专利名称：一种快速有效获得脐带间充质干细胞(msc)的方法
技术领域：
本发明是一种快速有效获得脐带MSC的方法，具体地说是利用细胞培养技术和合理的组织处理技术提高获得脐带MSC得率和速度，并快速鉴定的方法。
背景技术：
间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中。MSC具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下可分化为造血细胞、肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞。同时MSC除了具有干细胞的一般生物学特点外，还具有免疫调节功能。此外该细胞还具有来源相对方便，易于分离、 培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。因此近年来MSC已成为干细胞研究中的热点，在免疫疾病治疗、造血干细胞移植、组织工程、基因工程等领域具有较好的应用前景。MSCs可以抑制淋巴细胞的增殖，具有很强的免疫调节功能。体内实验证实，MSC移植能够明显延长移植皮肤的存活时间和减少异基因造血干细胞移植GVHD，我们也成功利用 MSC移植治疗了数十例系统性红斑狼疮患者。目前认为这个MSC分泌各种免疫调节分子，与免疫细胞的接触，低免疫原性、诱导嵌合体形成从而诱导免疫耐受调控机体免疫有关。目前的研究表明MSC还可以治疗缺血性疾病。MSC和外周血干细胞联合移植可以促进乳腺癌患者和高危急性髓性白血病患者的造血恢复，并没有相关的负作用，显示了良好的促造血恢复的能力。MSC细胞的这种治疗效果与MSC分泌各种造血因子及生成骨髓基质且有利于造血干细胞的体外扩增、造血干细胞移植后的归巢及植入、可缩短移植后骨髓造血功能恢复的时间有关。同时在大鼠大脑动脉阻塞和心肌梗死模型的研究中均发现，MSC 细胞具有改善病症的作用。同时MSC作为一种干细胞，也具有干细胞多向分化潜能，MSC可以治疗先天性骨形成不良、异染性脑白质营养不良(MLD)和赫尔利综合征，在帕金森症，老年痴呆症，脊椎损伤，烧伤的治疗也有报道。此外MSC可以作为携带外源基因的良好载体，已经有人把细胞因子，如IL23、EPO 等导入MSC细胞内，进入体内后获得长时间稳定表达。有人把IFNii的基因导入MSC内，发现肿瘤的微环境容易使MSC植入，进入肿瘤内的MSC通过分泌IFNii细胞因子抑制肿瘤生长，显示了 MSC具有可能的肿瘤生物治疗功能。这些结果都提示了 MSC广泛的治疗功能，目前世界各国均投入大量的人力物力财力进行广泛和深入的研究。但上述的治疗方案都需要大量的MSC进行移植，因此建立稳定有效快速的MSC资源库具有极为重要的意义。—般认为MSCs在骨髓组织中的含量最丰富，但是随着年龄的老化，自体骨髓中 MSCs数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退，并存在病毒感染的潜在危险，同时供体MSC 的采集困难，使得寻找骨髓以外其它可替代的MSCs “资源库”的研究被提上日程。目前，已经从脂肪、胚胎、羊膜液、胎盘、脐带血以及脐带等骨髓以外的组织中分离出MSC。而在这些组织中，脐带属于医疗废弃物，最容易获得，且对其研究及应用不涉及伦理学问题，并且具有稳定大量的来源，因此具有研究的价值。目前的研究表明，脐带间充质干细胞存在于脐带沃顿胶和血管周围组织中，在该部位培养获取的成纤维细胞样，表达α-平滑肌肌动蛋白及多种MSCs标记物(⑶四、CD44、CD51、CD105、SH2、SH3)，但不表达内皮或白细胞特殊抗原 ⑶34、⑶45。同时在脐带间充质干细胞培养基中加入5-氮胞苷，MSCs向心肌细胞分化，改变培养条件还可向脂肪细胞和骨细胞分化，提示了脐带MSC细胞和骨髓MSC细胞具有相同的表型和分化潜能。目前用于分离间充质干细胞的方法主要有4种，即流式细胞分选法、磁珠分离法、 密度梯度离心法和贴壁筛选法。对流式细胞分选法和磁珠分离法来说，因迄今尚未发现间充质干细胞特异性很强的表面标记物，研究者需要选用多个表面标志进行检测；此外，这两种方法对细胞活性的影响较大、实验条件要求较高，并不利于细胞的分离分选，故目前尚未广泛应用。