乙型肝炎病毒前c/c区变异及其用途的制作方法

专利名称：乙型肝炎病毒前c/c区变异及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及乙型肝炎病毒前C/C区变异。基于这些变异情况，本发明提供了可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒。
背景技术：
原发性肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，已占居民肿瘤死亡的第二位。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致我国肝癌发生的首要原因。我国约有HBV表面抗原(HBsAg) 携带者1. 2亿，他们中相当部分的慢性肝炎患者，经10 20年的发展会进入肝硬化状态， 而肝硬化患者中每十年即有30 50%的人将演变成肝癌。近年来，随着乙肝疫苗的普遍应用，我国儿童中肝炎的发病得到了很好的控制。但在那些已经感染了乙肝病毒的人群中，肝癌的发病率和死亡率却仍然呈上升趋势。江苏启东是世界著名肝癌(HCC)高发区。据1978-2002年统计资料，男性肝癌的发病率为92. 7/10万，女性肝癌的发病率为27. 8/10万，是邻近上海地区的两倍。HBV感染和黄曲霉毒素暴露是导致启东肝癌发生的两大主要原因。启东HBsAg阳性者肝癌的发病率较HBsAg阴性者高12倍以上。虽然日益增多的研究表明，HBV的生物学特性(包括基因型、 病毒载量及基因变异等)与病毒感染后的临床进展密切相关，但至今有关启东肝癌高发区 HBV流行毒株的基因组特征及变异与肝癌的关系还研究甚少。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，其DNA为部分环状双链DNA，约有3200碱基对，由正链和负链构成。负链有4个开放读码区(0RF)，分别为前S/S区，前C/C区，P区和X区，分别编码乙肝病毒包膜蛋白、核心蛋白(HBcAg)/E抗原(HBeAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。由于HBV复制过程中有一独特的逆转录过程，故较其它DNA病毒更易发生自然突变。随着HBV长期持续性感染，病毒基因组突变逐渐累积，在逃避宿主免疫的同时加重对肝细胞的损伤。HBV核心启动子区(BCP)以及前C区等突变，都曾被报道与严重的肝脏病变相关。因此，应用HBV基因组的突变作为肝癌高危的早期预警标志物，成为近年人们关注的热点问题之一。随着对HBV与肝癌关系研究的深入，到目前为止，人们发现了许多与肝癌发生密切相关的突变位点。HBV的前C基因及C基因共享同一个读码框(前C/C区，nt. 1814-2452)，根据不同的起始密码子，分别编码HBeAg以及HBcAg。由于HBeAg的起始密码子在前C基因，故前C 基因变异会直接影响HBeAg的表达及分泌；而C基因编码的HBcAg可通过诱导病毒特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)作用及通过旁路机制辅助HBV包膜特异性的B细胞产生抗ms中和抗体从而使机体完成对病毒的清除，因此C基因的某些突变则可致使病毒逃避机体免疫清除而持续感染损伤肝细胞。G1896A是HBV前C/C区最常见的突变类型，它可造成的前C蛋白翻译终止从而使HBeAg合成受阻。除此之外，前C基因的其他位点如1856、1862等位点突变也曾被报道可降低前C蛋白信号肽断裂而影响HBeAg的合成。Ehata等通过对HBV慢性感染者的研究，最早提出了该区C基因氨基酸84-101位(nt. 2150-2203)的变异与患者肝脏损伤相关。之后， 其他研究者证实了这一发现，并进一步补充阐述了 C基因某些突变与HBV感染后机体免疫清除间的关系。然而，迄今为止，世界范围内关于HBV前C/C区变异与肝癌关系的研究却甚少。由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤(如肝癌)，目前人们已越来越关注肿瘤的早期诊断和预后，尽管目前本领域已经发现了一些位点的突变与肝癌有关，然而还有必要作进一步研究，从而为肝癌的诊断、分型或预后提供更详尽的依据，进一步提高诊断、分型或预后的准确性。综上所述，本领域迫切需要开发新的可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒。

发明内容
本发明的目的就是提供新的可用于肝癌预测以及早期(辅助性)诊断的检测试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒用于检测核酸样品中是否存在特定的乙型肝炎病毒前C/C 区变异。本发明的另一目的在于提供体外检测核酸样品中特定的乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法。在本发明的第一方面，提供一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C区变异的试剂盒，它包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基 “A”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基 “A”的序列的限制性内切酶。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基 “G”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基 “G”的序列的限制性内切酶。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基 “C”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列结合的探针；或
