专利名称：利用枳精氨酸脱羧酶基因PtADC提高植物抗旱耐寒能力的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳(Poncirus trifoliate)中分离、 克隆得到枳精氨酸脱羧酶基因PtADC，然后将该基因导入到模式植物(拟南芥)中进行生物 学功能验证，获得的转基因植株的抗旱耐寒能力有了明显提高。
背景技术：
非生物逆境(例如干旱、低温、盐碱等)影响植物的生长发育、地理分布和生产能 力，是农业生产面临的严峻挑战，是许多地区农业发展的瓶颈。以干旱为例，据统计，世界干 旱地区总面积占陆地面积的40%以上，全世界每年由于水分胁迫造成作物生产的损失几乎 等于其它所有环境因子所造成的损失的总和。因此培育抗逆的农作物新品种是抗非生物逆 境的关键。遗传转化是利用生物、物理或化学等手段将外源基因导入受体细胞以得到转基因 动物、植物和微生物的技术，转基因在受体细胞中得以表达使转基因生物在保留原有优良 性状同时增加一个目的基因控制的性状。自1983年首例转基因植物问世以来，植物转基因 研究取得了长足的进展。一些转基因作物进行商业化种植，面积不断增加，截止2008年，全 球共有25个国家有商业化的转基因植物，种植面积共1. 25亿ha。培育转基因材料的关键 是克隆重要且具有相应功能的基因。在长期进化过程中，高等植物形成了一套相应的逆境应答机制，逆境胁迫时将在 生理、生化水平上发生变化，更为重要的是在转录水平上发生应答，以减轻胁迫造成的伤 害。根据基因产物的作用，植物非生物逆境胁迫应答基因可以分为两类，一类基因的编码产 物为功能蛋白以及渗透调节因子；另一类基因的编码产物为转录因子。前者主要有LEA蛋 白基因、抗氧化酶和抗氧化物相关基因、水通道蛋白、脯氨酸合成相关蛋白、合成渗透调节 物质的关键酶和分子伴侣等。多胺(polyamine，PA)是广泛存在于原核生物和真核生物中的生物活性物质，是 一类低分子量脂肪族含氮碱化合物。高等植物中常见的多胺有腐胺(putresCine，Put)、亚 精胺(spermidine, Spd)、精胺(spermine, Spm)等。在生理pH条件下，多胺具有多聚阳离 子的特性，通过离子键、氢键和疏水作用等共价键形式与核酸、蛋白质和磷脂等基团相互作 用，调节其生理功能；另外，多胺化学结构上具有脂肪族特性，在疏水环境中起稳定膜系统 的作用。因此，多胺是植物逆境胁迫中一种重要化学物质。植物多胺生物合成有两条途径，即鸟氨酸脱羧酶(0DC)和精氨酸脱羧酶(ADC)途 径。在植物受到非生物逆境胁迫下，多胺积累增加。大量研究表明，植物逆境胁迫下多胺积 累主要来源于ADC基因的上调表达和ADC活性的特异增强。此外，外源多胺处理可以减轻 非生物逆境胁迫造成的伤害，提高组织或细胞的抗逆能力。上述研究表明，多胺在植物的抗 逆性中起到重要的作用。因此，让植物积累较多的多胺可能是提高其抗性的一个新方法，超 表达在逆境应答中起重要作用的多胺合成关键基因是有效的途径。由于ADC基因在逆境应答中起重要作用的基因，一些植物ADC的cDNA已被克隆
3和鉴定，如燕麦(Bell等，1990)、大豆(Nam等，1997)、豌豆(Perez-Amador等，1995)、番茄 (Rastogi 等，1993)、康乃馨(Chang 等，2000)、拟南芥(Waston 等，1996 ；Urano 等，2003)、葡 萄(Primikirios 等，1999)、水稻(Chattopadhyay 等，1997 ；)、桃(Liu 等，2009)。在克隆 ADC的cDNA的基础上，开展了基因转化研究，结果表明，转ADC基因后，转化子的多胺水平上 升，并且在某些逆境胁迫下，转化子表现出较强的抗性。Masgrau等(1997)将燕麦ADC的 cDNA转入烟草中，转化子ADC活性增强12-20倍，植株的抗旱性得到增强。同样，Burtin等 (1997)将燕麦ADC的cDNA转入烟草中，转化子ADC活性增强10-20倍。将燕麦ADC的cDNA 转入水稻中，转基因植株的腐胺量上升2-10倍(Cape 11等，1998 ；Bassie等，2000 ；Noury 等，2000)。Roy等(2001)将燕麦ADC的cDNA转入水稻中，转基因植株的腐胺和ADC活性分 别比对照高200%和300-400%，第二代植株在盐胁迫下生物量较对照大幅度上升。虽然有较多的研究表明ADC基因已经在一些植物中克隆，但在枳中尚未见该基因 克隆及功能验证的报道，更未见应用枳PtADC基因转化植物提高抗非生物逆境的文献报 道。
发明内容