密度梯度离心法由于需要较精密的仪器和合适的分离液，对细胞也有一定的影响，并不适合用于大规模的生产应用。而贴壁筛选法，所获的细胞形态均一，增殖速度快，生长状态稳定，且操作简便，成本低，有望成为较实用的生产方法。相关文献报道了脐带MSC 细胞的获取方法，获取效率相对较低，速度较慢。我们改进了传统的内皮细胞消化方法和消化酶的配方，采用半组织贴壁方法可以大量快速的获取脐带MSC细胞。并有很高的获得效率和得率。本方法简单易行，更有利于用于生产实践。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过优化脐带组织消化酶配方和消化细胞贴壁的方式， 快速有效利用新生胎儿的脐带为资源获取脐带MSC以及快速MSC鉴定的方法，具体如下1.剪取剖宫产健康产妇近胎盘端脐带20-30cm，置于无菌预冷的PBS中保存。脐带经过严格的病原体检测确认安全后使用。 2.超净工作台中，将脐带取出放入玻璃培养皿中，剥离脐动脉和脐静脉，将剥离血管的脐带组织放于DMEM/F12培养基中剪成2mm3左右的组织块。3.常规脐带组织消化使用的酶为胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合液，如果想将组织完全消化往往需要比较长的时间，影响原代细胞状态。而如果消化时间较短，不能将组织完全消化，则会影响分离效率。并且这种消化方式对组织块的粉碎或者剪碎的要求比较高， 大块未剪碎的组织常常不能完全消化。同时，使用胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合液消化的组织多成粘稠状，需要大量的缓冲液稀释，多次冲洗才能获取相应的细胞，更加大了 MSC 细胞获取的难度。因此，我们配置了一种专门用于脐带组织消化的酶CDH消化酶，该酶在较短的时间内可以充分的将脐带组织消化，对组织块粉碎的要求较低，且消化液不粘稠，更容易冲洗离心获取MSC细胞。4.常规脐带组织消化后，会通过100目筛网过滤，获取单细胞悬液，然后接种于细胞培养瓶贴壁，这种方法MSC获取较快，但获取的MSC细胞一般较少，且由于中间处理过程太多，细胞状态受到影响。也有文献报道通过组织块贴壁的方法获取MSC，但这种方法对组织块处理要求过高，大部分组织块不能贴紧细胞瓶壁，且一般需要3周才能获取MSC细胞。 通过我们的观察发现，组织通过消化酶消化后，MSC细胞一般成团或者粘附在未完全消化组织上，将消化液通过100目筛网过滤后大部分消化出来的MSC细胞因成团不能通过筛网， 影响获取效率。对此我们发明了如下的方法CDH消化酶消化后的组织液无需通过筛网，大部分单个细胞或者MSC细胞团均可贴壁，即使有未消化完全的小块组织，在通过CDH消化酶后，也变得极易贴紧细胞瓶壁，能快速的获取MSC细胞。该方法结合了脐带组织消化获取单细胞和组织贴壁方法的双重优点，有效提高了 MSC的得率和速度。5.具体的操作过程如下剪碎的组织与⑶H混合酶溶液按1 1的比例混合加入 50ml离心管中，置于37°C摇床中，200rpm振荡，消化池左右。消化后的组织PBS洗涤三次后，重悬于含有12%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，铺入T-25培养瓶。6.培养2天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM/ F12培养基，隔天换液。细胞长至80%丰度时(约8天)，细胞消化前三代将细胞按1 1 的比例接种于新的T-25培养瓶中。以后细胞消化均按1 3传代。第8天即可获得第一代MSC，约2 X IO6个细胞，并可流式检测MSC相应表型。
