一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法

专利名称：一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法。
背景技术：
自上世纪50年代以来，大量广泛使用化学农药造成病原菌对化学农药产生抗性， 高残留引起环境污染，以及化学农药对人畜产生毒害等加速了人们寻求新的、安全有效的 植物病害防治途径。在防治植物病害的各种措施中，生物防治具有对环境、生态和人类健康 较为安全的优点，因此，世界各国十分的重视生防微生物研究的开展和利用。生防微生物具 有不易使病原菌产生耐药性、对环境安全、生产工艺较简单以及不少微生物同时具有促进 作物生长的特点而引起人们的关注和重视，它将在病害防治中发挥越来越重要的作用。利 用拮抗微生物对病原菌的抗生作用、营养和空间竞争、重寄生作用及其诱导植物产生的系 统抗病性等作用，来防治植物病害是植物病害生物防治的一个最重要的组成部分。在植物 病害的生物防治中，放线菌是众多拮抗微生物中最具竞争能力的生防菌之一，放线菌由于 能产生化学结构多样的具有抗生素活性的代谢产物而广泛应用于农业生物防治中。自Cohn(1872)发现放线菌至今，已经报道了 69个属1687种。在已知的放线菌中， 半数以上发现具拮抗性，其中应用于生物防治的主要是链霉菌属Str印tomyces的一些种 类，其次有诺卡菌属Nocardia、游动放线菌属Actinoplanes、小单孢菌属Micromonospora 等。近10年来从微生物中发现的新活性物质中放线菌产生占70%以上，生防放线菌的筛选 和应用已成为植物病理学领域的研究重点。放线菌对靶标菌发挥生防作用一般通过两种途径在寄主体外通过抗生作用、竞 争作用、捕食和重寄生作用，导致病原菌的致病性及侵染效率降低；放线菌也可在寄主植物 组织内，诱发其产生抗性或者产生抑菌物质，影响病原菌的生长、繁殖，最后导致其死亡。利用放线菌防治植物病害，特别是土传病害已有许多成功事例。早在1950年， Cooper V E就发现放线菌对甘蔗根腐病Fusarium arrkenomnes有显著的拮抗作用。用放线 菌的孢子和菌丝制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容 性好、防病持效期长等优点。世界上已广泛应用的放线菌活体制剂Mycostop，就是由芬兰的 Kemira(1989)从泥煤中分离到的灰绿链霉菌S. griseovidis的孢子和菌丝制成的活细胞 制剂，主要用来防治镰孢菌Fusarium sp.、疫霉菌Phytophthora sp.和丝核菌Rhizoctonia sp.等一些常见的土传病原菌，通过种子处理、土壤喷洒或灌根等措施处理后，Mycostop可 在植物根部定殖、生长和繁殖，阻止病原菌的侵入，并可产生激素促进寄主植物的生长，从 而提高作物的产量。1953年中国科学院用从我国陕西泾阳县苜蓿根土中分离获得的细黄链 霉菌Str印tomycesmicroflavus制成的“5406”抗生菌推广的面积最大。通过拌种将其施 于田间，具有防病、保苗和增产的效应。近年来，国内外已对辣椒疫病、棉花立枯病、棉花枯萎病、黄瓜枯萎病、小麦全蚀 病、香蕉枯萎病及大豆疫霉根腐病等土传病害的拮抗放线菌筛选与生防应用等进行了研 究。Mark A. Roberts (2001)分离、筛选出700株具有抑制和杀灭多种植物病原菌能力的放
5线菌，尤其对真菌引起的根部病害效果显著。易龙等从辣椒根际土壤中分离筛选出对辣椒 疫病有较强拮抗作用的放线菌7株，其中菌株CQ21-3的温室盆栽控病效果达73. 2% ；宗兆 锋等从土壤中分离的58株放线菌筛选出了 2株对棉花立枯病、黄萎病有较好的防治作用 的几丁质酶产生菌；潘荣光等从208株放线菌筛选出对黄瓜枯萎病菌有拮抗性菌株12株， 其中菌株PM-1的抑菌谱广，对靶标菌菌丝有明显致畸作用；乔宏萍等从新疆保护地蔬菜和 棉田采集的土样中分离筛选12株对小麦全蚀病具有拮抗作用的放线菌，3株抑菌效果达到 80%以上，防病促生作用明显；曹理想等(2003)对香蕉内生放线菌进行分析发现，玫瑰浅 灰链霉菌对尖孢镰刀菌有明显的拮抗活性。此外，放线菌产生的抗生素广泛应用于工业、农业和医学领域，很大一部分在在农 作物病虫害防治方面也起着至关重要的作用，并取得了巨大的社会效益、经济效益和生态 效益。由于其具有无污染、无残留、可再生、不易使有害生物产生抗药性、成本低、易于产业 化等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向之一。鉴于放线菌及其代谢产物 在防治病害、促进作物的生长、提高作物产量等方面的重要作用，正越来越多地被人们开发 和应用。苜蓿Medicago sativa L.是重要的优质豆科牧草，被誉为“牧草之王”，兼具改良 土壤、减少水土流失等生态功能，在我国西部生态建设中具有重要作用。近年来，随着作物 布局、气候条件与生态环境的变化，以及苜蓿生产中的品种单一化与多年连作，为病害的发 生与流行创造了条件。苜蓿根腐病普遍发生于各苜蓿栽培区，由其引发的苜蓿草地衰退导 致其利用期缩短，该病已成为苜蓿生产的主要限制因素之一。如何对该病害进行科学有效 的防治，使苜蓿人工草地最大限度地发挥生产、经济和社会效益，已成为越来越迫切需要解 决的问题。对苜蓿根腐病的防治目前主要依靠选育抗性品种和化学药剂加以控制。但目前 生产中缺乏真正有效的抗病品种，或者是抗病品种的抗病性极易丧失。化学杀菌剂的过量 应用易使病原菌抗药性，草产品农药残留超标，生态环境污染加重，致使其应用受到局限。 因此符合环保、健康要求的生物农药的研究与应用日益受到关注。为开发拮抗放线菌杀菌剂，需建立一套有效的筛选模型对大量的放线菌菌株进行 结果可靠的抗活性筛选。现有技术中，大多只采用平板抑菌实验法(如平板对峙法、抑菌 圈法、牛津杯法、管碟法、挖块法、琼脂块法或滤纸片法)、孢子萌发法等单一离体筛选模型 对活性菌株进行筛选，其筛选结果不可靠，使得后续研究结果不能真正服务于农业生产。因 此，需要寻找更加有效的拮抗放线菌筛选方法。

发明内容
本发明的一个目的是提供一株灰黄链霉菌。本发明所提供的灰黄链霉菌菌株为灰黄链霉菌(Str印tomyces griseoflavus) NMG6-3-9，其保藏编号为 CGMCC No. 3441。该菌株已于2009年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3441。该菌株的分类命名为灰黄链霉菌(Streptomyces griseof lavus)，菌株名称为 NMG6-3-9。本发明的另一个目的是提供一种菌的拮抗剂。