容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基 “C”的序列的限制性内切酶。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基 “W”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基 “W”的序列的限制性内切酶。在另一优选例中，上述各试剂盒中同时包括了①容器，以及装于所述容器的特异性扩增的引物；和②容器，以及装于所述容器的与含突变位点的序列结合的探针。在另一优选例中，所述的乙型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。在另一优选例中，所述的乙型肝炎病毒前C/C区核苷酸位置编号基于GenBank登录号为⑶434374的乙型肝炎病毒全基因序列。在另一优选例中，所述的引物是具有SEQ ID NO :15_16所示序列的引物对。在另一优选例中，所述的探针具有选自SEQ ID NO :18、20、22、和24中任一所示的序列。在本发明的第二方面，提供一种体外(优选非诊断性地)检测核酸样品中乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法，所述的方法包括以下步骤检测该核酸样品的乙型肝炎病毒前C/C区，并与野生型的乙型肝炎病毒前C/C区比较，存在选自以下变异形式就表明该个体乙型肝炎病毒前C/C区存在核苷酸变异乙型肝炎病毒前C/C区第1899位，G —A。在另一优选例中，所述的变异形式还包括选自下组的一种或多种乙型肝炎病毒前C/C区第2159位，A —G ；乙型肝炎病毒前C/C区第2189位，A —C;或乙型肝炎病毒前C/C区第2203位，G —W。在本发明的第三方面，提供了一种乙型肝炎病毒前C/C区核苷酸序列的用途，它被用于制备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂或试剂盒。在本发明的第四方面，提供了一种SEQ ID NO 1_24所述的引物和/或探针或其组合的用途，它(或它们)被用作肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂；或者用于制备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂盒。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。


图1显示了本研究筛选阶段检测的55条HBV全基因序列基因分型结果。其中，以 A-H起始命名的为GenBank上下来的分型标准株；以Qidong起始命名的为检测标本， 为肝癌样品，〇为肝炎样品。“Qidong”表示启东。
具体实施例方式本发明人通过大规模地对肝癌高发区乙型肝炎及肝癌发病人群进行研究，首次揭示乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位碱基的突变(HBV前C/C区 1899位G — A、2159位A — G突变、2189位A — C突变以及2203位G — W突变)与肝癌的发生密切相关。因此，可将该这些位点的变异作为肝癌易感性标志，从而设计特异性检测所述突变位点的试剂或试剂盒。在此基础上完成了本发明。本发明人自1992年起，建立了一个用于肿瘤病因学研究的前瞻性队列，共计 1，638人。此队列中慢性肝炎符合2000年《病毒性肝炎防治方案》诊断标准。队列含 HBsAg (+)患者852例(其中男性776例，女性76例)，HBsAg㈠患者786例(男性723例， 女性63例)。迄今为止，队列中累计发生肝癌189例，其中HBsAg(+)患者中有170例发生肝癌。队列成员每年随访一次，留有完整的随访资料和系列血样，长达15年。对该队列成员的研究首次发现，乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2189、2203、2159位突变在肝癌患者中的比例显著高于慢性肝炎患者。如本文所用，术语“乙型肝炎病毒前C/C区”指乙型肝炎病毒前C/C区，其核苷酸序列为GenBank登录号⑶434374所示乙型肝炎病毒序列的核苷酸第1814-2452位。以C基因型为例，野生型的乙型肝炎病毒前C/C区如SEQ IDNO :25 (C基因型)和SEQ ID NO :26(B 基因型)所示。如本文所用，术语“肝癌相关的乙型肝炎病毒前C/C区变异”指乙型肝炎病毒前 C/C区第1899、2189、2203、和/或2159位突变，尤其是第1899位G — A (简写为G1899A)； 第2159位A — G(简写为A2159G)；第2189位A — C(简写为A2189C)禾Π /或第2203位 G-K简写为G2203W)。应理解，所述的变异可以是一个位点的突变，也可以是2、3或4个位点的突变的组合。基于本发明人的新发现，可以将乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2189、2203、2159 位的相关突变作为标志，从而从乙型肝炎病毒阳性的人群中分离出对于肝癌易感性的人群，或作为肝癌疾病的鉴别诊断、和/或易感性分析的辅助性工具；早期评估相关人群肝癌患病风险。例如，可从乙型肝炎病毒阳性患者人群中分离出乙型肝炎病毒前C/C区第第 1899、2189、2203、2159位发生突变的人群，作为肝癌的高发人群，从而达到早期监测早期预防的目的。此外，还可通过进一步检测乙型肝炎病毒前C/C区其它位点的突变情况来评估肝癌易感性。本发明人的研究发现，乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位的突变结合可提高肝癌发生的可能性。所述突变(G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W) 在肝癌患者中的发生比例显著高于慢性肝炎患者中的比例。基于本发明人的上述发现，可采用各种技术来检测乙型肝炎病毒前C/C区第 1899、2159、2189、和/或2203位的碱基的突变情况，这些技术均包含在本发明中。例如，对相关位点进行序列测定，从而判断是否发生变异。在检测相关位点的变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此可用例如Western印迹法间接判断基因有无突变。此外，可用相关位点特异的引物进行聚合酶链反应(PCR)来进行体外鉴定；或者可根据相关位点设计可特异性结合的探针来进行体外鉴定；或者可利用特异性的限制性内切酶来进行体外鉴定。作为一种可选的方式，还可采用基于PCR技术的单碱基延伸技术来检测变异位点，其原理是设计一条引物，位于待测变异位点的上游，并且该引物的3'端距离变异位点一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，只有当加入的ddNTP与变异位点碱基互补时，引物才得以延伸。