将A5上的三个位点简化为一个位点用于基 因型的分类。从而三个位点在DH群体中应有8种基因型的组合(表4)。从表4的数据可以看出，当三个正向加性等位基因同时存在时，粒重明显高于当仅有一个A7的主要位 点和A5位点存在与否时，非常清楚的说明二个A7位点的重要性和其效应大小。通过表 4的数据可以看出，第一组的千粒重数据(包含所有的三个正向加性等位基因)比其它所 有组的数值都要高。
利用10509、J0609对DH系的基因型进行分析，同时存在10509、J0609标记基因 型和甲A2M带纹一致的为大粒材料；相反同时存在10509、J0609标记基因型和甲Al77 带纹一致的为小粒材料。
通过检查DH群体所有千粒重QTLs位点的基因型，第75#系拥有所有正向效应 的QTLs位点，其在二年的表型值中都具有最大的千粒重数值(表5)。相反，第87#系 拥有所有反向效应的QTLs位点，其在二年中都具有最小的千粒重数值。
以上的结果说明可以利用这些标记的信息用于粒重的分子标记辅助选择，并且 应用这些标记对粒重的基因型选择也是非常准确的。
表1 亲本、Fl和分离群体的千粒重数据
权利要求
1.一种与甘蓝型油菜粒重主效QTLs紧密连锁的分子标记，其特征在 于，它是通过如下方法获得的用甘蓝型油菜叶片分离的DNA，采用引物对 5 ‘ -ATCATGATGACTTTTGCAATG-3 '禾Π 5 ‘ -GCTCTTGGTAACATAAAATCG-3 ‘； 5 ‘ -GTTGGTTAAAATCGTGTATGC-3 '禾口 5 ‘ -CCTACAAAAAGCAATAACGTG-3 ‘分 别对甘蓝型油菜甲Α2Μ和甲Α177进行PCR扩增，扩增产物在6 %的聚丙烯酰胺凝胶上 电泳分离后，分别获得分子标记10509和J0609，所述的分子标记的核苷酸序列分别如序 列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 以及 SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 所示。
2.用于扩增与甘蓝型油菜粒重主效QTLs紧密连锁的分子标记10509和J0609的引物对 的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO 1 和 SEQ IDNO 2、SEQ IDNO 3 禾口 SEQ IDNO 4所示。
3.—种与甘蓝型油菜粒重主效QTLs紧密连锁的分子标记的制备方法，按照以下步骤a)用甘蓝型油菜甲A254为母本与甲A177为父本杂交，得到Fl；b)种植步骤a)的F1，从所述的Fl植株的花蕾中通过小孢子培养获得分离的双单倍 体(DH)群体；c)对DH群体中的每一个株系进行分子标记分析，分离DH群体每一个株系的基因组 DNA,采用SSR引物进行PCR扩增，扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银 染、显影后，获得每个株系的基因型；d)用步骤c)中获得基因型构建甘蓝型油菜遗传连锁图；e)测定DH群体每个株系的成熟种子的千粒重数值；f)将DH群体每个株系的千粒重与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和 QTL分析，得到粒重主效QTLs连锁的SSR分子标记BnEMS1044和BrGMS5M，其核苷 酸序列如序列表 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 以及 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8所示；g)利用离步骤f)中的分子标记BnEMS1044和BrGMS5M搜寻白菜数据库的同源区 段，找到白菜A7上的二个BAC，即KBrB084P16和KBrH001J06 ；h)利用在线软件Batehprimed设计二对BAC特异性SSR引物，它的核苷酸序列分别 如序列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 以及 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示； 根据序列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的 引物对进行PCR扩增，分别得到能够区分甘蓝型油菜大粒种子与小粒种子的共显性SSR 分子标记，即10509和J0609，所述的分子标记10509和J0609的核苷酸序列分别如序列表 SEQ IDNO 1 禾口 SEQ ID NO 2 以及 SEQ ID NO 3 和 SEQ IDNO 4 所示。
4.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜粒重性状标记辅助选择中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在甘蓝型油菜粒重性状标记辅助选择中的应用。
6.权利要求5的应用，其中包括在甘蓝型油菜粒重性状的精细定位和图位克隆中的应用。
全文摘要
本发明属于油菜分子育种和分子标记制备技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜粒重主效QTLs位点特异性分子标记的制备，该标记可用于在甘蓝型油菜粒重性状改良中的分子标记辅助选择以及在粒重性状位点精细定位和图位克隆。本发明的特征是，以甘蓝型油菜甲A254(大粒纯系材料)为母本与甘蓝型油菜甲A177(小粒纯系材料)为父本杂交构建双单倍体(DH)，对该DH群体基因型和千粒重数据进行分析获得了与粒重主效QTLs紧密连锁的分子标记，将其命名为I0509和J0609。对该分子标记标记进行了相关验证应用。本发明为油菜粒重的分子育种提供了一种新的遗传标记，也为甘蓝型油菜的千粒重性状位点的精细定位和相关基因的图位克隆提供了有用信息。
文档编号C12N15/11GK102021235SQ20101012072
公开日2011年4月20日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者傅廷栋, 周永明, 范楚川, 蔡光勤 申请人:华中农业大学