本发明的目的是克隆枳(Poncirus trifoliate)精氨酸脱羧酶基因PtADC，通过 遗传转化获得抗干旱和耐低温胁迫的转基因植株，为柑橘类植物抗非生物逆境分子设计育 种提供基因资源，为今后实施绿色、节水农业提供思路，有利于降低农业生产成本。本发明是这样实现的本发明主要是从枳(Poncirus trifoliate)中克隆得到精氨酸脱羧酶基因 PtADC，它的核苷酸序列和编码序列(氨基酸序列)如序列表SEQ ID:1所示(该基因对应 的蛋白质序列如序列表SEQ ID N0:3-4所示)；然后将该基因在模式植物拟南芥中超表达， 通过遗传转化获得转基因植株，功能验证表明，该转基因植株具有明显的抗旱和耐寒能力。在本发明的实施例部分，我们阐述了枳精氨酸脱羧酶基因PtADC的分离、功能验 证和应用。
序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的枳精氨酸脱羧酶基因PtADC的核苷酸序列 (即cDNA序列，全长2493bp)。序列表SEQ ID N0:1的第85-2340位是枳精氨酸脱羧酶基因PtADC的编码序列 (氨基酸序列)。序列表SEQ ID NO 2是枳精氨酸脱羧酶基因PtADC对应的蛋白质序列。序列表SEQ ID NO :3_4是扩增枳精氨酸脱羧酶基因PtADC cDNA序列的引物序列。图1是本发明的技术流程图。图2是本发明的其中一个实施例的植物真核表达载体pMV-PtADC构建流程。图3是本发明的PtADC基因PCR扩增结果。图4是本发明构建的表达载体pMV-PtADC的酶切检测结果(图中1 :PMV_PtADC克 隆酶切；M :lkb DNAmarker)。图5是本发明转化得到I；代转基因拟南芥株系，收获的I；代种子经MS+卡那霉素
4(Km)平皿筛选得抗性代转基因杂合株系(图中绿色为阳性转化植株)。图6是本发明其中一个实施例中部分1\代转基因拟南芥株系杂合株系PCR鉴定结 果(图中M :DNA分子量标记lOObp DNA marker ；A :NPTII基因特异性PCR扩增，B :35S+ADCR 基因特异性PCR扩增；P 质粒；PK:未转基因对照；1-8、10-14、19、21 转基因株系)；图7是本发明其中一个实施例中单拷贝插入T3代纯合转基因拟南芥株系结果。图8本发明部分单拷贝插入1代纯合转PtADC基因株系表达分析(图中adcl-l 阴性对照；21 (3) a、5 (2) a5 (2) a、19 (4) d、14 (6) f 转 PtADC 基因株系)。图9本发明实施例中转PtADC基因株系adcl-l-OE(图8中5(2)a株系)及对照 多胺含量分析(adcl-1 阴性对照；adcl-1-OE 转基因株系；adcl-l和adcl-1-OE在土中生 长Weeks，多胺含量测定重复三次，数值为平均值士标准误。“*”表示经过学生t测验， adcl-1-OE 多胺含量显著(0. 01 < P < 0. 05)高于 adcl-1)。图10是本发明中实施例中转PtADC基因株系adcl-l-0E(图8中5 (2) a株系，图 中为0E)及非转基因植株(adcl-1)在种子萌发时耐渗透能力外观图(A在MS培养基上14d 后的萌发情况；B在含400mM甘露醇的MS培养基上14d后的萌发情况)。图11是本发明中实施例转PtADC基因株系adcl-1-OE (图8中5 (2) a株系，图中 为0E)及非转基因植株(adcl-1)在种子萌发时2(1、4(1、6(1、8(1、10(1、12(1、14(1耐渗透能力统 计(A，MS培养基；B，MS+400mM甘露醇培养基)。图12是本发明中实施例转PtADC基因株系adcl-1-OE(图8中5(2)a株系)及非 转基因植株生长10d后室温脱水后失水率(A，n = 30)和相对电导率(B)。图13是本发明中实施例转PtADC基因株系adcl-1-OE (图8中5 (2) a株系)及 非转基因植株生长于土壤中3w后进行控水干旱处理的表现(A :adcl-l和0E控水前，控水 15d、18d的表型；B 控水18d后的adcl-1和0E的相对电导率；C 控水18d后的adcl-1和 0E的存活率)。图14是本发明中实施例转PtADC基因株系adcl-1-OE (图8中5 (2) a株系，图中 的0E)及非转基因植株(图中的adcl-1)在生殖期控水干旱处理后的表型比较。图15是本发明中实施例转PtADC基因株系adcl-1-OE(图8中5(2)a株系，图中 的0E)及非转基因植株(图中的adcl-1)生长于土壤中3w后0°C低温处理1天及复温15 天后表型(A)、相对电导率(B)、叶绿素含量(C)和存活率(D)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例， 本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 :PtADC基因的分离克隆以 arginine decarboxylase 为关键词搜索柑桔 EST 数据库(www. harvest, ucr. edu，HarvEST :Citrus ver. 0. 51)，得到26个相近序列，将初选的上述26个相近的序列用 CAP3(公用软件)组成一个完整序列，以该序列为模板用Primer Premier 5. 0软件设计引 物，用常用的RT-PCR方法(参照J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王 嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)扩出序列的全长。于4°C