可通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断变异的类型。本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂。所述的试剂例如是对相关突变位点特异的引物；对相关突变位点特异的探针；或对相关突变位点特异的限制性内切酶。本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂盒，该试剂盒包括装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A” 的序列的引物；或与乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列结合的探针；或可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的限制性内切酶。更佳的，所述试剂盒中还包括装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G” 的序列的引物；或与乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列结合的探针；或可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的限制性内切酶。更佳的，所述试剂盒中还包括装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C” 的序列的引物；或与乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列结合的探针；或可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的限制性内切酶。更佳的，所述试剂盒中还包括装在适当容器中的、用于特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W” 的序列的引物；或与乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列结合的探针；或可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的限制性内切酶。当所述试剂盒中含有针对多于一个位点变异情况的检测试剂时，检测或评估的准确性可能提高。
作为本发明的可选择的方式，所述的试剂盒中可包括特异性与乙型肝炎病毒前 C/C区发生G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W突变的基因产物结合且不结合于相关位点未突变的基因产物的抗体。更优选的，所述试剂盒中还包括常规的可用于检测抗原抗体结合状况的试剂。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂， 包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。本发明的主要优点在于(1)通过大规模地对乙型肝炎或肝癌发病人群进行研究，发现并证实肝癌发生相关的新的变异位点，研究病例多，准确性高。(2)首次针对新的变异位点，设计出特异性的检测试剂和试剂盒，为早期评估相关人群肝癌患病风险提供了新的途径。(3)基于早期检测结果，对于携带新的变异位点的乙型肝炎病毒携带者个体，可采取加强随访和复查等手段，以便能够尽早确诊和治疗。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(NewYork Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。材料和方法病人和标本1研究对象本研究筛选阶段中所使用的血清样品来自启东肿瘤医院。在初步的乙型肝炎病毒肝癌相关变异筛选中，共选取了 55份病人样品，其中20份来自于肝癌患者，35份来自于慢性肝炎患者。两组间年龄、基因型分布均无显著差异[年龄，肝癌组43. 57士9. 92岁 vs.慢性肝炎组37. 19士 10. 76岁，P = 0. 074 ；基因型分布(B 基因型基因型)，肝癌组2 :18vs.慢性肝炎组6 :29，P = O. 696]。本研究验证阶段中所使用的血清样本来自1992年起在启东肝癌高发现场建立了一个用于肿瘤病因学研究的前瞻性队列。其中HBsAg阳性成员852名，配以年龄、性别相近、 居所相邻的HBsAg阴性成员786名，共计1638人。队列成员每年随访一次，留有完整的随访资料，血清每年收集一次，于-40°C保存。本研究验证阶段中的病人血清样品均取自于此队列HBsAg阳性组。慢性肝炎患者诊断符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准；肝癌诊断符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会通过的的《原发性肝癌的临床诊断与分期》标准。在验证阶段的病例-对照研究中，选取了 206份病人样品，其中103份来自于肝癌患者，103份来自于慢性肝炎患者，两组的年龄、性别比率及HBV基因型分布均无显著性差异(表1)。研究对象的性别比率符合我国肝癌发病性别比(男女约为4-5 1)；研究对象的HBV基因型分布符合肝癌高发区HBV流行情况，为研究的准确性奠定了基础。在验证阶段的纵向调查研究中，选取了 5位肝癌确诊当年伴有G1899A和/或 A2159G和/或A2189C的患者样品进行研究，每一患者诊断肝癌前2到8年的血清中至少有 2份血清样品可供研究。本研究的试剂盒应用阶段所使用的随访病人血清样品来自上海大华医院。在回顾性研究中，共选取了 100份病人样品，其中50份来自肝炎患者，50份来自慢性肝炎患者。本研究的试剂盒应用阶段所使用的200名HBsAg阳性随访病人血清样品，来自上海大华医院。本研究中的样品的采集都获得了病人或研究对象的同意。表1验证研究中的肝癌和慢性肝炎患者临床情况及基本病毒学参数
