专利名称：一种用地衣芽孢杆菌提取的活性成分及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用地衣芽孢杆菌提取的活性成分及其应用，属于生物农药技术领域。
背景技术：
随着越来越多的有毒化学农药逐渐被限制使用，生物农药由于具有生产原料来源 广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、及对环境兼容性好的特点，已成为全球农药产业发 展的新趋势。很多真菌的属或菌种被用于来防治病虫害如Trichoderma属，尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum), Pythium oligandrum, Verticillium chlamydosporium 等。在利 用真菌开发生物农药中，产生厚垣孢子是非常重要的，因为其含有丰富的内源营养，抗逆性 大大高于分生孢子和菌丝体，可以克服分生孢子制剂存活期短，商品货架期短，而且可在土 壤中定殖而不需要添加外源营养，从而提高防效。真菌的不同种，其形成厚垣孢子的环境条件通常是有差异的，很多因素如营养、渗 透压、光、PH值、温度、空气、细菌、药物处理和植物的刺激均都能诱导真菌形成厚垣孢子。 Venkat Ram首先证明了从土壤中分离的细菌能诱导F. solani形成厚垣孢子，并认为是细 菌产生的代谢物诱导的。但到目前为止，文献检索未见地衣芽孢杆菌中的代谢产物能诱导 真菌形成厚垣孢子的公开报道。参考文献[l]Venkat Ram, C. S. ,1952. Soil bacteria and chlamydospore formation in Fusariumsolani. Nature 22 :433
发明内容
本发明的目的在于提供一种能诱导真菌形成厚垣孢子的用地衣芽孢杆菌代谢物 提取的活性成分，为开发生物农药制剂奠定基础。本发明的地衣芽孢杆菌代谢物中提取的活性成分，经如下步骤得到a.生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis N27)，该菌株已于2010 年1月20日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址中国.北京.中关 村；保藏号CGMCC No 3585 ；b.将B. licheniformis N27的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培 养4天，获得试管种，固体培养基的配方蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水 IOOOmUpH 7. 2 ；c.将试管种接种到每瓶装100-350ml液体培养基的三角瓶中，在温度25_32°C、 转速为150-250rpm下摇床培养2-5天；液体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、水 1000ml ；d.将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃取3 次，正丁醇萃取部分在45°C下减压浓缩至干，得粗浸膏；
e.将粗浸膏在硅胶H柱上，先用体积比为1-4 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂 洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分在45°C下减压浓缩得X馏分； f.将X馏分用C18填料分离，依次用50-80%、100%的甲醇水洗脱，将100%甲 醇洗脱部分合并，在45 °C下减压浓缩得Y馏分；g.将Y馏分用S印hadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml， 将6-10瓶合并，得到地衣芽孢杆菌的活性成分Z。制备试验用的哈茨木霉(T. harzianum)，尖孢镰刀菌(F. oxysporum)，少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora) M^lk^fU (T. har zianum), ^klMM JlM (F. oxysporum) _ 禾中 于PDA(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂18克，自来水1000ml，pH自然)上，将少孢节 丛孢(Arthrobotrys oliospora)接种于CMA培养基(玉米粉20克，琼脂18克，水1000 毫升)上，将这三株菌于28°C下培养10天。用无菌蒸馏水将孢子洗下后，调整孢子浓度为 104，冻于4°C冰箱中备用。将活性成分Z用DMSO (二甲基亚砜)配成IOyg/μ 1，在每个9cm平板中放入活 性成分c(8 μ 1)，以不添加活性成分的作为对照，然后倒入20mlPDA或CMA于平板内，使培 养基中活性成分C的浓度为4μ g/ml，待培养基凝固后，在以PDA为培养基的表面分别涂上 300 μ 1哈茨木霉(T. har zianum)，尖孢镰刀菌(F. oxysporum)，在含有CMA培养基的表面涂 上300 μ 1少孢节丛孢(A. oliospora)的孢子。培养18个小时后，在含有活性化合物Z的 平板内，这三株真菌都形成大量的厚垣孢子，而空白对照则需培养20天以后才开始产厚垣 孢子，且数量没有含有活性化合物的平板内的多。地衣芽孢杆菌提取的活性成分经试验表明能诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖 孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢(Arthrobotrys oliospora)形成厚垣孢子，能应用 于生物农药制备中。本发明的用地衣芽孢杆菌发酵液提取的活性成分能诱导真菌形成厚垣孢子的代 谢物，为开发生物农药制剂奠定基础。