5低温下胁迫下枳壳叶片抽提RNA及反转录，所得的第一链cDNA用于扩增序列全长。RNA 抽提方法参照Trizol试剂盒的说明书(购自Irwitrogen公司，按照该试剂盒提供的操 作说明书操作)，将3 ii g抽提的总RNA样品用经1U的DNasel (Amplification Grade,， 购自 Invitrogen 公司)室温(25 °C )处理 15min 后，加入 1 y L EDTA(25mM)，于 65°C 温 育lOmin。第一链cDNA的合成按MBI反转试剂盒说明书操作(试剂盒货号K1621，购自 Fermentas 公司)。扩增 PtADC 的正向引物是 5’ -CCCCCTCGTTTTTTCTTTTTCTT-3’ ；反向引物 是 5，-TGTTCAACTGCTTCCATCTTTTG-3，。20 ii L 的反应体系中包括 lOOng cDNA, 1 X 缓冲液， 2mM MgCl2,0. 2mM dNTP，0.5U 聚合醇(Taq and Pfu, Fermentas, Lithuania)力口 0.4iiM 弓| 物。PCR 反应在 ABI 9700 (Applied Biosystem)上按以下设置完成94°C，3min，94°C变性 308，511退火308，721延伸180s，30个循环；循环完成后72°C延伸7min。产生的单一 PCR 条带产物(见附图3)经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，用E.Z.N. A^DNA凝胶回收试剂盒(购 自Omega公司，美国)回收特异带，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书。回收纯化的DNA 溶液与商业载体即pGEM-T easy载体(购自Promega公司)进行连接反应，操作按Promega 公司的说明书进行，连接反应体系中插入片段与载体的摩尔数比为3-10 1。连接反应总 体积为5 u L，其中包括2. 5 y L的2X缓冲液(该试剂盒自带)，1. 5 y L纯化的PCR产物， 0.5iiLT-eaSy载体(该试剂盒自带)，0.51^ T4连接酶(该试剂盒自带)。16°C过夜连接。 取5 yl连接产物，采用热击法(参照J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂， 王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)转化大肠杆菌DH5 a，在 含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(测序工作由上 海联合基因公司完成)，测序结果表明，该基因序列全长为2493bp，通过测序、比对确定为 PtADC基因，它包括2256bp的开放读码(0RF)，编码751个氨基酸(参见序列表SEQID N0 1)，等电点为5. 14，预测的分子量为80. 53kD。PtADC推导的PtADC基因编码的氨基酸与葡萄 (X96791)、烟草(AF127240、AF127241)、苹果(AB181854)编码的氨基酸分别有 71 %、70%、 69%的同源性。多序列比对结果显示，本发明克隆的PtADC基因包括两个保守的氨基酸结 构域ADC家族2磷酸吡哆醛结合位点和ADC家族2标记2序列。iPSORT和SignalP分析 表明编码的氨基酸PtADC N-末端包含着一个叶绿体定位序列。实施例2、植物转化载体构建根据pMV载体(切除⑶S基因的植物二元转化载体PBI121，该载体由华中农业大 学园艺林学学院叶志彪教授惠赠，见图2所示)的多克隆位点和PtADC基因的编码区序列， 按照一般设计引物的原则用Primer Premier5. 0软件设计出扩增PtADC基因整个编码区的 正向和反向引物。所用的正、反向引物5’端分别加有Xho I和Kpn I酶切位点(酶切位点 序列加下划线表示，如下)，并在酶切位点识别序列外侧分别加上3个保护碱基，以利于酶 切反应的顺利进行。所述引物对的DNA序列如下正向引物5，-CCGCTCGAGCCCCCTCGTTTTTTCTTTTTCTT-3，反向引物5，-CGGGGTACCTGTTCAACTGCTTCCATCTTTTG-3，以PtADC基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为61°C。PCR 反应体系及扩增程序同实施例1。双酶切体系反应总体积为2(^1^，其中含有？0 的纯 化产物 10yL，10X 缓冲液(MBI，100mmol/L Tris-HCl, pH8. 3，500mmol/L KC1 ；0. 明胶 (gelation)和 15mmol/L MgCl2) 2 u L, Kpn I 及 Xhol 各 1 ii L，双蒸水 6 ii L)。在 37°C酶切过