HCC (η = 103)CH (η = 103)P值年龄50. 58 ±10. 4448. 54±10. 140. 157性别，男89(86. 4% )89(86. 4% )1. 000B基因型7(6. 8% )5(4. 9% )0. 552C基因型90(87. 4% )88(85. 4% )0. 684其他基因型6(5. 8% )10(9. 7% )0. 298其中，HCC表示肝癌；CH表示慢性肝炎。2血清HBV DNA的抽提采用经典的蛋白酶消化/酚-氯仿-异戊醇抽提法提取血清中HBV DNA。取血清 100 μ 1 加入 400 μ 1 裂解液(10mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0，lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl， 0. 5 % SDS，蛋白酶K 120 μ g/μ 1)50 V消化4h后加等体积酚_氯仿-异戊醇(体积比 25 24 1)抽提一次，8000r/min离心15min，上清液中加1/10体积的3mol/L乙酸钠 (pH5. 2)和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。70%乙醇洗沉淀一次，沉淀挥干后重悬于30 μ 1 含20 μ g/ml的RNA酶A无菌水中。3HBV全基因序列的扩增与测序(供HBV全基因筛选肝癌相关变异)以抽提好的HBV DNA为模板扩增HBV全基因序列，正向引物为FF1，反向引物为 FRl (表2)。将PCR产物克隆入T载体，应用T载体通用引物ml3+47/ml3-48及HBV特异性引物 HBV3096F/HBV2415F/HBV786R/HBV1329R(表 2)对 HBV 全基因序列进行测序。PCR 反应体积为50 μ 1，含IXPCR缓冲液(MgCl2L 5mM), dNTP 0. 2mM，正、反向引物各0. 2 μ M，血清 HBV DNA 1 μ 1，LA Taq IU(日本Takara公司)。扩增经预变性94°C 3min后，进入35个循环程序94°C 30sec/65°C 30min/72°C 3. 5min，最后 72°C延链 7min。PCR 产物经 AxyPr印试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)纯化后，送全自动测序(上海联合基因有限公司)。
4HBV前C/C区核苷酸第1824-2275位的扩增(供验证HBV前C/C区肝癌相关位
点)以抽提好的HBV DNA为模板，采用半巢式PCR的方法扩增HBV前C区/C区 nt. 1824-2275。第一轮，正向引物为Pre-C F1，反向引物为HBV2433R ；第二轮，正向引物序列与第一轮正向引物相同，反向引物为Pre-C R2 (见表2)。PCR反应体积为25 μ 1，各成分终浓度为PCR 缓冲液 IX (MgCl2L 5mmol/L)，dNTP 0. 2mmol/L，正、反引物各 0. 4 μ mol/L，血清HBV DNA 2 μ 1，TakaRa LA Taq IU(日本TaKaRa公司)。半巢式PCR2轮扩增条件相同，均采用热启动PCR，经预变性94°C 3min后，进入循环程序94°C 30sec/60°C 30sec/72°C lmin, 共35个循环，最后72°C延伸7min。PCR产物经AxyPr印试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)纯化后，送全自动测序(上海联合基因有限公司)。表2寡核苷酸引物
权利要求
1.一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C区变异的试剂盒，其特征在于， 它包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第1899位为碱基“A” 的序列的限制性内切酶。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2159位为碱基“G” 的序列的限制性内切酶。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2189位为碱基“C” 的序列的限制性内切酶。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列的引物；和/或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒前C/C区第2203位为碱基“W” 的序列的限制性内切酶。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物是具有SEQID N0:15和SEQ ID NO: 16所示序列的引物对。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针具有选自SEQIDNO =18,20, 22、和24中任一所示的序列。
8.—种体外检测核酸样品中乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤检测该核酸样品的乙型肝炎病毒前C/C区，并与野生型的乙型肝炎病毒前C/C区比较， 存在选自以下变异形式就表明该个体乙型肝炎病毒前C/C区存在核苷酸变异乙型肝炎病毒前C/C区第1899位，G-A0
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的变异形式还包括选自下组的一种或多种乙型肝炎病毒前C/C区第2159位，A — G ； 乙型肝炎病毒前C/C区第2189位，A — C ；或乙型肝炎病毒前C/C区第2203位，G — W。
10.一种乙型肝炎病毒前C/C区核苷酸序列的用途，其特征在于，用于制备肝癌预测或肝癌早期辅助诊断的试剂或试剂盒。
全文摘要
本发明涉及乙型肝炎病毒前C/C区变异及其用途。具体地，本发明公开了检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C区变异的试剂或试剂盒。本发明还公开了体外检测核酸样品中乙型肝炎病毒前C/C区变异的方法。本发明的研究表明，乙型肝炎病毒前C/C区第1899、2159、2189、和/或2203位的碱基的突变与肝癌的发生密切相关，可作为肝癌预测/肝癌早期辅助诊断的分子标志物。
文档编号C12Q1/70GK102212619SQ20101014473
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者屠红, 朱宇, 金晏, 钱耕荪 申请人:上海市肿瘤研究所