专利名称：：抗α-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体及其抗原、制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗体，更具体地说，本发明涉及一种抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体及其抗原。同时，本发明还涉及一种所述抗体的制备方法及其在预防和治疗II型糖尿病中的应用。
背景技术：
：近年来，由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者为2.46亿人，我国有糖尿病人5000万，是糖尿病人口最多的国家，其中90%以上为II型糖尿病。糖尿病在对身体造成损伤的同时容易引起严重的并发症，主要有心脑血管病、肾病、失明、免疫力降低等。糖尿病及其并发症严重的威胁着人类健康，可使患者致残甚至危及生命，造成严重的经济和社会负担。I型糖尿病为胰岛素的绝对缺乏，常是由于胰岛13细胞破坏致胰岛素绝对不足所致，该型糖尿病以胰岛素治疗为主。II型糖尿病主要是胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足所致。11型糖尿病占糖尿病的大多数，可占至90%以上，对11型糖尿病的药物治疗主要是利用药物控制血糖升高及防治并发症，目前临床上应用的降糖药物主要有磺脲类、双胍类、糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、非磺脲类胰岛素促分泌剂等。其中，a-葡萄糖苷酶抑制剂是通过竞争性抑制小肠粘膜上的葡萄糖苷酶。碳水化合物的吸收主要在小肠内完成，位于小肠粘膜上的葡萄糖苷酶能够将多糖和双糖分解成为小肠能够吸收的葡萄糖。因此可以通过抑制葡萄糖苷酶的活性，从而抑制了淀粉、蔗糖、麦芽糖的分解，减少葡萄糖吸收，降低餐后血糖，同时可降低餐后血糖升高而引起的胃肠道激素分泌增加，降低血脂，有利用防止动脉粥样硬化。本发明应用特异性抗体抑制葡萄糖苷酶的活性，达到治疗糖尿病及减少糖尿病发病率的目的。
发明内容本发明的一个目的是提供一种抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体。本发明所公开的抗体是通过特异性抑制a-葡萄糖苷酶的活性，以抑制糖类的吸收，达到降低餐后血糖的目的。本发明的另一目的是提供一种通过禽蛋生物反应器制备上述抗体的方法。将抗原直接或与佐剂充分乳化后对禽蛋生物进行免疫直至禽蛋生物产生该酶的抗体；收集该禽蛋生物所产卵，分离、纯化卵黄，得抗体。所述抗原为a-葡萄糖苷酶基因的全长或片段。所述禽蛋生物为鸡或鸭。本发明还同时提供一种制备抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的抗原的方法。通过基因克隆的方式克隆a-葡萄糖苷酶基因的全长或片段，应用原核或者真核表达的方式生产重组蛋白抗原。—种具有抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体，所述抗体为用上述制备方法获得的抗体。本发明的又一目的是将上述抗体在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。该药物可以抑制餐后血糖的升高，降低糖耐量下降的糖尿病早期患者的患病率。本发明的再一目的是将上述抗体作为食品、保健品或食品添加剂在治疗和预防n型糖尿病中的应用。直接食用或添加于食品中也可以降低糖耐量下降的糖尿病早期患者的患病率。本发明通过将抗原直接或与佐剂充分乳化后对禽蛋生物进行免疫直至禽蛋生物产生该酶的抗体；收集该禽蛋生物所产卵，分离、纯化卵黄，获得抗体的方式，能够获得效价高、对a-葡萄糖苷酶活性抑制能力强，同时降低获取成本；另外，进一步利用该抗体制备药品或食品，能够显著降低该药品或食品生产成本；另外，本发明提供的制备抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的抗原具有纯度高、易获取的特点，可以加速抗体的制备。图1为抗酶抗体对正常大鼠餐后血糖影响的曲线图；图2为抗酶抗体对正常大鼠餐后血清胰岛素水平影响的曲线图；图3为抗酶抗体对糖尿病大鼠餐后血糖影响的曲线图；图4为抗酶抗体对糖尿病大鼠餐后血清胰岛素水平影响的曲线图。