图1、脐带来源的MSC细胞形态(A)采用本方法获取的MSC培养3天后的细胞形态，组织块处生发出的贴壁细胞，呈发散型梭状。也有部分单个贴壁细胞并开始分裂增值。 (B)采用传统消化处理方式培养3天后只有少数细胞贴壁，部分样本无法获取细胞。(C)采用本方法获取的第一代MSC培养8天后的形态，细胞丰度达到80%，成为形态相对均一的梭型成纤维样细胞，漩涡状生长。(D)采用传统消化处理方式培养8天后少数细胞开始增值， 但并不能达到80%的细胞丰度达到(E，F)用本方法获取的MSC与采用传统消化处理方式培养的第15代MSC形态未发生改变。图2、获取的MSC细胞流式快速表型检测将在T-25塑料培养瓶中培养的第三代 MSC细胞消化获得单细胞悬液，采用单克隆荧光抗体分别标记上机检测，用CellQuest软件进行数据分析MSC细胞的判定标准为阳性表型⑶105、⑶73、⑶90、⑶44、⑶四、HLA-ABC阳性率不低于 95% Jj^§CD34、CD14、CDllb、CD19、HLA-DR、CD31 阳性率不高于 2%。图3、将贴壁细胞用细胞消化液(0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)消化成单细胞悬液， 按1 X IO4细胞/孔接种在M孔板内，每隔M小时消化3个孔，收集细胞，并用0. 4%的胎盼兰计数活细胞，绘制生长曲线。第三代细胞增值较快，在对数生长期，细胞倍增时间均约为36小时。细胞每传一代，细胞数约增长2倍。与相关文献和专利的报道基本一致。第8 天获得第一代MSC，约2 X IO6个细胞，预计每只20cm脐带一个月后可获得7 X IOiciMSC细胞产量。
具体实施例方式本发明的目的是利用细胞培养技术和合理的组织处理技术提高获得脐带MSC得率和速度，并快速鉴定的方法。发明人公布了一种优化的脐带组织消化酶配方和消化细胞贴壁方式，以及快速MSC鉴定方法。下面就具体实施例来说明本发明的具体运用。实例1脐带MSC细胞快速获取1.剪取剖宫产产妇手术中近胎盘端脐带20-30cm，置于无菌预冷的PBS中保存。2.脐带经过严格的病原体检测(梅毒螺旋体、艾滋病病毒(HIV)、巨细胞病毒 (CMV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、梅毒、支原体等微生物病原体检测)，确认安全后使用。同时排除早产、胎膜早破、绒毛羊膜炎、系统性红斑狼疮、肾炎、糖尿病等因素的脐带样本，确保获取的MSC正常。3.超净工作台中，将脐带取出放入玻璃培养皿中，剪成约5cm长的小段，用PBS洗净。将脐带血完全洗净后，剥离脐动脉和脐静脉，并将剥离血管的脐带组织放于DMEM/F12 培养基中用手术剪刀剪成2mm3左右的组织块。4.配置CDH消化酶(II型胶原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明质酸酶IOU/ ml)，37度溶解于DMEM/F12培养基，过滤0. 22 μ m的滤器除菌备用。消化酶最好现配现用， 在4度保存时间勿超过1周。5.剪碎的组织与⑶H混合酶溶液按1 1的体积比例混合与50ml离心管中，置于37°C摇床中，200rpm振荡，消化池左右(待组织块基本消化即可，少数较小的组织块的残留并不影响MSC获取效率)。6.将消化后的组织液4°C，300g离心5min，弃上清，弃上清，将沉淀用PBS重悬于 50ml新鲜培养基中，4°C，300g离心5min，弃清，PBS洗两次，注意不要将细胞和组织沉淀弃去。最后一遍离心后，弃上清，将沉淀重悬于含有12%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，铺入 T-25培养瓶。铺入细胞培养瓶培养瓶前不能用100目筛网过滤，过滤会影响MSC细胞的获得效率。(约5cm的脐带消化所得的沉淀铺于1个T-25培养瓶中)7.培养2天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM/ F12培养基，隔天换液。MSC细胞会在沿着贴壁的组织块或者贴壁的细胞长出。细胞长至 80%丰度时(约8天)，细胞消化液(0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)，前三代将细胞按1 1的比例接种于新的T-25培养瓶中，以保证生长速率。以后细胞消化均按1 3传代。8.每只20cm脐带，第8天获得第一代MSC，约2X IO6个细胞，一个月后可获得 7 X IOiciMSC细胞产量。