专利名称：：Cyp2e1基因snp检测特异性引物、液相芯片和检测方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP2E1基因SNP检测特异性引物、液相芯片和检测方法。
背景技术：
：二甲基亚硝胺D-脱甲基酶(CytochromeP4502E1,CYP2E1)是代谢内源性物质和外源性物质的细胞色素酶P450超家族中的一员，主要参与亚硝胺及其前致癌物N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基四吡咯烷的代谢，同时参与酒精的氧化代谢和产生自由基而启动脂质过氧化。CYP2E1在解毒和代谢方面较CYP450其它酶更为重要，对乙醇、亚硝胺、苯类及四氯化碳等毒性物质具有特异的代谢作用。同时，CYP2E1基因多态性与肺癌、肝癌和鼻咽癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关。目前CYP2E1作为一种重要的生物转化酶，其遗传多态性与多种疾病的易感性已成为临床研究的热点。有研究表明，中国人群中存在CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*5型突变体。CYP2E1*2是由于外显子2上第1168位的G—A突变引起第76位氨基酸由Arg(R)变为His(H)，导致酶活的降低，该基因型在中国人的突变率为2.56%。而CYP2E1*3则是由于外显子8第10059位的G—A突变引起氨基酸第389位由Val(V)变成lie(I)，但酶活并无明显改变。CYP2E1*5是发生在5’端非编码区的RsaI/PstI位点多态性，与肺癌易感性关系密切。携带CYP2E1*5野生基因型个体发生肺癌的风险是携带CYP2E1*5突变基因型个体的1.55倍，CYP2E1*5突变基因型可能是肺癌发生的保护和抑制因素，CYP2E1*5基因型中的RsaI变异等位基因的存在能降低肺腺癌的发病率，野生型CYP2El*5RsaI却能增加肺腺癌的易感性。在CYP2E1基因的5’端非编码区，RsaI和PstI多态呈完全连锁，野生型等位基因(cl)的第1053核苷酸存在一个RsaI酶识别部位，而突变型等位基因(c2)在该处发生点突变(C—T)，使RsaI酶识别部位消失；相反野生型等位基因(cl)的第1293位核苷酸不存在PstI酶识别部位，但发生点突变(G—C)后，在该处形成PstI酶识别部位，从而产生(c2)等位基因。两种等位基因形成A型(cl/cl)、B型(cl/c2)和C型(c2/c2)3种基因型，研究发现C型基因增强子活性是A型基因增强子活性的10倍，PstI和RsaI限制性片段多态性在转录水平影响CYP2E1的表达，c2等位基因使其表达增加。CYP2E1的基因多态性使其转录活性有明显差别，从而导致CYP2E1在体内的活性不同。目前国内外几乎没有检测CYP2E1基因多态性的产品上市，大部分的报道仍处于实验研究阶段，尚未商品化。已有的检测技术主要建立在传统固相芯片和PCR的基础上，传统固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差，而其它以PCR为基础检测技术，主要有荧光定量PCR和直接测序法，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时检测通量存在局限性，不能满足检测应用的需要。
发明内容本发明的目的之一是提供CYP2E1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2E1基因的正常基因型以及三种常见等位基因型G1168A、C1053T和G1293C的变异。实现上述目的的技术方案如下一种CYP2E1基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A).针对CYP2E1基因的SNP位点分别设计的ASPE弓丨物对每种ASPE引物由5，端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为针对G1168A位点的SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、针对C1053T位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、和/或针对G1293C位点的SEQIDNO.11及SEQIDN0.12；所述tag序列选自SEQIDN0.I-SEQIDN0.6中的序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQIDN0.13SEQIDN0.18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于分别扩增具有G1168A、C1053T和/或G1293CSNP位点的CYP2E1基因目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对G1168A位点的SEQIDN0.19及SEQIDN0.20、针对C1053T位点的SEQIDN0.21及SEQIDN0.22、和/或针对G1293C位点的SEQIDN0.23及SEQIDN0.24。优选地，所述ASPE引物对为针对Gl168A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDN0.7组成的序列及由SEQIDNO.1和SEQIDN0.8组成的序列、针对C1053T位点的由SEQIDN0.3和SEQIDN0.9组成的序列及由SEQIDN0.4和SEQIDNO.10组成的序列；和/或针对G1293C位点的由SEQIDN0.5和SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDN0.6和SEQIDN0.12组成的序列。优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP2E1基因SNP进行检测的方法。具体技术方案如下一种使用上述液相芯片对CYP2E1基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤(一)PCR扩增待测样品DNA；(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素_藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。本发明的另一目的是提供用于CYP2E1基因SNP检测的特异性引物。具体技术方案如下用于CYP2E1基因SNP检测的特异性引物，包括有针对G1168A位点的SEQIDN0.7及SEQIDN0.8、针对C1053T位点的SEQIDN0.9及SEQIDN0.10、和/或针对G1293C位点的SEQIDNO.10及SEQIDN0.12。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的CYP2E1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现多个SNP位点的并行检测。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。本发明所设计的各种特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。3.本发明的检测方法步骤简单，一步多重PCR即可完成三个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征，从而使检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。同时，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。具体实施例方式实施例1CYP2E1基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE引物针对CYP2E1的三种常见SNP位点G1168A、C1053T和G1293C，分别设计特异性引物序列。