具体实施方式实施案例一(1)抗原的制备一参照人a-葡萄糖苷酶基因序列，设计l对引物(引物序列为primerl:5'-CCCGAGCTCGTTGCCATTATCACAGAT-3，，prime2:5'-CCCCTCGAGTGGCATGTAGGGAGGGT-3')，应用PCR方法从RT-PCR所得的人小肠粘膜细胞cDNA文库中扩增a-葡萄糖苷酶基因片段1(2860bp-4399bp)，将PCR产物克隆到pET32a载体上，测序确认后，在细菌BL21中进行表达。重组蛋白以包涵体的形式存在，12000rpm离心收集细胞，裂解液(100mMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH8.0)重悬后经超声波破碎，收集上清过O.45um滤膜备用，Ni结合柱经平衡液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HCl、pH8.0)平衡后上样，洗柱后(100mMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH6.3)用高盐缓冲液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH4.5)洗脱收集SDS-PAGE胶检测，目的蛋白用PBS(pH7.4)透析24h，每隔6h换液一次。经鉴定抗原纯度达到90%以上。重组蛋白冷冻干燥储存。(2)抗原制备二参照人a-葡萄糖苷酶基因序列，设计l对引物(引物序列为primer1:5'-CCCGAATTCGTTGCCATTATCACAGATA-3'，primer2:5'-CCCCTCGAGCCCTGGGGGCTGGTCTC-3')，应用PCR方法从RT-PCR所得的人小肠粘膜细胞cDNA文库中扩增a-葡萄糖苷酶基因片段2(2860bp_3537bp)，将PCR产物克隆到pGEX-4Tl载体上，测序确认后，在细菌BL21中进行表达。重组蛋白以包涵体的形式存在，12000rpm离心收集细胞，裂解液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH8.0)重4悬后经超声波破碎，收集上清过O.45um滤膜备用，Ni结合柱经平衡液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HCl、pH8.0)平衡后上样，洗柱后(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH6.3)用高盐缓冲液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH4.5)洗脱收集SDS-PAGE胶检测，目的蛋白用PBS(pH7.4)透析24h，每隔6h换水一次。经鉴定抗原纯度达到85%以上。重组蛋白冷冻干燥储存。(3)抗原制备三参照人a-葡萄糖苷酶基因序列，设计l对引物(引物序列为primerl:5'-CCCGGATCCGTTGCCATTATCACAGATA-3'，primer2:5'-CCCCTCGAGCTCAGTGTACTGCTGGGT-3')，应用PCR方法从RT-PCR所得的人小肠粘膜细胞cDNA文库中扩增a-葡萄糖苷酶基因片段3(2860bp-3747bp)，将PCR产物克隆到pGEX-4Tl载体上，测序确认后，在大肠杆菌ROSSETA中进行表达。重组蛋白以包涵体的形式存在，12000rpm离心收集细胞，裂解液(100mMNaH2P04、10mMTris-HCl、8M尿素、pH8.0)重悬后经超声波破碎，收集上清过0.45um滤膜备用，Ni结合柱经平衡液(100mMNaH2P04、10mMTris-HCl、pH8.0)平衡后上样，洗柱后(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HCl、8M尿素、pH6.3)用高盐缓冲液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH4.5)洗脱收集SDS-PAGE胶检测，目的蛋白用PBS(pH7.4)透析24h，每隔6h换水一次。经鉴定抗原纯度达到80%以上。重组蛋白冷冻干燥储存。(4)抗原制备四参照人a-葡萄糖苷酶基因序列，设计l对引物(引物序列为primerl:5'-CCCGGATCCGTTGCCATTATCACAGATA-3'，primer2:5'-CCCCTCGAGCAGAATGAGGATGACCCGCA-3')，应用PCR方法从RT-PCR所得的人小肠粘膜细胞cDNA文库中扩增a_葡萄糖苷酶基因片段4(286(^。-4002&。)，将PCR产物克隆到pGEX-4Tl载体上，测序确认后，在细菌BL21中进行表达。