6夜后纯化回收。PMV载体的双酶切体系反应总体积为20 y L，其中含有经过质粒提取获得 的 pMV 载体 DNA 8uL,10X 缓冲液(MBI) 2u L,Kpn I 及 Xho I 各 1 ii L，双蒸水 8 ii L。37°C 酶切过夜后纯化回收。连接反应体系中插入片段与载体的摩尔数比为3 1，反应总体积 为10iiL，其中含有10X缓冲液(MBI)liiL，T4DNA连接酶1 ii L，PtADC基因的双酶切回收 产物4iiL，pMV载体的双酶切回收产物2iiL，双蒸水2iiL。在16°C反应14_16h。连接产物 转化大肠杆菌菌株DH5ci，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质 粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，我 们将该载体命名为pMV-PtADC。应用冻融法(参照J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂 斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)将所述的 载体pMV-PtADC导入到农杆菌EHA105中。植物真核表达载体pMV-PtADC的构建流程见图 2所示。构建完成后的pMV-PtADC，经KpnI/XhoI双酶切，获得约为2300bp和近14000bp的 2条DNA片段(见图4)。实施例3、植物遗传转化应用冻融法(参照J.萨姆布鲁克，等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三 版)，科学出版社，2002版)将pMV-PtADC载体导入到农杆菌EHA105中，转化性状稳定且纯 合的拟南芥T-DNA插入AtADCl突变体adcl-1中(日本理化学研究所，Shinozaki课题组 惠赠)，遗传转化后阳性植株通过自交三代，获得纯合的转基因株系。具体地，本实施例利用根癌农杆菌介导的拟南芥遗传转化步骤如下1、拟南芥的培养取4°C春化2d后的拟南芥种子洒播于充分润湿的基质中(按照重量份计营养 土 蛭石=1 1)，温室中培养(22°C，16h光照；16°C，8h黑暗)。长至抽苔开花，从苔下 lcm处剪去第一次抽苔的花序，长出更多花序后用于转化。2、农杆菌菌液的制备取检测正确、划线培养的单克隆接种的农杆菌接种于10毫升LB液体培养基(含 卡那霉素(Km)50mg/1，利福平(Rif)50mg/1, pH7. 0)中，28 °C、250rpm 培养 30h，取菌液 1.5mL 按体积比为 1 100 转接到 150mL LB (Km50mg/L, Rif :50mg/L)中，28°C、250rpm 培养 过夜，至0D6QQ = 0. 8 ；4°C，于3000g离心lOmin，所收集的菌体重悬于5%蔗糖溶液，转化前 加入0.02% Silwet L-77(—种表面活性剂，购自美国GE公司)。3、转化将新鲜的拟南芥植株倒置，使其花蕾朝下并浸入渗透液(5%蔗糖溶液5g蔗糖 +100mLddH20)中，至少保持3s并轻轻搅动，使渗透液的水珠覆于所述的花序上。将转化后 的拟南芥植株竖放，盖好保鲜膜，浇水保温(22°C)于低光强度(SOiimol m^s-1)下生长24h 后置于正常光照(lOOymol m^s-1)条件下生长，直到开花结荚收集种子。4、阳性转基因拟南芥初步确定将转adcl-1超表达adcl-1-OE种子4°C春化2d，0. lg在1.5mL的离心管中，加 入lmL 1.5%次氯酸钠表面消毒8min，充分振荡，弃去次氯酸钠后用灭菌双蒸水洗5次，用 0. 琼脂播于具有50mg/l卡那霉素(Km)的MS培养基的培养皿上，抗性苗在抗性平板上 能正常生长，为绿色，而非抗性苗则黄化死去。待绿苗长至四片真叶时移至土中，盖上保鲜 膜保水，4d后去膜，至幼苗8片真叶时，即可剪取叶片，提取其叶片基因组DNA，进行阳性植
