专利名称：一种全人源抗cd20单克隆抗体、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术：
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin'S lymphoma,NHL)是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤， 其中B细胞来源的约占85 %，好发于青壮年，发病率和病死率呈逐年上升趋势。根据病情特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。 它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得了重大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。⑶20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95 %以上的B细胞性淋巴瘤中表达，且表面密度很高，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。更为重要的是，CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱落，故成为治疗 B 细胞淋巴瘤的理想靴点[Sacchi S, Federico M, Dastoli G, Fiorani C, Vinci G, Clo V, Casolari B. Treatment of B-celInon-Hodgkin' s lymphoma with anti CD 20monoclonal antibody Rituximab. CritRev Oncol Hematol,2001,37(1) :13-25]。目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。 Rituxan (Rituximab, C2B8)为美国基因科技公司研制的以⑶20为靶点的单克隆抗体， 它是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和人抗体的恒定区基因[Reff ME, Carner K, Chambers KS, Chinn PC, LeonardJE, Raab R, Newman RA, Hanna N, Anderson DR. Depletion of B cells in vivo bya chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 1994,83(2) :435_45]。 Rituxan B 于 1997 $ n 月获FDA的批准上市，用于复发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗 [Leget GA, CzuczmanMS. Use of rituximab,the new FDA-approved antibody. Curr Opin Oncol. 1998 ；10 :548-551]。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52% 的病人对C2B8治疗不产生反应。因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20抗体药物显得尤为迫切。最新的实验数据表明，对Rituximab耐受的细胞通常变现为⑶20表达减低； Bcl-2 ^ ii fi 1 ^ [Title !Development of Rituximab-ResistantLymphoma
Clones with Altered Cell Signaling and Cross-Resistance toChemotherapy. Author :Jazirehi，A. R. ；Vega, Μ. I. ；Bonavida，B. Source :CancerResearch，2007，67(3) 1270-1281；Title -Acquirement of Rituximab Resistance inLymphoma Cell Lines Is Associated with Both Global CD20Gene and ProteinDown-Regulation Regulated at the Pretranscriptional and PosttranscriptionalLeveIs. Author :Czuczman，M. S.；Olejniczak, S. ；Gowda, A. Source :ClinicalCancer Research,2008,14(5) :1561_1570]o 而抗体亲和力的提高能够增强抗体的特异性，提高检测灵敏度，增强抗体的功能同时降低抗体的用量。因此，在临床上广泛使用具有较好治疗效果的Rituximab的基础上，构建人源化程度更高的人源化或全人源抗CD20单抗，进一步提高Rituximab的亲和力，改善临床治疗的安全性和有效性具有极其重要的意义。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗 CD20 抗体 3C5。更具体地，本发明公开的全人源抗⑶20抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 8所示；本发明公开的上述全人源抗⑶20抗体，重链氨基酸序列为SEQ ID N0:10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 12所示；本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗⑶20抗体；本发明公开的上述核苷酸序列，其中编码全人源抗⑶20抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO 5所示，编码全人源抗⑶20抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :7所示；本发明公开的上述核苷酸序列，其中编码全人源抗⑶20抗体重链的核苷酸序列为SEQ ID NO 9所示，编码全人源抗⑶20抗体轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO 11所示；本发明还公开了一种表达载体，含有上述的核苷酸序列，为pcDNA3. 1/ZE0(+)或 pcDNA3. 1 (+)；本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为CHO-Kl细胞；本发明进一步公开了上述全人源抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗⑶20单链抗体；全人源抗⑶20完整抗体分子真核表达载体的构建； 全人源抗CD20完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源抗CD20完整抗体分子的纯化。本发明最后公开了上述全人源抗体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途，这些肿瘤为高表达⑶20的淋巴瘤，优选为非霍奇金氏淋巴瘤。本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明与嵌合抗体 rituximab和中国专利申请号为01132226. 8发明名称为《抗⑶20人源化单克隆抗体》中公开的的抗CD20嵌合抗体C4E5及人源化抗CD20抗体H9D3比较起来，本发明得到的抗体具有更高的抗体亲和力和更强的ADCC和CDC活性。
图1.抗 CD20 抗体 3C5 诱导 CD20 阳性细胞 Raji (图 1-1)、Namalwa(图 1-2)及 Daudi (图1-3)的⑶C效应实验结果；图2.抗 CD20 抗体 3C5 诱导 CD20 阳性细胞 Raji (图 2-1)、Namalwa(图 2-2)及 Daudi (图2-3)的ADCC效应实验结果。
具体实施例方式以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例抗体的制备(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂anvitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22 :197-207)和文献(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)报道的序列分别设计引物采用 RT-PCR 反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/CH 和 pGEM-T/CL。(2) eDNA 的制备收集50名健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用iTrizol试剂anvitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出 cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。(3)引物设计参考文献(Immunotechnology，1998，3 :271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的 VHBack，VHFor,VLBack 和 VUor 引物。VHBack，VHFor， VLBack 和 VLFor 的序列见 Immunotechnology，1998,3 :271_278。