重组蛋白以包涵体的形式存在，12000rpm离心收集细胞，裂解液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH8.0)重悬后经超声波破碎，收集上清过0.45um滤膜备用，Ni结合柱经平衡液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HCl、pH8.0)平衡后上样，洗柱后(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、p朋.3)用高盐缓冲液(lOOmMNaH2P04、10mMTris-HC1、8M尿素、pH4.5)洗脱收集SDS-PAGE胶检测，目的蛋白用PBS(pH7.4)透析24h，每隔6h换水一次。经鉴定抗原纯度达到80%以上。重组蛋白冷冻干燥储存。(5)抗原的制备五参照人a-葡萄糖苷酶基因序列，采用分段克隆的方法克隆此基因，即设计3对引物，引物序列分别为Fl:5'-CCCATTGCTAAGCCATCCTTCAGACAGAG-3，/Rl:5'-AATGCACCCAACTGCATCCACCGCCTACA-3，；扩增片段(l-2080bp)F2:5'-TGGATGCAGTTGGGTGCATTTTATCCGTTT-3'/R2:5'-GAAACTGCCCCATTCACGAAGCTTGATGGTT-3，；扩增片段(2081bp-4342bp)F3:5'-TTCGTGAATGGGGCAGTTTCTCCAGGCT-3，/R3:5'-TCACTTGCAAATTCACTTGTTTTATT-3';扩增片段(4343bp-6484bp)应用PCR方法从RT-PCR所得的人小肠粘膜细胞cDNA文库中扩增a-葡萄糖苷酶基因三个片段，大小分别为2080bp，2262bp和2142bp，胶回收各PCR产物后混合作为模板，重新按照载体需要设计引物GF:5'-CCCTACGTAATTGCTAAGCCATCCTTCAGA-3'，5GR:5'-GGGGCGGCCGCTCACTTGCAAATTCACTTGT-3'扩增得到人a_葡萄糖苷酶基因全长(6484bp)，并引入SnaBI与NotI两酶切位点。将上步得到的PCR产物与酵母载体pPIC9K用SnaBI与Notl双酶切后胶回收，链接转化DH5a，挑取阳性克隆测序确认后，Seal线性化后制成ssDNA，采用酵母的一步转化法转化GS115毕赤酵母，具体操作如下挑取单克隆挑取GS115单菌落于2mlYPD培养基中，3(TC，250rpm，振荡培养2428h。取1.5ml菌液以12，000rpm离心2min，弃上清，收集菌体。加入1mlddH20漩涡振荡悬浮，12，OOOrpm离心2min，弃上清。再加入35iU1MDTT，漩涡振荡悬浮菌体。然后按以下顺序加入PEG6000(50%)240ii1;LiAc(1M)36ii1;ssDNA(2.0mg/ml)25ii1;ddH202.Oil1。漩涡振荡使其充分悬浮。42。C热激1560min。12，OOOrpm离心2min，弃上清。沉淀加200400ii1ddH20悬浮后取100200iil涂板(His缺省YPD固体板)。30。C培养2_4d后，挑取阳性克隆，甲醇诱导蛋白表达。表达蛋白经硫酸铵沉淀后，过QFF-强阴离子层析交换柱20mMPBS(pH7.4)溶解沉淀，然后20mMPBS(pH7.4)平衡QFF-强阴离子层析交换柱，将PBS溶解的沉淀过柱吸附蛋白0.45um滤膜抽滤后，然后用20mMPBS含1MNaCl(p朋.5)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE胶检测。抗原的制备除了采取以上通过应用基因克隆技术克隆a-葡萄糖苷酶片段后应用原核或真核细胞进行表达得到的重组蛋白外，还可以采取以下几种方式得到1、从动物体内提取的该酶或该酶的片段，该动物优先选用猪。2、根据a-葡萄糖苷酶的基因序列设计的该酶的抗原表位而生产的重组蛋白。3、包含该a-葡萄糖苷酶全长或片段的基因片段或载体。4、根据该a-葡萄糖苷酶基因序列设计的基因片段或载体。实施案例二(1)抗体制备抗体制备采用如下方式将重组酶蛋白溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，调节浓度至lmg/ml，将该蛋白液与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化制备初次免疫抗原。优选鸡作为免疫动物，免疫采用颈部皮下多点注射的方式，每只母鸡注射l.Oml，即蛋白总量500ug。2周后使用不完全弗氏佐剂乳化抗原加强免疫，第3周同前处理再加强免疫一次。3天后采血，应用ELISA法检测血清中特异性抗体效价。