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本发明所提供的菌的拮抗剂，其活性成分为灰黄链霉菌 (Streptomycesgriseoflavus)NMG6-3-9 CGMCC No. 3441 ；所述菌为苜蓿茄镰孢菌Fusarium solmi、苜蓿尖镰孢菌Fusarium oxysporum、燕麦德抱菌 Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis、半裸镰 刀菌 Fusariumsemitectum、香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果 腐霉 Pythiumaphanidermatum、苜猜壳针抱 Septoria medicaginis、瓜类壳二抱 Ascochytacitrullina、大 HI3 轮枝抱 VerticiIlium dahlia、禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis、胶抱炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、禾弯抱霉菌 Curvularia lunata、大斑突赃抱 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉红聚端 孢Trichothecium roseum、丁香假单胞菌Pseudomonas syringae、胡萝卜软腐欧文氏 菌 Erwinia carotovora var. carotovora、首猜黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum、禾P/或燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口 / 或金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureaus。上述拮抗剂中，所述燕麦镰孢菌Fusarium avenaceum为燕麦镰孢菌 Fusariumavenaceum ACCC 30065，所述立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 为立枯丝核菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis 为禾谷镰孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068，所述半裸德刀菌 Fusariumsemitectum 为半裸 德刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 为香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubenseACCC 36369，所述瓜果腐霉 Pythium aphan i derma turn 为瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum ACCC 36125，所述瓜类壳 二孢 Ascochyta citrullina 为瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大丽 轮枝孢 Verticillium dahlia 为大丽轮枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109，所述禾顶 囊壳 Gaeumannomycesgraminis 为禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310，所述 禾弯孢霉菌Curvularia lunata为禾弯孢霉菌Curvularia lunata ACCC 36580，所述辣
Phytophthora capsiciPhytophthora capsici ACCC 36279, Bf
述灰葡萄孢Botrytis cinerea为灰葡萄孢Botrytis cinerea ACCC 30091，所述核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 为核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC30096，所述粉红 聚端孢 Trichothecium roseum 为粉红聚端孢 Trichothecium roseumACCC 36459，所述古月 萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora为胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum为 青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearumACCC 01470，所述金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureaus 为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。