其中在 VHBack 引物的 5， 端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5，端加上序列 gcc agaacc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc,在 VLBack 弓|物的 5，端力口上序列 tcc ggc ggcggt ggt tct ggc gga ggc gga tct,在 VLFor 弓|物的 5，端力口上含有 Not I 位点的序列 atg egg ccg C。(4)噬菌体抗体库的构建及筛选采用(2) 4^々cDNAfP (3)中的弓|物，利用 recombinant Phage antibodysystem 试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phageantibody system试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“CD20抗原肽-KLH”为人CD20分子膜外区的部分片段，即 NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ共25个氨基酸的肽段与KLH相连，其中肽段第五位的C和第二十一位的C形成链内二硫键，⑶20抗原肽-KLH为上海科肽生物科技有限公司合成制备。 经多次淘选抗体库后获得了一株抗人CD20单链抗体3C5ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6分别显示了 3C5kFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。 SEQID NO :7和SEQ ID NO :8分别显示了 3C5ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。(5)全人源抗体在真核细胞中的表达以3C5kFv基因和pGEM-T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG CTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物， 回收目的条带并克隆到PGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段 3C5VHCH,与用 HindIII 和 EcoR I 酶切的质粒 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen 公司)进行连接， 构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (3C5VHCH)。以3C5kFv基因和pGEM-T/CL载体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟，得到PCR产物，其5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用 HindIII 和 EcoR I 酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段3C5VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1/ZE0(+) Gnvitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体 pcDNA3. 1/ZEO (+) (3C5VLCL)。于3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90% -95%融合时进行转染取质粒1(^8(质粒？00嫩3.1(+) (3C5VHCH)4y g，质粒 pcDNA3. 1/ZEO (+) (3C5VLCL) 6 μ g)禾口 20 μ 1 Lipofectamine2000Reagent (Invitrogen 公司产品)按LipofectamindOOOReagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含 600 μ g/ml G418 (Invitrogen 公司产品)禾口 250 μ g/ml Zeocin (Invitrogen 公司产品)的 DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fe) (KPL公司)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭浊，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Humanmyeloma IgGl, κ (Sigma)，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ) ((SouthernBiotechnology Associates 公司)进行结合反应，37°C温育 lh，加入 TMB 显色液于37°C作用5min，最后用H2S04终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用I^roteinA亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体3C5。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10分别显示了全人源抗体3C5的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12分别显示了全人源抗体3C5的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。实验例嵌合抗体C4E5、人源化抗体H9D3参照中国专利申请号01132226. 8中公开的方法制备。实验例1.⑶20抗体亲和力检测CD20抗体的亲和力通过放射性免疫法进行测定Cragg MS, Morgan SM, Chan HT, Morgan BP,Filatov AV,Johnson PW,French RR,Glennie MJ(2003)Complement-mediated lysis by anti_CD20mAb correlates with segregation intolipid rafts.Blood 101 (3) : 1045-1052。各CD20抗体(全人源抗体3C5 ；嵌合抗体C4E5 ；人源化抗体H9D3 ； rituximab (C2B8, Roche)；阴性对照抗体 Trastuzumab Genentech)通过碘珠法(iodobead method)进行标记。将标记好125碘的抗体与Daudi (ATCC CCL-213)细胞孵育2小时，37°C。
6与细胞结合的和游离的碘标记的抗体通过离心分离，检测结合在细胞上的125碘标记的抗体的放射活性。各CD20抗体亲和力常数通过Hill方程曲线拟合滴定结合曲线求得，(见表1)。全人源抗体3C5的KD值为1. 96士0. 15，小于C4E5，H9D3和Rituximab的KD值(P < 0. 01)，说明全人源抗体3C5与CD20的亲和力比C4E5, H9D3和Rituximab高。
表1.抗CD20抗体的亲和力竞争结合实验结果
权利要求
1.一种全人源抗⑶20抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
2.权利要求1所述的全人源抗⑶20抗体，其重链氨基酸序列如SEQIDN0:10所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示。
3.一种核苷酸序列，编码权利要求1 2任一所述的全人源抗CD20抗体。
4.权利要求3所述的核苷酸序列，其中编码全人源抗CD20抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，编码全人源抗⑶20抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO 7 所示。
5.权利要求4所述的核苷酸序列，其中编码全人源抗CD20抗体重链的核苷酸序列如 SEQ ID NO 9所示，编码全人源抗⑶20抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO 11所示。
6.一种表达载体，含有权利要求3 5任一所述的核苷酸序列，为pcDNA3. 1/ZE0(+)或 pcDNA3. 1 (+)。
7.一种宿主细胞，转化权利要求6所述的表达载体，为CHO-Kl细胞。
8.权利要求2 3任一所述的全人源抗CD20抗体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中肿瘤为高表达CD20的淋巴瘤。
10.权利要求9所述的用途，其中高表达⑶20的淋巴瘤为非霍奇金氏淋巴瘤。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗CD20单克隆抗体、其制备方法及用途。本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗CD20抗体3C5，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO8所示。另外，本发明还公开了3C5抗体的制备方法以及编码3C5抗体的核苷酸序列、含有该核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的全人源单克隆抗体3C5与其它抗CD20抗体相比，具有更高的抗体亲和力和更强的ADCC和CDC活性，可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号C12N15/85GK102167744SQ20101012526
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月25日 优先权日2010年2月25日
发明者李川, 王淑蕙, 聂丽 申请人:百迈博药业有限公司