其中，G1168A为CYP2E1*2型突变，位于外显子2;C1053T与G1293C为CYP2E1*5型突变，位于5’非编码区；ASPE弓丨物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)ASPE引物基因基因型类型--Tag特异性引物序列CYP5’CTTTTACAATACTTCAACTGTACGTGGGCTCGCG1168A-W2E1TACAATC(SEQNO.1)AGCG3'(SEQNO.7)Gl168A---5’AATCCTTTCTTTAATCTCCTGTACGTGGGCTCGCGl168A-mAAATCA(SEQNO.2)AGCA3'(SEQNO.8)5'ATACTTCATTCATTCATATTCATTGTTAATATAAC1053TC1053T-WCAATTCA(SEQNO.3)AAGTAC3'(SEQNO.9)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用lOmmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的六种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>选择的6种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH20配成lOOnmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(η彡3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用Poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。微球包被的过程如下分别取5XIO6个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入IOul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配M10ng/ml白勺EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(_自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02%的Tween-20洗涤一次，再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于IOOul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA中，2_8°C避光保存。每种微球分别带有不同颜色编码。三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物目标检测的3种常见SNP位点G1168A、C1053T和G1293C，其中CYP2E1*2(G1168A)位于外显子2；CYP2E1*5(C1053T/G1293C)位于5，非编码区。利用Primer5.0设计三对引物(见表3)，分别扩增出三条具有SNP位点的目标序列。表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物SEQ基因检测位点类型扩增引物(5’-3')NO.19Gl168A-FGCTTAGAGCCCCGCACCT--G1168A----20Gl168A-RGGACTCACCCCTGTCCCTGTGTAGAAAAACTGGGTTAGAATG21C1053T-FCYP2E1C1053TC22C1053T-RTCTTGTCTTTGTTGATCCCG23G1293C-FAACCAGAGGGAAGCAAAGG-G1293C--24G1293C-RCATTCTGTCTTCTAACTGGCAA所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用IOmmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。实施例2运用实施例1所述CYP2E1基因SNP检测液相芯片对样本的检测所述各种溶液的配方如下50mM的MES缓冲液(ρΗ5·0)配方(250ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>过滤后贮存于4°C。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。一、样本的DNA提取参照AxyPr印全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。二、待测样品的PCR扩增利用Primer5.0设计三对引物，多重PCR—步扩增出CYP2E1的外显子2和5，非编码区的3共两条具有SNP位点的目标序列，产物大小分别为370bp、412bp和366bp。引物序列(SEQNO.19-24)见上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液分别各取SEQN0.19-24的引物贮存液IOOul于1.5ml微量离心管中，混合均勻即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下10X缓冲液(含Mg2+)5uldNTP(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL)6ul模板DNA(10ng/ul)IulddH2033.5ul共50ulPCR扩增程序为95°C3min；94°C20s，56°C30s,72°C30s，30个循环；72°CIOmin；4°C保存备用。三、PCR产物的酶切处理参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37°C孵育15min。80°C孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。首先配制混合的ASPE引物工作液分别各取G1168A-W、G1168A_m、C1053T_w、C1053T-m、G1293C-w、G1293C-m相应的ASPE引物贮存液IOul于1.5ml微量离心管中，加入IOmmol/LTrisBuffer补至200ul，混合均勻即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下IOX缓冲液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各lOOumol/L)IulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)Iul酶切处理的PCR扩增产物5ulddH2010.ul共20ulPCR程序为96°C2min；94°C30s，58°Clmin，72°C2min，30个循环；4°C保存备用。五、杂交反应1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的六种微球(微球浓度均为2.5XIO5个/ml)。2.分别取Iul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；3.微球于彡IOOOOg离心l_2min；4.弃去上清，微球重悬于IOOul的2XTm杂交缓冲液中，涡旋混勻；5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH20；6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH20补足至50ul；7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育杂交；8.杂交后的微球于彡3000g离心2_5min；9.去上清，将微球重悬于75ul的1XTm杂交缓冲液中；10.微球于彡3000g离心2_5min；11将微球重悬于75ul的IXTm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；12.37°C孵育15min，于Luminex仪器上检测。六、结果检测与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10XPCR阴性对照MFI；2.NETMFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值突变比值=突变型NETMFI+(突变型NETMFI+野生型NETMFI)4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。