灰黄链霉菌(Str印tomycesgriseoflavus)NMG6-3-9 CGMCC No. 3441 在制备如下 菌中至少一种菌的拮抗剂中的应用也属于本发明的保护范围苜猜前镰孢菌Fusarium solani、苜猜尖镰孢菌Fusarium oxysporum、燕麦镰孢 菌 Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、禾谷德抱菌 Peronospora aestivalis、半裸德刀菌 Fusariumsemitectum、香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、 苜猜壳针孢Septoria medicaginis、瓜类壳二孢Ascochytacitrullina、大丽轮枝孢 Verticillium dahlia、禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis、胶抱炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、胃 胃 Curvularia lunata^ 大■突 M f包 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉红聚端抱 Trichothecium roseum、丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae、古月萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora、 苜猜黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum、禾口/或燕麦嗜酸菌西瓜亚禾中Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口/或金 胃王求胃 Staphylococcusaureauso上述应用中，所述燕麦镰孢菌Fusarium avenaceum为燕麦镰孢菌 Fusariumavenaceum ACCC 30065，所述立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 为立枯丝核菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis 为禾谷镰孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068，所述半裸德刀菌 Fusariumsemitectum 为半裸 德刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 为香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubenseACCC 36369，所述瓜果腐霉 Pythium aphan i derma turn 为瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum ACCC 36125，所述瓜类壳 二孢 Ascochyta citrullina 为瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大丽 轮枝孢 Verticillium dahlia 为大丽轮枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109，所述禾顶 囊壳 Gaeumannomycesgraminis 为禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310，所述 禾弯孢霉菌Curvularia lunata为禾弯孢霉菌Curvularia lunata ACCC 36580，所述辣
Phytophthora capsiciPhytophthora capsici ACCC 36279, Bf
述灰葡萄孢Botrytis cinerea为灰葡萄孢Botrytis cinerea ACCC 30091，所述核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 为核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC30096，所述粉红 聚端孢 Trichothecium roseum 为粉红聚端孢 Trichothecium roseumACCC 36459，所述古月 萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora为胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum为 青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearumACCC 01470，所述金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureaus 为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。本发明的最后一个目的是提供一种筛选拮抗苜蓿根腐病的放线菌的方法。本发明所提供的筛选拮抗苜蓿根腐病的放线菌的方法，包括如下步骤1)从待分离样品中得到纯培养放线菌；2)用平板对峙法、抑菌圈法、牛津杯法、管碟法、挖块法、琼脂块法或滤纸片法，从 步骤1)中所述纯培养放线菌中筛选对靶标菌具有拮抗作用的放线菌菌株，得到拮抗靶标 菌的放线菌菌株；所述靶标菌为引起苜蓿根腐病的菌；3)用孢子萌发法，从步骤2)中所述拮抗靶标菌的放线菌菌株中筛选抑制所述靶 标菌孢子萌发的放线菌菌株，得到抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株；4)用温室盆栽活体法对步骤3)得到的放线菌菌株进行检测，得到拮抗苜蓿根腐 病的放线菌。
上述方法中，所述温室盆栽活体法包括如下步骤a)发酵培养所述抑制所述靶标 菌孢子萌发的放线菌菌株，得到含有所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的发酵 液，将所述含有所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的发酵液接种于土壤中，得到 土壤和所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的混合物；b)将苜蓿种子接种于步骤 a)中所述混合物中，培养；c)待所述苜蓿种子出苗30d后，用所述靶标菌的孢子悬浮液进行 伤根接菌，继续培养，检测防治率，防治率大于等于75%的放线菌菌株即为拮抗苜蓿根腐病 的放线菌。上述方法中，所述步骤a)中，所述土壤和所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌 菌株的混合物中所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的浓度为108cfu/g ；和/或，所述步骤c)中，所述伤根接菌的接种量为106cfu/g 土壤。