7株的分子鉴定。农杆菌侵染植株当代所结的种子记为L代种子，该种子经抗性筛选长出的 植株为代植株。用的叶片做PCR检测，阳性植株做好标记并收获种子记为代种子， 该种子经含50mg/l卡那霉素(Km)的MS培养基筛选长出的植株为T2代植株，所结的种子 为T2代种子。用一部分T2代的种子播种于抗性平板上，如果T3代植株全部是绿色抗性苗， 则证明该单株为纯系转基因植株。实施例4、转化植株的分子及生理鉴定1、拟南芥叶片总DNA提取取适量的拟南芥叶片放入1. 5mL离心管中，加液氮，充分研磨后；加入700 u L 65°C预热的 DNA 提取 CTAB 缓冲液(100mM Tris-HCl, pH 8. 0)，1. 5M NaCl,50mM EDTA, pH 8. 0)溶液加聚乙烯吡咯烷酮，2%十六烷基三乙基溴化铵，65°C水浴充分溶解备用，用 前65°C水浴预热后，加入1-4%巯基乙醇，混勻)，65°C温浴60-90min，隔15min取出上下轻 轻颠倒混勻；10000g，离心lOmin ；取上清，加600 y L氯仿，颠倒混勻静置3min ； 10000g，离 心15min ；取上清450 u L，加入900 u L预冷无水乙醇，420 u L5M NaCl，混勻后，冰冻30min, 10000g，离心lOmin ；弃上清后，用lmL 75%浓度的乙醇，洗涤3次后，加适量ddH20溶解。2、阳性转基因拟南芥PCR检测用NPTII引物和基因内引物(35S+PtADC)进行PCR扩增，所述的引物序列及反应 程序见表1-1、1_2、1-3。表1-1引物序列信息 表1-2PCR反应程序 表1-3PCR反应体系 10XPCR 缓冲液成分100mmol/L Tris-HCl, pH8. 3,500mmol/L KC1 ；0. 1 % gelation (明胶)禾P 15mmol/L MgCl23、转基因拟南芥的超表达分析提取同时收种、同时种植的adcl-1和T3代单拷贝超表达株系叶片RNA， 除去残留的DNA，反转录方法同实施例1所述，用PtADC基因特异引物(正向引物 5，-GGTCGAAACCGGAGCTGTTG-3，；反向弓丨物GSP2，5，-GCCCCCGATGTCAATCACTT-3，) 进行 RT-PCR，反应程序为 94 °C，3min, 94 °C 变性 30s，61 °C 退火 30s，72 °C 延伸 45s， 30个循环；循环完成后72 °C延伸5min。用Tubulin做内对照(正向引物R 5，-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3，；反向引物5，-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3，。 利用浸花法(Clough and Bent,Floral dip :a simplified method for Agrobac terium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaiiana. Plant J，1998，16 :735_743) 转化得L代转基因拟南芥株系，收获的I代种子经MS基本培养基+50mg/l卡那霉素(Km) 平皿筛选和PCR鉴定得抗性代转基因杂合株系(见附图5、图6)。单株收代种，再经 MS基本培养基+50mg/l卡那霉素(Km)平皿筛选，得T2代株系，若Km抗性(绿苗)非Km 抗性(白化苗)为3 1的株系为单拷贝插入株系，将具Km抗性的T2代单株收种，取单拷 贝插入株系的单株种子经MS基本培养基+50mg/l卡那霉素(Km)平皿筛选，完全为Km抗性 (绿苗)的是T3代纯合株系(见附图7)。选取T3代纯合株系进行超表达分析，发现在选取 的株系5 (2) a中ADC表达量最高，命名为adcl-1-OE (见附图8)，选取此株系做进一步研究。4、转基因拟南芥的多胺含量分析将6周龄的adcl-1、0E整株材料用液氮研磨，取0. lg左右的样品粉末，加入lmL 5%的高氯酸，混勻后冰浴30min，4°C 10000g离心15min，取上清至另一离心管，沉淀再加 入lmL 5%的高氯酸混勻，冰浴30min后经10000g离心15min，取上清，收集两次上清液，混 勻后，取200 u L，加入200 u L饱和碳酸钠、5 y L己烷二胺(100 u M)和400 u L的丹磺酰氯 (10mg/mL)，摇勻后60°C暗反应lh，加入100 u L100mg/mL的脯氨酸，60°C暗反应30min之 后，加入400 iiL的甲苯，混勻后10000g室温离心lOmin。吸400 y L上清，真空干燥仪中干 燥，加入lmL甲醇溶解，0. 22um有机滤膜过滤后取20 y L在高效液相色谱仪上上样。荧光 检测波长激发波长为365nm，发射波长为510nm。采用梯度洗脱，洗脱程序见表1_2。流速 lmL/min，柱温30°C。