专利名称：精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗，特别涉及精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫 苗，还涉及该疫苗的制备方法。
背景技术：
以精子抗原为基础的疫苗开发代表了一种大有希望的避孕途径。精子抗原在避孕 疫苗开发上的应用在于其精子特异性，参与人类生育，并可在生殖道局部产生足以能够终 止受精的免疫应答。CatSperl是精子特有的一种阳离子通道蛋白，特异性地表达于睾丸和附睾组织 上，主要定位于精子尾部的主段，对于精子超活化有重要的调节作用。基因敲除试验表明， CatSperl基因缺失小鼠的精子运动力大大降低，不能穿过透明带完好的卵，而且丧失受精 能力。B细胞激活因子(BAFF)是B细胞存活与成熟的必需因子，为肿瘤坏死因子(TNF) 家族成员。其能够增强B细胞、CD4T细胞、NK细胞的活性，使机体的免疫应答增强；还可作 为T细胞激活的共刺激因子，刺激T细胞分泌干扰素-y (IFN-Y)和白介素_2(IL-2)，上调 ⑶25(IL_2受体a链)表达，并以IL-2依赖方式促进T细胞增生。免疫刺激复合物(ISC0M)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成 的一种直径为30 40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文献报道，以ISC0M为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫 保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISC0M包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而 保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISC0M的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从 而有利于抗原递呈细胞的吞噬。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl 的基因疫苗；目的之二在于提供所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗的 制备方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案1、精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗，该疫苗是由CatSperl和 BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的ISC0M型疫苗。进一步，所述CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体 进入位点IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入CatSperl全长cDNA 和BAFF全长cDNA ；进一步，所述CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇 及卵磷脂的质量比为5 10 1 1。
2、所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗的制备方法，包括以下 步骤a、CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建将CatSperl全长cDNA 插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将B细胞激活因子全长cDNA插入 该真核载体的IRES下游，即得CatSperl和B细胞激活因子双基因共表达重组真核载体；b、ISC0M的制备将CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲 液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有CatSperl 和BAFF双基因共表达重组真核载体0. 5mg、皂苷Quil Almg、胆固醇0. lmg和卵磷脂0. lmg， 冰浴超声处理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISC0M，也 即CatSperl的基因疫苗。进一步，所述步骤a的具体方法为aUCatSperl全长cDNA的克隆提取人成熟精子细胞总RNA，逆转录得到总cDNA， 再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列为上下游引物，PCR扩增 两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的CatSperl全长cDNA，PCR条件为94°C预变性3 分钟，然后94°C变性1分钟、58 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延 伸7分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-CatSperl ；a2、BAFF全长cDNA的克隆提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总 cDNA为模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带 有BamH I和Sal I酶切位点的B细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为94°C预变性5分钟； 然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分 钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT_BAFF ；a3、重组真核载体的构建自步骤al所得重组载体pT-CatSperl中用Pst I和 EcoR I双酶切出CatSperl全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真 核载体pStar连接，得重组载体pStar-CatSperl ；再自步骤b所得重组载体pT_BAFF中 用BamH I和Sal I双酶切出BAFF全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶 切的重组载体pStar-CatSperl连接，即得CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体 pStar-CatSperl-IRES-BAFF。本发明的有益效果在于本发明的精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因 疫苗能够抑制精子的运动，特异性降低BALB/c小鼠的平均产仔率和产仔数，且制备方法简 单、成本低廉，在免疫避孕领域具有良好的应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为PCR扩增CatSperl全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为PCR扩增BAFF全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；图3为免疫组织化学检测CatSperl ；图4为免疫荧光检测CatSperl ；图5为运动精子的百分率检测；
4