上述方法中，所述步骤3)中所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株为对所 述靶标菌孢子的萌发抑制率大于等于80%的放线菌菌株。上述方法中，所述靶标菌为苜蓿根腐病菌；所述苜蓿根腐病菌为苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani、苜猜尖德抱菌 Fusarium oxysporum 或燕麦德抱菌 Fusariumavenaceum ； 所述待分离样品为土壤。平板抑菌实验中，本发明菌株对靶标菌苜蓿茄镰孢菌Fusarium solmi的抑 菌圈直径为32. 68mm;孢子萌发抑制实验中，本发明菌株对靶标菌苜蓿茄镰孢根腐病菌 (F.solmi)的抑制率为100% ；活体盆栽防病效果检测实验中，本发明菌株作用组，植株 病情指数为16. 35，发病率为39. 68%，防效为81. 50%，效果显著好于对照组(井岗霉 素、发酵培养基、清水)。另外，本发明菌株具有广谱的抗菌性，对如下菌均具有很好的 拮抗性苜蓿茄镰孢根腐病菌F. solrni，苜蓿尖镰孢根腐病菌F. oxysporum,燕麦镰孢菌 F. avenaceum，苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum,立枯丝核菌 Rhizoctonia solani， 禾谷德刀菌F. graminearum，半裸德刀菌F. semitectum，香蕉枯萎菌F. oxysporum f. sp. cubense，瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum，苜猜壳针抱 Septoria medicaginis，瓜类壳 二抱 Ascochyta citrullina，大HI3轮枝抱 Verticilliumdahlia,禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis,I^Jfe^；Colletotrichumgloeosporioides,TR^Jfe^^Curvularia lunata， 大斑突Mf包 Exserohilumleonardturcicum,辣椒疫毒菌 Phytophthora capsici,灰葡萄 抱 Botrytis cinerea，核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum，粉红聚端抱 Trichothecium roseum ；丁香假单胞菌Pseudomonas syringae，古月萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora,首猜黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae，青枯雷尔氏菌 Ralstoniasolanacearum，燕麦嗜酸菌西瓜亚禾中 Acidovorax avenae subsp. citrulli，金黄
Staphylococcus aureaus0因此，本发明菌株对苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能够用于生物防 治苜蓿根腐病及其它多种植物病害，在生物防治病害领域具有广阔的应用前景。本发明 为苜蓿根腐病的生物防治奠定基础，进而为该病生防放线菌制剂的研制与应用提供科学依 据。本发明属植物病害生物防治技术领域。本发明将离体筛选模型(平板抑菌实验 法、孢子萌发法)与活体筛选模型(温室盆栽活体抑菌试验)相结合，建立了一套结果可靠 的抗放线菌的筛选方法。本发明方法包括平板抑菌法初筛活性菌株步骤、孢子萌发法复筛活性菌株步骤，及室内盆栽活体试验验证步骤。首先采用平板抑菌法初筛出对靶标菌(苜 蓿根腐病菌)抑菌效果较强的活性放线菌菌株；其次用孢子萌发法复筛经初筛入选的活性 放线菌菌株，筛出对靶标菌孢子萌发抑制率> 80%以上的活性放线菌菌株；将孢子萌发法 筛选得到的活性放线菌菌株进行发酵培养，将活性菌株的发酵液接种于灭菌育苗土壤，在 盆栽供试苜蓿植株接种靶标菌(苜蓿根腐病菌)进行活体活性验证，采用温室活体防效试 验筛选出防治效果好的抗苜蓿根腐病的放线菌。本方法筛选出的具有较好抗苜蓿根腐病活 性的放线菌菌株，入选菌株在抗离体及活体筛选模型上均具有高拮抗活性，为进一步探讨 拮抗放线菌活性物质的分离、提纯与应用提供了可靠结果。实验证明，通过本发明的方法， 筛选到了一批具有较好抗活性的放线菌菌株，入选菌株在离体及活体模型上均具有较好活 性，为追踪分离活性化合物提供了可靠结果。本方法结果可靠、还具有操作简便、能快速有 效地筛选出防治苜蓿根腐病的放线菌等优点。


图1为菌株NMG6-3-9气生菌丝形态(光学显微镜下200 X)。图2为菌株NMG6-3-9孢子形态(扫描电镜下10000X)。图3为菌株NMG6-3-9孢子丝形态(扫描电镜下10000X)。图4为依据16S rDNA基因序列构建的菌株NMG6-3-9的系统发育树。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、菌株的分离与鉴定一、分离高氏1号培养基琼脂15g、可溶性淀粉20g、NaCl 0. 5g、KN03 lg、 K2HP04 3H200. 5g、MgS04 7H20 0. 5g、FeS04 7H20 0. Olg、蒸溜水 lOOOmL，pH7. 2-7. 4。PDA琼脂培养基马铃薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸馏水lOOOmL、pH
值自然。苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)；(曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地 区苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23 (6) 105-107.)(一 )从土壤中分离得到放线菌纯培养物采用稀释平板分离法从采自内蒙古鄂尔多斯市境内毛乌素沙地土壤样品中分离 菌株。采集土壤，将采集的土样经自然风干，过筛，称重。采用琼脂平板稀释法获得土壤 中主要放线菌类群。具体方法将预处理的土壤样品用无菌水稀释成KTuoIUOAKT4、 10_5、10_6倍的悬浮液，置200r/min摇床振荡5min，取0. 2mL上清液，用三角玻棒在制好在高 氏1号琼脂平板上涂抹均勻。置于28°C恒温培养箱中培养7-10d。观察菌落生长情况，挑 取平皿中占优势的菌落于试管中纯化，将纯化的单菌落转接到高氏一号斜面上培养后，编 号保存，共计得到294株纯培养放线菌。( 二)平板抑菌法初筛活性菌株