组织中多胺含量采用相对校准法，组织多胺的量与内对照己烷二胺量的比=所在峰面积比，单位为nmol g_VW。结果表明超表达植株腐胺含量提高了 2倍，经t 检测，转基因植株较与对照有显著差异，而亚精胺、精胺含量基本不变(见附图9)。实施例5、转基因植株的抗性评价同批收的拟南芥adcl-1和0E纯系种子处理同实施例3中步骤4，播于MS基本培 养基(pH5. 8)、MS基本培养基+400mM甘露醇渗透培养基(pH5. 8)上，每皿每个系取30棵种 子，处理重复3次，相同的实验结果至少重复3次。在普通MS培养基上，adcl-1和0E之间 种子萌发情况没有差异，在渗透培养基上，这些种子萌发均受到抑制，但0E受抑制程序低 于adcl-1，表明0E种子渗透调节能力强，能较好地忍耐渗透胁迫(附图10、11)。同批收的拟南芥adcl-1和转adcl-1超表达纯系adcl-1-OE种子，灭菌处理后播 于MS基本培养基上(pH5. 8)，取每个转基因拟南芥株系10d大的幼苗30株置于培养皿上自 然脱水50min，每10分钟测定鲜重，计算失水率，并测定最后一个时间点(50分钟)的电导 率，以脱水前的材料的(刚开培养皿盖时)为对照。结果表明，0E失水较adcl-1慢，失水 50min后0E电导率较adcl-1低(见附图12)。将3周龄大的adcl-1、adcl-l-0E进行控水干旱胁迫试验，于相对湿度为50%正常 生长条件下停水培养18d。结果表明，停止浇水15d后，0E叶片饱满，光泽度强，adcl-1有 萎蔫现象出现，控水第18d后，0E莲叶座下部叶片部分萎蔫，而adcl-1此时开始死亡，0E电 导率较adcl-1低，存活率高于adcl-1 (见附图13)。在抽苔期间进行控水干旱胁迫，0E成 活情况明显优于adcl-1 (见附图14)。将16h光(50iimol n^s—1)/8h暗光周期、23 士 1°C下生长4周的盆栽转基因拟南芥 苗各17棵，于16h光(50 u mol mH/Sh暗环境下0°C处理24h，结果表明，低温处理后0E 叶片饱满，生活力强，adcl-1叶片发黄，生活力弱，复温15d后，0E仍继续生长，有抽薹发生， adcl-1已死亡。低温(0°C )处理后，0E的电导率低于adcl-1，叶绿素含量高于adcl-1，存 活率高于adcl-1，表明0E耐低温能力高于adcl-1 (见附图15)。序列表<110>华中农业大学<120>利用枳精氨酸脱羧酶基因PtADC提高植物抗旱耐寒能力<130><141>2010-03-03<160>4<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>2493<212>DNA<213> 积(Poncirus trifoliata)<220><221>gene<222>(1). . (2493)<223><220>
100090]<221>CDS0091]<222>(85)..(2340)0092]<223>0093]<400>10094]ccccctcgtt ttttcttttt cttttttttc ttctttaattctttaaaaaa aggccgcact600095]tttactcgtc tccgcggaaa gagg atg ccg gcc ctc ggg tgt tgc gta gac1110096]Met Pro Ala Leu Gly Cys CysVal Asp0097]150098]getgccgtagcgcctcctgcctacgccaactccccactcggctccctc1590099]AlaAlaValAlaProProAlaTyrAlaAsnSerProLeuGlySerLeu0100]101520250101]cccgcgccgccgccgctgccgctttcttttaactccggcacateacca2070102]ProAlaProProProLeuProLeuSerPheAsnSerGlyThrSerPro0103]3035400104]cccacacctatgtcccctacctccgccteggetggttctgttgccgcc2550105]ProThrProMetSerProThrSerAlaSerAlaGlySerValAlaAla0106]4550550107]gacgtggacgetteacattggtegccgtctcacteggcategttgtat3030108]AspValAspAlaSerHisTrpSerProSerHisSerAlaSerLeuTyr0109]6065700110]ategactcctggggtgcgccctacttcgccgtcaacccatccggc3510111]LyslieAspSerTrpGlyAlaProTyrPheAlaValAsnProSerGly0112]7580850113]aacgtctccgtccgtccgtacggccacgccacgctggcccaccaggag3990114]AsnValSerValArgProTyrGlyHisAlaThrLeuAlaHisGinGlu0115]90951001050116]attgacctgctcaagattgttaagaaggttacggatccgteagtc4470117]lieAspLeuLeuLyslieValLysLysValThrAspProLysSerVal0118]1101151200119]ggtgggctcgggttgcagctccctctcategtceggctgccggacgtg4950120]GlyGlyLeuGlyLeuGinLeuProLeulieValArgLeuProAspVal0121]1251301350122]ctcagggaceggcttgagtcccttcagteggcctttgaattcgetate5430123]LeuArgAspArgLeuGluSerLeuGinSerAlaPheGluPheAlalie0124]1401451500125]cagacgcaatgctacgaggcccattatcagggggtgttccccgtg5910126]GinThrGinCysTyrGluAlaHisTyrGinGlyValPheProValLys0127]1551601650128]tgtaaccaggaceggttcgttgtggaggatattgtgttcgggteg639
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12CN 101851634 A说明书10/15 页
0129]CysAsnGinAspArgPheValValGluAsp lie Val Lys Phe Gly Ser0130]170175180 1850131]cagttceggttcgggttggaagccgggteg aaa ccg gag ctg ttg ttg6870132]GinPheArgPheGlyLeuGluAlaGlySer Lys Pro Glu Leu Leu Leu0133]190195 2000134]getatgagttgcttgtgcggaagecct gaa get ttg ctc gtt tgt7350135]AlaMetSerCysLeuCysLysGlySerPro Glu Ala Leu Leu Val Cys0136]2052102150137]aatggattcgatgetgaatacateacc ctc get ttg ctg gcg agg7830138]AsnGlyPheLysAspAlaGluTyrlieThr Leu Ala Leu Leu Ala Arg0139]2202252300140]aagetagetttgaacgcagtgattgtgeta gag caa gaa gag gag gtc8310141]LysLeuAlaLeuAsnAlaVallieValLeu Glu Gin Glu Glu Glu Val0142]2352402450143]gatttggttattgagataageaagaagctg aat gtc cga ccc gtg att8790144]AspLeuVallieGlulieSerLysLysLeu Asn Val Arg Pro Val lie0145]250255260 2650146]ggcgetegg0168]ThrLeuGluGluTyrAlaSerAlaValVal Gin Ala lie Arg Tyr Val0169]3803853900170]tgtgaceggaagaatgttaagcatcctgtg ctt tgc age gag age ggt13110171]CysAspArgLysAsnValLysHisProVal Leu Cys Ser Glu Ser Gly0172]3954004050173]cgtgetattgtgtctcatcattccattttg ata ttt gaa get gtt teg13590174]ArgAlalieValSerHisHisSerlieLeu lie Phe Glu Ala Val Ser0175]410415420 4250176]getagtgtctcccgtgccgccccggttget atg agt cct ctt ggt ttg14070177]AlaSerValSerArgAlaAlaProValAla Met Ser Pro Leu Gly Leu0178]430435 4400179]cagtatttggtagaagggttgactgaggat get cgt teg gat tat aca14550180]GinTyrLeuValGluGlyLeuThrGluAsp