图6为繁殖配对实验中雌性BALB/c小鼠的平均产仔数；图7为繁殖配对实验中雌性BALB/c小鼠的平均产仔率。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、CatSperl基因疫苗的制备1、CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建(1) CatSperl 全长 cDNA 的克隆根据GenBank登录号为NM_053054的CatSperl基因序列，设计并合成如下引物以 PCR扩增两端带有酶切位点的CatSperl全长cDNA 上游引物F1 5‘-aatctgcagatggatcaaa actcagtgcct-3’ (SEQ ID No. 3)，下划线部分为 Pst I 酶切位点；下游引物 R1 :5，tacgaatt ctcaattcctgaagtcctcttctc-3' (SEQ ID No. 4)，下划线部分为 EcoR I 酶切位点；从健康男 性志愿者精液中分离出成熟精子，用RPMI 1640培养基常规培养，收集细胞，PBS洗涤3次， 用总RNA提取试剂盒提取精子细胞总RNA ；将所得精子总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA 为模板、采用上下游引物F1和R1进行PCR扩增，PCR条件为94°C预变性3分钟，然后94°C 变性1分钟、58 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟；PCR产 物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT Easy载体连接，连接产 物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒， 委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了 CaSperl全长cDNA序列(SEQ ID No. 1)的阳性克隆质粒命名为重组载体pT-CaSperl ；PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳 道为PCR产物，可见PCR产物在约2300bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。(2) BAFF 全长 cDNA 的克隆根据GenBank登录号为NM_006573的BAFF基因序列，设计并合成如下引物以PCR 扩增两端带有酶切位点的BAFF全长cDNA 上游引物F2 ^'-gatcaggatccatggatgactccaca gaaagg-3，(SEQ ID No. 5)，下划线部分为 BamH I 酶切位点；下游引物 R2 :5’ acgcgtcgactc acagcagtttcaatgcac-3，(SEQ ID No. 6)，下划线部分为 Sal I 酶切位点；按 Trizol 试剂盒 说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，采用上下游引物 F2和R2进行PCR扩增，PCR条件为94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C退火50 秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴 定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a 感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工 程技术服务有限公司测序验证，将插入了 BAFF全长cDNA序列(SEQ ID No. 2)的阳性克隆 质粒命名为重组载体pT-BAFF。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳 道为PCR产物，可见PCR产物在约800bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。(3) CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建
根据CatSperl和BAFF全长cDNA两端所设计的酶切位点，先将CaSperl全长cDNA 插入含有内部核糖体进入位点IRES的双基因共表达真核载体pStar的IRES上游，再将 BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为先将重组载体pT_CaSperl用 Pst I和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I 和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用含 有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克 隆质粒命名为重组载体pStar-CatSperl ；再将重组载体pT_BAFF用BamH I和Sal I双酶 切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的重 组载体pStar-CatSperl连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用含有氨苄青霉 素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名 为CaSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体pStar-CatSperl-IRES-BAFF。2、ISC0M 的制备将CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体pStar-CatSperl-IRES-BAFF用 磷酸盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含 有CaSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体0. 5mg、皂苷Quil A lmg、胆固醇0. lmg和 卵磷脂0. lmg,冰浴超声处理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形 成的ISC0M，也即CatSperl基因疫苗。二、CaSperl基因疫苗的体内免疫及检测将雄性BALB/c小鼠随机分为实验组和空白对照组，每组5只；实验组以本发明的 CaSperl基因疫苗为免疫原，空白对照组以PBS为免疫原；两组小鼠按100 y L的剂量行腹 腔免疫，每隔2周免疫1次，连续免疫3次；末次免疫后第14天尾静脉采血，分离血清，用间 接ELISA法测定血清抗体效价。(1)免疫组织化学检测CaSperl取小鼠睾丸组织(0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm)置中性福尔马林溶液中，4°C固定12小 时，脱水后石蜡包埋、切片(5mm)，行免疫组织化学检测将蜡切片脱蜡至水，用体积分数为 3%的过氧化氢溶液室温孵育5 10分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再用体积分数为 5 10%的正常山羊血清的PBS稀释液封闭，室温孵育10分钟，倾去封闭液，再滴加前述获 得的免疫小鼠血清，37°C孵育1 2小时，PBS冲洗，再滴加稀释的生物素标记二抗(用含 有体积分数为的牛血清白蛋白的PBS稀释)，37°C孵育10 30分钟，PBS冲洗，再滴加 稀释的辣根过氧化氢酶标记链霉卵白素(用PBS稀释)，37°C孵育10 30分钟，PBS冲洗， DAB显色，自来水充分冲洗，复染，封片，置显微镜下观察，拍片。结果如图3所示，其中A为空白对照组，B为实验组，可见CatSperl在睾丸组织 中有表达，其主要表达在睾丸组织的圆形精子细胞阶段，采用本发明疫苗免疫获得的抗 CatSperl抗体能够有效结合精子细胞。