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苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)的培养方法将苜蓿茄镰孢菌(F. solani)接种 于PDA培养基，于28°C恒温培养箱中培养5-6d，得到苜蓿茄镰孢菌菌饼。将分离到的294株放线菌分别接种于高氏1号琼脂平板上于28°C下培养5d，待 长好后用打孔器将菌苔打成直径5mm的菌饼，并将放线菌菌饼置于PDA平板中心，使带有 菌丝的一面贴在培养基表面，3d后在距中心2. 5cm均勻反贴同样大小4块苜蓿茄镰孢菌 (F. solani)菌饼，对峙接于放线菌周边，每个菌株重复5次，25V下培养，观察是否产生抑 菌(溶菌)圈，定期观察、测量抑菌(溶菌)圈的直径。采用十字交叉法测量抑菌(溶菌) 圈的直径。根据直径大小决定菌株的取舍。放线菌的拮抗性强度体现在其产生的抑菌(溶 菌)圈的直径大小。放线菌的拮抗性强度统计标准R为拮抗圈直径，分以下4个等级分类10mm < R彡20mm (拮抗性极强)，5mm < R彡10mm (拮抗性较强)，0mm < R彡5mm(拮抗性弱) 和R = 0(无拮抗性)。在以上标准下，选取拮抗性极强、较强的放线菌进行后续筛选。拮抗性即为放线菌对苜蓿根腐病菌的抗性。结果表明，此步骤中从294株菌中共筛选得到8株符合拮抗性要求的放线菌菌株， 其中3株为拮抗性极强，5株为拮抗性较强。上述平板抑菌实验法初筛活性菌株采用常规的平板对峙法、牛津杯法、管碟法、挖 块法、琼脂块法或滤纸片法等均可。(三)孢子萌发法复筛活性菌株1.苜蓿根腐病菌孢子悬浮液的制备PDA培养基马铃薯200g、葡萄糖(或蔗糖)10 20g、琼脂17 20g、蒸馏水 1000mL, pH7. 0。将苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)接种于PDA培养基，于28°C恒温培养箱中培 养5-6d，待菌丝长满培养基后用无菌水洗去气生菌丝，400nto日光灯照射下培养产孢，待 2-3d产孢后，用无菌水洗下孢子，经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝并加入0. 02% Tween-20 制成孢子悬浮液在4°C下保存备用，孢子悬浮液中孢子浓度为106cfu/mL。2.拮抗放线菌的制备(1)放线菌菌株的制备本实验中所用菌株为实验二中得到的8株菌。斜面培养基高氏1号合成培养基。琼脂15g，可溶性淀粉20g，NaCl 0. 5g，KN03lg， K2HP04 3H20 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H20 0. 01g，蒸溜水 lOOOmL, pH7. 3。种子培养基酵母膏4g、葡萄糖10g、蛋白胨3g、牛肉膏3g、CaC03 4g、蒸馏水 lOOOmL, pH7. 2-7. 4。发酵培养基葡萄糖5g、甘油5g、可溶性淀粉5g、蛋白胨5g、酵母膏5g、黄豆粉5g、 KH2P04 0. 5g、CaC03 0. 5g、NaCl 0. 5g、MgS04 0. 5g，蒸馏水 lOOOmL, pH7. 0-7. 2。可溶性淀 粉购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司，产品目录号为HX169 ；蛋白胨购自内蒙古鸿之惠商贸 有限公司，产品目录号为SH0010;酵母膏购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司，产品目录号为 SH0348 ；黄豆粉购自超市。1)斜面培养分别将菌株接种于高氏1号斜面上，在28°C培养5-6d ；2)种子培养从生长好的放线菌斜面接种于100mL种子培养基中，220r/min、28°C
11振荡培养48h，得到种子培养液；3)发酵培养按10% (v/v)的接种量将种子培养液接种于100mL发酵培养基中， 220r/min、28°C振荡培养120h，得到含有放线菌菌株的发酵液。3.拮抗放线菌的筛选将上述方法2中制得的发酵液，与上述方法1中制得的孢子悬浮液等体积混合，取 一滴上述混合液滴加在表面用火棉胶处理过的盖玻片上，每处理5个重复。在25°C下保湿 培养6h后检查空白对照孢子的萌发，当空白对照孢子的萌发率达到85%后，检查所有处理 的苜蓿根腐病菌孢子萌发率(以孢子芽管长度大于孢子长度一半者为萌发)。空白对照组 以无菌水与上述方法1中制得的孢子悬浮液等体积混合配制获得。试验重复5次。按以下公式计算孢子萌发抑制率
孢子萌发抑制率(%)=对照孢子子萌发率纏
对照孢子明发率实验二中获得的8株拮抗放线菌与苜蓿根腐病菌的处理中，苜蓿根腐病菌孢子萌 发抑制率依次为 33. 85%,49. 46%,62. 72%,68. 98%,76. 45%,81. 36%,84. 60%,100% ； 选取孢子萌发抑制率大于80%的菌株进行如下实验四，共3株。(四)温室盆栽活体试验本实验对步骤三中筛选得到的3株菌进行进一步的筛选。(1)放线菌悬浮液制备将步骤三得到的4株放线菌菌株分别在发酵培养基中振 荡培养7d，制成浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液。(2)靶标菌孢子悬浮液的制备将指示菌株(F. solani)用燕麦片培养基于28°C恒 温培养箱中培养5-6d，待菌丝长满培养基后，交替培养(黑暗-光照)7d，产生大量的分生 孢子，用无菌水洗下孢子，经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝，加入0. 02% Tween-20制成浓 度为106cfu/mL的孢子悬浮液。燕麦片培养基燕麦片30g，琼脂17_20g，蒸馏水1000mL(燕麦片30g加蒸馏水 lOOOmL，在沸水浴上加热lh，纱布过滤后加水补足lOOOmL，加琼脂熔化后分装，121°C灭菌 20min)。(3)温室盆栽防效试验苜蓿(中苜1号)种子由国家种质牧草中期库提供，产品目录号为00068。将苜蓿(中苜1号)种子进行消毒处理，用0. 的新洁尔灭表面消毒3min，蒸馏 水冲洗3次，在25-28°C培养箱内催芽，待种子露白时点播种。育苗土壤先经121°C下高压 灭菌2h，而后用放线菌孢子悬浮液拌勻，土壤中放线菌的接种量为108cfu/g。出苗30d后 以靶标菌孢子悬浮液进行伤根接菌，接种量为106cfu/g，以清水为对照1 (CK1)，培养放线菌 所用的发酵培养基为对照2 (CK2)，每处理重复10次。接种靶标菌45d后检查苜蓿苗发病 情况，计算病情指数和防治率。通过防效分析，从复筛出的高活性菌株中筛选出室内防治率 彡75%的抗活性菌株。病情分级标准0级-健株，表观无症状；1级-根茎或主根局部有病斑，但不连片；