Ala Arg Ser Asp Tyr Thr0181]4454504550182]aagatgactactgetgetctgagaggtgag ttt gag acc tgt ttg ttc15030183]LysMetThrThrAlaAlaLeuArgGlyGlu Phe Glu Thr Cys Leu Phe0184]4604654700185]tatgetgatcaattgcaaagatgcatt gaa cag ttt aag gat ggg15510186]TyrAlaAspGinLeuLysGinArgCyslie Glu Gin Phe Lys Asp Gly0187]4754804850188]actttgggtattgaacagttagetactgtt gat ggg ttg tgt gat ttt15990189]ThrLeuGlylieGluGinLeuAlaThrVal Asp Gly Leu Cys Asp Phe0190]490495500 5050191]gtagetaaggaaataggtgcatctgatcct gtt cgt act tat cat gtg16470192]ValAlaLysGlulieGlyAlaSerAspPro Val Arg Thr Tyr His Val0193]510515 5200194]aatetatctattttcactteaattccggat tat tgg ggc att ggt cag16950195]AsnLeuSerliePheThrSerlieProAsp Tyr Trp Gly lie Gly Gin0196]5255305350197]ttgtttcctattgttccaattcatcatttg gat gag agg cct gga gtg17430198]LeuPheProlieValProlieHisHisLeu Asp Glu Arg Pro Gly Val0199]5405455500200]agggggattttateggatttgacttgtgat agt gat ggt aag ate gat17910201]ArgGlylieLeuSerAspLeuThrCysAsp Ser Asp Gly Lys lie Asp0202]5555605650203]aagttcattggtggtggtacgagettgcct tta cat gaa atg gtt ggt18390204]LysPhelieGlyGlyGlyThrSerLeuPro Leu His Glu Met Val Gly0205]570575580 5850206]ggtggtggtggtgagcgtgggccttattat ttg ggg atg ttc ttg ggc1887
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23
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1权利要求
一种分离克隆的来源于枳(Poncirus trifoliata)的具有抗旱耐寒功能的PtADC基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一种分离克隆的来源于枳(Poncirus trifoliate)的具有抗旱耐寒功能的PtADC基 因，它的编码序列如序列表SEQ ID NO 1的第85-2340位所示。
3.扩增权利要求1所述基因的引物对，它的DNA序列如下所示 正向引物5，-CCCCCTCGTTTTTTCTTTTTCTT-3，；反向引物5，-TGTTCAACTGCTTCCATCTTTTG-3，。
4.权利要求1所述的基因在提高植物抗旱耐寒中的应用。
5.权利要求2所述的基因在提高植物抗旱耐寒中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及柑橘类植物的基因工程技术领域。从柑橘类植物枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到一种抗旱、耐寒的精氨酸脱羧酶基因PtADC，它的编码序列如序列表SEQ ID NO1的第85-2340位所示。将该基因导入到模式植物拟南芥或烟草中进行生物学功能验证和遗传转化，获得转基因植株。所述的转基因植株具有明显的抗旱耐寒能力。本发明的基因有望在柑橘类植物中获得进一步的应用。
文档编号C12N9/88GK101851634SQ20101012074
公开日2010年10月6日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者刘继红, 孙培培, 张庆福, 王静 申请人:华中农业大学