当效价达到10000以上时，开始收集鸡蛋，4t:冷藏保存备用。每两个月或者在测定抗体效价降低的时候进行加强免疫。母鸡饲养条件为隔离饲养，自由摄食。(2)ELISA法测定抗体滴度1.将a-葡萄糖苷酶溶解于碳酸盐缓冲液(pH9.6)中，调节浓度至0.005mg/ml。将调好的的酶溶液加入酶标板中，每孔100ul，4t:静置18-24h。倾去上层酶溶液，并应用TBST飾1/孔清洗三次，加入1.5%的牛血清白蛋白(BSA)200ul37。C封闭4h，TBST清洗三次。2.每孔添加50ul的抗体提取物，室温静置4h，倾去蛋白液，TBST清洗三次。加入辣根过氧化酶标记的兔抗鸡IgG抗体(0.5ug/ml)50u1/孔，室温静置lh，TBST清洗三次。每孔加入TMB底物100ul，室温避光反应约10min，终止反应后450nm测定吸光度。结果分析，效价判断为经免疫组的0D值为未经免疫的对照组0D值的2.1倍以上时，认为有效价。ELISA效价测定结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)抗体纯化将免疫后的鸡蛋进行表面清洗。打蛋后，用于分离器将蛋黄和蛋清分离。蛋黄处理方法如下将蛋黄和9倍体积的去离子水，充分混合后4t:静置过夜，4000rpm离心10min，取上清，加入硫酸铵至终浓度40%，剧烈搅拌10min，静置2h，离心弃上清，沉淀重新溶解于PBS中，应用超滤的方法，截留100k-300k之间的部分，同时脱盐，然后应用冷冻干燥机将蛋白抗体干燥。SDS-PAGE检测抗体纯度。经检测结果如下抗体回收率约为70%，抗体纯度>95%。实施案例三毒理实验昆明小鼠，清洁级，体重22士3g，2月龄(合格证号SCXK(京)2004-0001)，由协和医科大学试验动物研究中心提供。试验动物饲养于清洁级饲养室，室温18-22t:，相对湿度40%-70%，12h日照和昏暗循环。实验小鼠60只，雌雄各半，适应性饲养3天后，随机分为两组(抗酶抗体组1、抗酶抗体组2、抗酶抗体组3、抗酶抗体组4、抗酶抗体组5、对照组)，每组10只(雌雄各5只)，抗酶抗体组小鼠灌胃给予0.5ml抗a-葡萄糖苷酶抗体(10mg/ml)，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。观察结果显示，该剂量的抗酶抗体对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内脏未见异常。说明卵黄抗体急性毒理是安全的。实施案例四抗酶抗体体外对酶活性抑制作用测定67mmol/L磷酸钾缓冲液(p朋.8)145iU，加入0.5mg/mla-葡萄糖苷酶(2，500unitsWakoCASNO.9001-42-7)5yl，阳性组中加入抗酶IGY，阴性对照组加入未经免疫IGY，各50ul，37"恒温10min，加入0.029mol/L硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，a_糖苷酶底物)10y1，37。C恒温反应10min，沸水加热3min，于400nm波长下测A值。酶活性抑制率采用下式IC=[1-(AC-AT)]/(AC-AP)*100AT:抗酶IGY样品吸光度AP:非免疫IGY样品吸收度AC:阴性对照组吸收度达到50%的抑制率(IC5。)需要的抗体量如表1显示表1IC5。需要抗体量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施案例五选取抗酶IGY-4和抗酶IGY-5为动物实验的实验样品，分别测定其对正常及糖尿病小鼠餐后血糖的影响。(1)抗酶IGY对正常大鼠餐后血糖及血清胰岛素的影响Wister大鼠，体重180-200g，6周龄(合格证号SCXK(京)2004-0001)，由协禾口医科大学试验动物研究中心提供。试验动物饲养于清洁级饲养室，室温18-22t:，相对湿度40%-70%，12h日照和昏暗循环。Wister雄性大鼠30只，适应性饲养一周，随机分为三组(对照组、抗酶IGY-4组、抗酶IGY-5组)，每组10只。抗酶IGY-4组给予100mg/kg(bodyweight)的抗酶IGY-4;抗酶IGY-5组给予100mg/kg(bodyweight)的抗酶IGY-5;对照组给予相同剂量的未经免疫的卵黄抗体，每次灌胃后喂食0.5g饲料(非单糖碳水化合物60%，蛋白质22%，脂肪10%，其他8%)，分别于0min、30min、60min、90min、120min和180min尾静脉采血，分别测定血糖值和血清胰岛素含量。结果如图1、图2所示。