2级_主根、侧根及根茎部有病斑且连片，但不超过1/3 ；3级-1/3 /2根茎及根部被侵染变色，侧根多被侵染变色，且侧根明显减少；4 级_根茎及根部变色，局部腐烂，维管束明显变褐，植株生长受抑制且矮小枯黄；5级-根部 腐烂，维管束变黑且植株萎蔫死亡。

发病率、病情指数和防治效果的计算公式
发病率(％)=发i^f xioo% 总株数
病情指数数级代_值)X1Q0% (植株总数X最高代表级值)iUU/°
防治率=(1一xioo% (对照病情指数是指水对照)
对照病情指数
当计算出的防治效果(％ ) ^ 75%时，可认为该菌株发酵液供试样品具有较好的 抗苜蓿根腐病活性，该菌株即为目的菌株。结果，获得1株对苜蓿根腐病防治效果大于75%的拮抗放线菌菌株，将该菌株命 名为 NMG6-3-9。二、鉴定(一 )形态特征观察将待鉴定的菌株作插片培养，进行形态特征观察。将所观察到的气生菌丝形态进 行光学显微照相，对孢子丝进行扫描电子显微镜照相。菌株NMG6-3-9菌落呈灰色绒粉状，经插片培养观察NMG6_3_9的菌丝较长，气生 菌丝多分枝，螺旋形(图1)。孢子圆形、椭圆形或长柱形，孢子丝直、柔曲或呈松敞螺旋形， 其扫描电镜照片如图2、图3所示。( 二)培养特征观察将待鉴定的菌株，分别接种在高氏一号、察氏、葡萄糖-天冬素、克氏一号、马铃薯 浸汁、葡萄糖酵母膏琼脂斜面上及马铃薯块培养基上，置于28°C培养，观察其培养特征和颜 色变化。取稳定成熟的颜色特征作为其培养特征，作为鉴定种的依据。观察记载气生菌丝 的颜色、基质丝体的颜色和可溶性色素的颜色。结果记入鉴定表。此外，尚应观察菌株的生 长状况，如生长好坏，气生菌丝呈现何等外貌-绒状、粉状或絮状等作为参考特征。菌株NMG6-3-9在大多数培养基上生长良好，该菌在不同的培养基上的培养性状 特征如下表1 ；另外该菌除在察氏琼脂培养基上会产生可溶性色素外，在其他几种供试培 养基上都不产生色素。表1菌株NMG6-3-9的培养特征 注以最后一次观察结果为准。(三)生理生化特性测定明胶液化能力测定将菌株接种于柱形明胶培养基表面，28°C下培养，分别在5、 10、20、及30d，各观察一次液化程度。观察前应将菌种管冷冻20 30min。如明胶不液化 仍是固体状态，若呈现液体即为液化。牛奶凝固与胨化测定将待测定菌株接种于脱脂牛奶中，28°C培养，分别在第3、 6、10、20、及30d各观察一次。淀粉水解测定将培养基熔化后，冷却至50°C倒成平板，凝固后将菌种点种于平 板上，适温培养2 4d，形成菌苔后在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为宜，平板 呈蓝色，而菌落周围有无透明圈出现说明淀粉是否被水解，透明圈的大小能够说明水解淀 粉能力的大小。纤维素水解试验配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液，分装试管 后，以新华一号滤纸作纤维素(碳源)，把它切成宽1cm、长6cm滤纸条，加入试管中，一半浸 在液内，一半露在液外，将鉴定菌株接种在液外一段滤纸条上，置28 °C培养30d后观察。若 该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维，或使之折断，碎裂成质状者为阳性，说明该菌株产 生纤维素酶使之水解。反之，滤纸无变化者为阴性。硫化氢产生试验将待测菌株接种到含柠檬酸铁的有机斜面上，置28°C培养10d 左右(视菌苔生长成熟为宜)观察结果。若培养基中出现黑褐色沉淀，表示实验为阳性。反 之，不变色者为阴性。碳源利用试验将待鉴定菌株的孢子悬浮液1 2滴，接种在无碳源培养基上，用 无菌涂布棒涂布均勻，然后划线挖沟，以沟为界，把平板培养基分成若干小区，每小区分别 加入一种碳源。常用的碳源有9种阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、果糖、蔗糖、山梨糖、甘 露醇和肌醇等。每皿需设无糖对照区。置28°C培养7、14d后，分别观察记载生长利用情况。研究结果见表2 菌株NMG6-3-9能液化明胶，不能使牛奶凝固，也不能使其胨化， 淀粉水解较弱，不利用纤维素，硝酸盐还原，不产生酪氨酸酶、H2S。除对葡萄糖和肌醇利用 较差外，对阿拉伯糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、木糖、甘露醇和半乳糖都能很好的利用。表2菌株NMG6-3-9的生理生化特征 注“_”表示未反应，“ + ”、“++”、“+++”分别表示反应的强弱。(四)细胞壁化学组分的鉴定纸层析法细胞壁氨基酸分析根据G+细菌细胞壁肽聚糖分子中第3位氨基酸的种 类，将放线菌划分为九个类群(见表3)。表3放线菌细胞壁的主要类型 注LL-DAP 外消旋二氨基酸基庚二酸；meso-DAP 内消旋二氨基庚二酸；DAB :1， 4_ 二羟基丁酸。主要步骤为
(1)菌体制备刮取培养好的菌株放入1. 5mL的离心管中；(2)菌体水解在用于全细胞氨基酸分析的菌体中加入6mol/L的HC1 100 u L，放 入灭菌锅中120°C，15min ；(3)点样取4 y L用于氨基酸分析的水解液于新华1号滤纸上点样，再分别取标 准氨基酸样品二氨基庚二酸DAP (含有LL-DAP，Meso-DAP和DD-DAP)、赖氨酸、鸟氨酸、天冬 氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸各1 P L依次在滤纸上间隔点样。(4)展层用于全细胞氨基酸水解液分析的展层系统为甲醇水HC1(6N)吡 啶=16 5. 2 0. 8 2，展层 2 次；(5)显色氨基酸分析用0.4%茚三酮丙酮溶液，100 110°C加热2 3min，观察。纸层析法细胞壁糖分分析根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型， 将放线菌划分为四个糖型(见表4)。表4放线菌全细胞的主要糖型