实例2脐带MSC细胞快速鉴定细胞形态学观察通过本方法获得的原代细胞和组织块多在2天内贴壁，培养4-6 天即可观察到从组织块处生发出的贴壁细胞，呈发散型梭状。同时也可观察到部分单个贴壁细胞开始分裂增值。通过1次传代(8天)后，细胞增值较快，成为形态相对均一的梭型成纤维样细胞，漩涡状生长。连续传代15次细胞形态未发生明显变化。按照文献和其他专利的报道，获取第一代MSC细胞需要2周，并且成功率不高。本方法获得的细胞数和获取时间以及成功率均明显优于按照其他文献和专利。流式检测分离、扩增的MSCs如何进行鉴定，是目前的争议问题。MSCs能表达多种表面抗原但不特异，但通过检查多个表面标记可以区分MSC和其他细胞，相关文献也有报道。同时流式细胞术检测是一种快速精确的检测手段，可以很有效快速的确定获取细胞的表型。避免了传统的通过检测MSC细胞分化能力鉴定耗时过长的缺点。将在T-25塑料培养瓶中培养的第三代MSC细胞用细胞消化液消化获得单细胞悬液，并细胞计数。将MSC细胞重悬至1 X 107细胞数/毫升，单细胞悬液分装入流式管中，每管100 μ 1。在每个流式管中加入相应标记的流式荧光抗体，混勻。4度避光孵育30分钟。 每个流式管加入500 μ 1 PBS洗去未标记上的抗体，40C，300g离心lOmin，弃上清，弃上清， 重复三次。随后将细胞沉淀重悬与100 μ 1 PBS中。流式细胞仪检测相应表型，并通过相应软件分析。MSC细胞的判定标准为阳性表型⑶105、⑶73、⑶90、⑶44、⑶四、HLA-ABC阳性率不低于 95% Jj^§CD34、CD14、CDllb、CD19、HLA-DR、CD31 阳性率不高于 2%实例3脐带MSC细胞得率及细胞生长曲线的测定。将获得的MSC细胞在第一代第八天用细胞消化液(0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)消化后，用0.4%的胎盼兰计数活细胞，统计第一代细胞得率。将第三代细胞用细胞消化液 (0. 25 %胰酶+0. 02 % EDTA)消化后，按1 X 104细胞/孔接种在24孔板内，每隔24小时消化 3个孔，收集细胞，并用0.4%的胎盼兰计数活细胞，绘制生长曲线。前三代细胞生长较慢， 因此需要以1 1的比例接种传代，第4代开始细胞增值较快，在对数生长期，细胞倍增时间均约为36小时。细胞每传一代，细胞数约增长2倍。与相关文献和专利的报道基本一致。 第8天获得第一代MSC，约2 X 106个细胞，预计每只20cm脐带一个月后可获得7 X 1010MSC 细胞产量。
权利要求
1.一种专门用于脐带组织消化的酶CDH消化酶，该酶在较短的时间内可以充分的将脐带组织消化，对组织块粉碎的要求较低，且消化液不粘稠，更容易冲洗离心获取MSC细胞。这种消化液的特征是含有II型胶原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明质酸酶IOU/ ml，37度溶解于DMEM/F12培养基，过滤0. 22 μ m的滤器除菌备用。消化酶最好现配现用，在 4度保存时间勿超过1周。
2.一种快速有效获得脐带造血干细胞的方法，其特征为运用要求书1所述的专用脐带组织消化酶配方，采取脐带组织共培的方式，快速有效利用新生胎儿的脐带为资源获取脐带MSC以及快速MSC鉴定的方法。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，公开了一种快速有效获得脐带间充质干细胞(MSC)方法。特征是通过一种优化脐带组织消化酶配方和消化细胞贴壁的方式，快速有效利用新生胎儿的脐带为资源获取脐带MSC以及快速MSC鉴定的方法。本方法在现有的脐带间充质干细胞的基础上改进而成，在获得MSC的时间上缩短为原来的一半、得率提高了一倍，且不影响MSC的各种表面特征和功能。为脐带MSC的科研和临床运用提供一种科学的快速有效的获取方法。
文档编号C12N9/48GK102191229SQ20101012523
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者侯亚义, 刘柳, 李鹏飞, 王亚平, 赵叶琳, 赵晓寅 申请人:侯亚义