(2)免疫荧光检测CatSperl将纯化精子均勻涂在载玻片上，丙酮固定15分钟，用含有体积分数为0. 的 Triton-100的PBS(即PBST)洗涤后，再加入过氧化物酶抑制剂灭活内源性过氧化物酶， PBS洗涤后，置非免疫动物血清湿盒内封闭10分钟，再加入前述获得的血清(稀释度为 1 300，以体积分数为的胎牛血清稀释)，4°C孵育过夜，PBS洗涤后，再加入异硫氰酸荧光素标记二抗，室温下孵育40分钟，PBS洗涤后，用体积分数为90%的甘油封片，置荧光显微镜下观察，拍片。结果如图4所示，其中A为空白对照组，B为实验组，可见采用本发明疫苗免疫获 得的抗CatSperl抗体结合在精子鞭毛的主段和末段上。(3)抗体结合试验将纯化精子转移到Biggers-Whitten-Whittingham(Bffff)培养液中，使其分布均 勻，密度约为1X106个/mL，加入采用本发明疫苗免疫获得的抗CatSperl抗体并使抗体终 浓度分别为g/mL和10 y g/mL，每一抗体浓度设立3个复孔，同时设空白对照组(不加入 抗CatSperl抗体)，37°C孵育，分别在孵育1、2、4小时后用计算机辅助精子分析系统计算运 动精子数量，每个孔随机检测3个视野，实验重复6次，将数据进行统计分析。结果如图5所示，采用本发明疫苗免疫获得的抗CatSperl抗体孵育精子1、2、4小 时后，运动精子数均较空白对照组明显减少并且成剂量依赖性，表明采用本发明疫苗免疫 获得的抗CatSperl抗体可以抑制精子的运动。三、繁殖配对试验将雄性BALB/c小鼠随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组，每组10只；实验 组以本发明的CatSperl基因疫苗为免疫原，阴性对照组以无关对照OVA基因疫苗(以OVA 全长cDNA代替CatSperl全长cDNA按照本发明基因疫苗的制备方法制得)为免疫原，空白 对照组以PBS为免疫原；各组小鼠按100 u L的剂量行腹腔免疫，每隔1周免疫1次，连续免 疫3次，末次免疫1周后，将雌、雄BALB/c小鼠按每笼2 1的雌雄比例合笼交配，2周后将 雌、雄BALB/c小鼠分开单独饲养，观察雌鼠产仔率和产仔数。结果如图6和图7所示，实验组的雌性BALB/c小鼠的平均产仔率为23%，平均产 仔数为3.6只；阴性对照组的雌性BALB/c小鼠的平均产仔率为91%，平均产仔数为7.3只； 空白对照组的雌性BALB/c小鼠的平均产仔率为93%，平均产仔数为6. 9只，表明本发明的 CatSperl基因疫苗能够特异性降低BALB/c小鼠的平均产仔率和产仔数。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗，其特征在于该疫苗是由CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物型疫苗。
2.根据权利要求1所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗，其特征在 于所述CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点IRES 的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入CatSperl全长cDNA和BAFF全长 cDNA。
3.根据权利要求1所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗，其特征在 于所述CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质 量比为5 10 1 1。
4.权利要求1所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗的制备方法，其特 征在于包括以下步骤a、CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建将CatSperl全长cDNA插入 含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入该真核载体的 IRES下游，即得CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体；b、免疫刺激复合物的制备将CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体用磷酸 盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有 CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体0. 5mg、皂苷Quil A lmg、胆固醇0. Img和卵 磷脂0. lmg，冰浴超声处理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成 的免疫刺激复合物，也即CatSperl的基因疫苗。
5.根据权利要求4所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSperl的基因疫苗的制备方法， 其特征在于所述步骤a的具体方法为aUCatSperl全长cDNA的克隆提取人成熟精子细胞总RNA，逆转录得到总cDNA，再以 该总cDNA为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分 别带有Pst I和EcoR I酶切位点的CatSperl全长cDNA, PCR条件为94°C预变性3分钟， 然后94°C变性1分钟、58°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分 钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-CatSperl ；a2、BAFF全长cDNA的克隆提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA 为模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有 BamH I和Sal I酶切位点的B细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为94°C预变性5分钟；然 后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟； PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT_BAFF ；a3、重组真核载体的构建自步骤al所得重组载体pT-CatSperl中用Pst I和 EcoR I双酶切出CatSperl全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真 核载体PStar连接，得重组载体pStar-CatSperl ；再自步骤b所得重组载体pT_BAFF中 用BamH I和Sal I双酶切出BAFF全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和SalI双酶切 的重组载体PStar-CatSperl连接，即得CatSperl和BAFF双基因共表达重组真核载体 pStar-CatSperl-IRES-BAFF。
全文摘要
本发明涉及一种疫苗，特别涉及精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗，该疫苗是由CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物型疫苗，其能够抑制精子的运动，特异性降低BALB/c小鼠的平均产仔率和产仔数，在免疫避孕领域具有良好的应用前景；本发明还涉及该疫苗的制备方法，操作简便，成本低。
文档编号C12N15/85GK101816799SQ20101014396
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学