15 主要步骤为(1)菌体制备刮取培养好的菌株放入1. 5mL的离心管中；(2)菌体水解菌体中加入0. 25mol/L的HC1 100 ii L，放入灭菌锅中120°C， 15min ；(3)点样取4 y L用于氨基酸分析的水解液于新华1号滤纸上点样，再分别取标 准糖样品木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、核糖各1PL依次在滤纸上间 隔点样。(4)展层用于全细胞氨基酸水解液分析的展层系统为正丁醇水吡啶甲醇 =10 6 6 1，展层 2 次；(5)显色显色剂邻苯二甲酸苯胺水饱和的正丁醇(3. 25 2 100)，120°C 加热3min。对菌株NMG6-3-9进行纸层析法细胞壁氨基酸分析，结果如表5 表5菌株NMG6-3-9全细胞氨基酸分析结果 注“_”表示未反应，“ + ”表示反应。对菌株NMG6-3-9进行纸层层析法细胞壁糖分分析，结果如表6 表6菌株NMG6-3-9的全细胞壁糖分 注“-”表示未反应，“ + ”表示反应。综合表5、表6结果可知菌株NMG6-3-9细胞壁中含有氨基酸的种类为 LL-DAP(LL-二氨基庚二酸)、甘氨酸(GLY)和谷氨酸(GLU)，对照文中表3可知该菌株细胞 壁属于I型；细胞壁中除含有葡萄糖外不含有表4中其它糖的种类，无特征性糖，该菌株糖 型为C型，符合链霉菌Str印tomyces的化学分类特性。(五)rDNA序列分析DNA膜板的制备DNA 提取纯化后的生防放线菌株NMG6-3-9接种于高氏一号培养皿中，28°C培养至生长中 期，备用。提取的主要步骤如下(1)皿内刮取少量菌体，加60 iiL 2XCATB缓冲液，冰浴研钵中研磨至浆液，移入1.5mL离心管中(每菌做3管)。(2)加500 u L溶菌酶处理液(溶菌酶2mg/mL, RNase溶液50 u g/mL,蔗糖0. 3M， Tris-HCl 1M, pH8. 0)置于 37°C保温 2h。(3)加入250 ii L 20% SDS溶液，震荡混合。(4)55°C 保温 60min。(5)加等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)充分摇勻，4°C Tris-HCl 1M， pH8. 0 下离心(8000rpm, 5min)。(6)取上清液移至另一离心管中，加10% NaAC液，2. 5倍体积冰冻乙醇沉淀。(7)4°C离心(10，000rpm，5min)，弃上清液。(8)重复步骤(5) (7) 1次。(9)用70%乙醇洗2 3次，晾干，加TE缓冲液60 u L，充分溶解后取3 u L检测 并-20°C下保存。PCR 扩增 16S rDNA (l)PCR 仪型号:ALD_1244、rev、C. B(2)扩增弓| 物16S rDNA通用引物(50 y M)正向Pf■为 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(对应于 E. coli8 27 位碱基)，反向 Pr 为 5，-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，(对应于 E. colil492 1514 位碱基)，由中科院微生物 所基因工程中心合成。(3)扩增体系表716S rDNA PCR 扩增体系.- 注25iiL体系PCR扩增参数及程序按扩增体系(表7)依次加入各组分，瞬时离心混勻，加入Taq酶后瞬时离心混勻。 95°C预变性5min，进入循环:94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸2min。35个循环后， 72°C延伸lOmin。扩增产物_20°C储存。PCR扩增产物的电泳检查电泳条件为0.8%的琼脂糖凝胶(含EB 0. 5u g/mL)，1 X TAE电泳缓冲液，80V电 压电泳40min，PCR产物上样量为4 y L，与2 y L上样缓冲液混勻后点样。在254nm紫外下观察结果，以TaKaRa公司DNA Marker [DL2000]为核酸标准分子 量参照物，确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物1500bp左右位置上。16S rDNA PCR产物全序列测定
PCR产物的纯化与序列测定由上海英骏生物技术有限公司进行。测序时以扩增引 物作为正反向引物，由上海英骏生物技术有限公司用计算机引物设计软件，根据所测出的 样品的序列搜索设计出中间弓丨物并合成。系统进化树的构建将所测的16S rDNA序列与GenBank基因库中已测定的原核生物的16S rDNA序列 进行比较，调出与其序列同源性较高的菌株的16S rDNA序列。采用CLUSTAL X 1.8软件对 所测定的同源序列进行多匹配排列，通过Treeview软件进行系统进化树的构建。与菌株 NMG6-3-9序列同源性较高的菌株见表8。进一步采用分子生物学技术手段对菌株NMG6-3-9 进行分子鉴定，经16S rDNA基因测序分析，共测定1433个有效碱基，如序列表1所示，构建 的系统进化树如图4所示。与菌株NMG6-3-9序列同源性较高的菌株见表8。由表8可以看出，与供试菌株相 似性达99%均为链霉菌属的菌株，可得知菌株NMG6-3-9属于链霉菌属。通过16SrDNA序 列分析发现，菌株NMG6-3-9与灰黄链霉菌S. griseoflavus亲缘关系比较近，同源性达到了 99. 90%，且同在系统进化树一个单独的分支上。表8构建系统发育树所用的Str印tomyces 16S rDNA GenBanK登陆号 综上，由形态特征、培养特征、生理生化特性和细胞壁成分分析，并 结合分子生物学鉴定结果，最后将菌株NMG6-3-9定为链霉菌属灰黄链霉菌 (Streptomycesgriseoflavus)0该菌株已于2009年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3441。该菌株的分类命名为灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)，菌株名称为 NMG6-3-9。四、菌株NMG6-3-9的培养斜面培养基高氏1号合成培养基。琼脂15g，可溶性淀粉20g，NaCl 0. 5g，KN03lg， K2HP04 3H20 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H20 0. 01g，蒸溜水 lOOOmL, pH7. 3。种子培养基酵母膏4g、葡萄糖10g、蛋白胨3g、牛肉膏3g、CaC03 4g、蒸馏水 lOOOmL, pH7. 2-7. 4。发酵培养基葡萄糖5g、甘油5g、可溶性淀粉5g、蛋白胨5g、酵母膏5g、黄豆粉5g、 KH2P04 0. 5g、CaC03 0. 5g、NaCl 0. 5g、MgS04 0. 5g，蒸馏水 lOOOmL, pH7. 0-7. 2。