具体实施例方式下述实施例所用的固体培养和液体培养基的配方同发明内容部分所述。实施例一将B. Iicheniformis N27的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养4 天，获得试管种。将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装液体培养基100ml)，25°C下摇 床培养(转速为150rpm)5天。将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分 之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45°C下减压浓缩至干，得粗浸膏。将粗浸膏 在硅胶H填料上，先用体积比为1 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全 部冲下，将甲醇冲下部分在45°C下减压浓缩得X馏分。将X馏分用C18填料分离，依次用 50 %、100 %的甲醇水洗脱，将甲醇洗脱部分合并，在45 V下减压浓缩得Y馏分；将Y馏 分用S印hadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml，将6_10瓶合并，得 到地衣芽孢杆菌的活性成分Z。将培养基中活性成分Z的浓度配成4 μ g/ml，把真菌孢子 涂布于培养基表面，结果表明活性成分Z是能诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢镰刀菌 (F. oxysporum)、少孢节丛孢(Arthrobotrys oliospora)快速而高效的产生厚垣孢子的代谢物。
实施例二 将B. Iicheniformis N27的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养4 天，获得试管种。将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装液体培养基200ml)，28°C下摇 床培养(转速为200rpm)3天。将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分之 一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45°C下减压浓缩至干，得粗浸膏。将粗浸膏在 硅胶H柱上，先用体积比为3 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲 下，将甲醇冲下部分在45°C下减压浓缩得X馏分。将X馏分用C18填料分离，依次用70%、 100%甲醇水洗脱，将100%甲醇洗脱部分合并后在45°C下减压浓缩得Y馏分。将Y馏分 用S印hadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml，将6_10瓶合并，即为 能诱导厚垣孢子的活性成分Z。将培养基中活性成分Z的浓度配成4 μ g/ml，把真菌孢子 涂布于培养基表面，结果表明活性成分Z是能诱导哈茨木霉(T.harzianum)、尖孢镰刀菌 (F. oxysporum)、少孢节丛孢(Arthrobotrysoliospora)快速而高效的产生厚垣孢子的代 谢物。实施例三将B. Iicheniformis N27的菌种接种到试管固体培养基斜面上，28°C下培养4天， 获得试管种。将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装350ml)，32°C下摇床培养(转速为 250rpm)2天。将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃 取3次，正丁醇萃取部分在45 °C下减压浓缩至干，得粗浸膏。将粗浸膏在硅胶H柱上，先用 体积比为4 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分 在45°C下减压浓缩得X馏分。将X馏分用C18填料分离，依次用80%，100%甲醇水洗 脱，将100%甲醇部分在45°C下减压浓缩得Y馏分。将Y馏分用S印hadexLH-20在甲醇下 洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体约1ml，将6-10瓶合并，即为能诱导厚垣孢子的活性成 分Z。将培养基中活性成分Z的浓度配成4 μ g/ml，把真菌孢子涂布于培养基表面，结果表 明活性成分C是能诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora)快速而高效的产生厚垣孢子的代谢物。
权利要求
一种用地衣芽孢杆菌发酵液中提取的活性成分，其特征在于活性成分经如下步骤得到a.生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis N27)，该菌株已于2010年1月20日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址中国.北京.中关村；保藏号CGMCC No3585；b.地衣芽孢杆菌的液体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml；c.地衣芽孢杆菌的发酵条件为每瓶装100-350ml液体培养基，温度25-32℃、转速为150-250rpm，摇床培养2-5天；d.将含有菌体的发酵液在45℃下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45℃下减压浓缩至干，得粗浸膏；e.将粗浸膏在硅胶H柱上，用体积比为1-4∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分在45℃下减压浓缩得X馏分；f.将X馏分用C18填料分离，依次用50-80％、100％的甲醇水洗脱，将100％甲醇洗脱部分合并，在45℃下减压浓缩得Y馏分；g.将Y馏分用SephadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml，将6-10瓶合并，得到地衣芽孢杆菌的活性成分Z。
2.权利要求1所述的用地衣芽孢杆菌提取的活性成分，其特征在于该活性成分能 高效、快速地诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora)形成厚垣孢子的代谢物，能应用于生物农药制备中。
全文摘要
本发明涉及一种用地衣芽孢杆菌提取的活性成分及其应用，属于生物农药技术领域。活性成分提取步骤生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformisN27)，保藏号CGMCC No3585；将B.licheniformis N27用液体发酵，培养基为马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml；发酵条件为温度25-32℃、转速为150-250rpm，摇床培养2-5天；所得发酵液减压浓缩得粗浸膏；粗浸膏依次用硅胶H、C18、SephadexLH-20分离得到活性成分Z。本发明的活性成分是具有能使在常规培养基下培养的真菌高效、快速形成厚垣孢子的代谢物，且用量少，应用于生物农药制备中。
文档编号C12N1/20GK101805715SQ20101013391
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者周敬伟, 张克勤, 李蕾 申请人:云南大学