结果表明，和对照组相比，抗酶IGY-4组和抗酶IGY-5组的大鼠餐后的血清胰岛素分泌水平均升高，并在60min时达到最高水平，随着时间的延长血清胰岛素水平趋于平缓，在180min时和对照组处于相同水平，其中抗酶IGY-4组，效果尤佳。从餐后血糖的变化曲线可以看出，服用抗酶IGY的大鼠餐后血糖曲线变化趋缓，峰值明显降低。说明抗酶IGY能够在一定程度的抑制糖类的吸收，并具有一定的促进胰岛素分泌的作用，从而达到抑制餐后血糖升高的作用，抗酶IGY-4组效果优于抗酶IGY-5组。(2)抗酶IGY对糖尿病大鼠餐后血糖的影响实验动物采用雄性Wister大鼠，饲养条件如上。采用高糖高脂饲料(脂肪30%、蛋白饲料60%、碳水化合物10%)喂养结合注射小剂量链脲佐菌素(STZ，25mg/kgbodyweight)的方法建立2型糖尿病模型，建模成功后，随机分为三组(抗酶IGY-4组、抗酶IGY-5组和对照组)，每组10只。抗酶IGY-4组给予100mg/kg(bodyweight)的抗酶IGY-4;抗酶IGY-5组给予100mg/kg(bodyweight)的抗酶IGY-5;对照组给予相同剂量的未经免疫的卵黄抗体，每次灌胃后喂食O.5g饲料(非单糖碳水化合物60%，蛋白质22%，脂肪10%，其他8%)，分别于0min、30min、60min、90min、120min和180min尾静脉采血，分别测定血糖值和血清胰岛素含量。结果如图3、图4所示。结果表明，糖尿病大鼠模型的血糖值明显高于正常大鼠(空腹血糖值平均达到15.lmmol/l，高于糖尿病建模标准11.lmmol/l)，说明建模成功。大鼠进食后血糖升高，在30min时达到最高值，随着时间的延长血糖值逐步降低，给予抗酶抗体的大鼠血清胰岛素水平变化不明显，餐后血糖升高降低，变化趋势明显趋缓，和对照组相比，餐后2h内血糖平均值和对照组相比降低显著。权利要求一种制备抗α-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的抗原，其特征在于，所述抗原为α-葡萄糖苷酶的全长或者片段。2.—种权利要求l所述的抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的抗原的制备方法，其特征为，克隆a_葡萄糖苷酶基因的全长或者片段，并连接到表达载体上，测序确认后，在细菌或者酵母中进行表达。3.—种抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于，将抗原直接或与佐剂充分乳化后对禽蛋生物进行免疫直至禽蛋生物产生该酶的抗体；收集该禽蛋生物所产卵，分离、纯化卵黄，得抗体。4.根据权利要求3所述的一种抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述抗原为权利要求1或2所述的抗原。5.根据权利要求3或4所述的一种抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述禽蛋生物为鸡或鸭。6.利用权利要求3或4或5所述制备方法制备得到的抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体。7.权利要求6所述的抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体作为食品或食品添加剂在治疗和预防II型糖尿病中的应用。8.权利要求6所述的抗a-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体在制备治疗和预防II型糖尿病药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种抗α-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体及其抗原。一种制备抗α-葡萄糖苷酶活性卵黄抗体的抗原，所述抗原为α-葡萄糖苷酶的全长或者片段。将所述抗原直接或与佐剂充分乳化后对禽蛋生物进行免疫直至禽蛋生物产生该酶的抗体；收集该禽蛋生物所产卵，分离、纯化卵黄，得抗体。本发明通过将抗原直接或与佐剂充分乳化后对禽蛋生物进行免疫直至禽蛋生物产生该酶的抗体；收集该禽蛋生物所产卵，分离、纯化卵黄，获得抗体的方式，能够获得效价高、对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力强，同时降低获取成本。文档编号A23L1/29GK101792750SQ20101012154公开日2010年8月4日申请日期2010年3月3日优先权日2010年3月3日发明者刘磊,支旭勃,王俊,郭海荣申请人:珠海市英平生物科技有限公司