使用本方法检测大量样本的CYP2E1基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2E1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的CYP2E1基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP2E1基因的SNP类型，且结果稳定可靠。表4样本检测结果(MFI)序号NO.G1168A-WG1168A_m|C1053T-WC1053T_m|G1293C-WG1293C_m阴性对照~~171412251024~I24611361256176815981856~~2298221920821462721238258913332632433038144~Ε6138433159242963~245215733161502870230~~6256618530322453462225~2382159312504482828<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5样本CYP2E1基因多态性分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CYP2E1基因SNP检测基因突变的检测一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)以CYP2E1基因CYP2E1*2(G1168A)位点突变的检测液相芯片为例，针对G1168A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQIDNO.I-SEQIDNO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQIDNO.13-SEQIDNO.18。具体设计如下表(表6)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。表6液相芯片制备的设计<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>二、样品检测采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下表7样本检测结果(MFI)与基因多态性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>312165246325081351252345%4%___8%323146286731461482152354%7%6%一332245218423851351152855%5%10%___342974281229121471842394%—6%7%352503330121432173091377%8%5%363103260931681523802594%12%7%372209262229071422562465%9%7%382610312428522342682517%8%8%392493264222432461972358%7%9%402971332228661252323183%6%9%以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。权利要求一种CYP2E1基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A).针对CYP2E1基因的SNP位点分别设计的ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为针对G1168A位点的SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、针对C1053T位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10和/或针对G1293C位点的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12；所述tag序列选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.6中的序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.13～SEQIDNO.18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于分别扩增具有G1168A、C1053T和/或G1293CSNP位点的CYP2E1基因目标序列的扩增引物。2.根据权利要求1所述的CYP2E1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对G1168A位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、针对C1053T位点的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或针对G1293C位点的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24。3.根据权利要求1或2所述的CYP2E1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对G1168A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.7组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDN0.8组成的序列、针对C1053T位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.9组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.10组成的序列、和/或针对G1293C位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.12组成的序列。4.根据权利要求1所述的CYP2E1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。5.根据权利要求4所述的CYP2E1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。6.一种使用权利要求1-5任一项所述液相芯片对CYP2E1基因SNP检测的方法，其特征是，主要包括以下步骤(一)PCR扩增待测样品DNA;(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素_藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。7.用于CYP2E1基因SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有针对G1168A位点的SEQIDN0.7及SEQIDNO.8、针对C1053T位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、和/或针对G1293C位点的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12。全文摘要本发明公开了CYP2E1基因SNP检测特异性引物、液相芯片和方法，所述液相芯片包括针对每种型别的突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对、分别包被有特异的anti-tag序列的微球，和用于分别扩增具有G1168A、C1053T和/或G1293CSNP位点的CYP2E1基因目标序列的引物。所制备的CYP2E1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。所述检测方法步骤简单，3种SNP位点可以一步检测完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。文档编号C12Q1/68GK101805798SQ20101014837公开日2010年8月18日申请日期2010年4月9日优先权日2010年4月9日发明者朱泽尧,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司