可溶性淀粉购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司，产品目录号为HX169 ；蛋白胨购自 内蒙古鸿之惠商贸有限公司，产品目录号为SH0010 ；酵母膏购自内蒙古鸿之惠商贸有限公 司，产品目录号为SH0348 ；黄豆粉购自超市。1)斜面培养将菌株NMG6-3-9接种于高氏1号斜面上，在28°C培养5_6d ；2)种子培养从生长好的放线菌斜面接种于100mL种子培养基中，220r/min、28°C 振荡培养48h，得到种子培养液；3)发酵培养按10% (v/v)的接种量将种子培养液接种于lOOmL发酵培养基中， 220r/min、28°C振荡培养120h，得到发酵液。实施例2、菌株NMG6-3-9的应用一、菌株NMG6-3-9的抗菌谱测定PDA琼脂培养基马铃薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸馏水1000mL、pH自然。将放线菌菌株NMG6-3-9接种于高氏1号琼脂平板上于28°C下培养5d，得到菌苔； 用打孔器将菌苔打成直径5mm的菌饼，并将菌饼置于PDA平板中央，使带有菌丝的一面贴 在培养基表面，30°C下培养3d，然后将同样大小靶标菌菌饼对峙接于菌株NMG6-3-9四周， 28°C下培养，至靶标菌长满培养皿为止。采用十字交叉法测量抑菌(溶菌)圈的直径。上述平板抑菌实验采用常规的平板对峙法、牛津杯法、管碟法、挖块法、琼脂块法 或滤纸片法等均可。每种靶标菌重复3次，结果取平均值。结果表明，菌株NMG6-3-9对20种不同类型的植物病原真菌都有不同程度的抑制 作用(表9)，并且该菌株对6种细菌也有一定的抑制效果(表10)。证明菌株NMG6-3-9的 抑菌谱较广，且对不同种类病原菌具有选择性。表9菌株NMG6-3-9对20种植物病原真菌的抑菌效果 表10菌株NMG6-3-9对6种细菌的抑菌效果 表9和10中的下述菌株均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(简称ACCC) 燕麦镰孢菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065、立枯丝核菌 Rhizoctonia so 1 aniACCC 30332、禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068、半裸镰刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945、香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense ACCC 36369、 瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum ACCC 36125、瓜类壳二抱 Ascochyta citrullina ACCC 36440、大丽轮枝孢 Verticillium dahliaACCC 36109、禾顶囊壳 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310、禾弯孢霉菌 Curvularia lunata ACCC 36580、辣椒疫霉菌Phytophthora capsiciACCC 36279> MM^M Botrytis cinerea ACCC 30091、胃 Sclerotiniasclerotiorum ACCC 30096、粉红聚端抱 Trichothecium roseum ACCC36459、 胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora ACCC 01443、青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。苜蓿壳针孢S印toria medicaginis (侯天爵.我国北方草地病害调查及主要病害 防治[J].中国草地，1993，3:56-60.)(中国农业科学院草原研究所)胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides (刘正坪，胡俊，高翔，等.枸杞炭 疽病菌生物学特性研究[J].北京农学院学报，2005，20 (3) :36-39.)(中国农业科学院草原 研究所)大斑突脐孢Exserohilummleonard turcicum(周洪友，刘正坪，胡俊，等.苏丹草 大斑病菌的生物学特性研究[J].华北农学报，2009，24(1) :174-177.)(中国农业科学院草 原研究所)丁香假单胞菌Pseudomonas syringae (侯天爵.我国北方草地病害调查及主要病 害防治[J].中国草地，1993，3:56-60.)(中国农业科学院草原研究所)苜蓿黄单胞杆菌XMithomoriEis campestris pv. alfalfae (侯天爵.我国苜蓿病害 发生现状及防治对策[J].内蒙古草业，1994，3 4-8.)(中国农业科学院草原研究所)燕麦嗜酸菌西瓜亚种Acidovorax avenae subsp. Citrulli (胡俊，黄俊霞，刘双 平，等.不同哈密瓜品种对细菌性果斑病抗病性及发展动态的研究[J].华北农学报，2006， 21 (6) 107-110.)(中国农业科学院草原研究所)苜蓿茄镰孢菌Fusarium solani (曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地区苜 蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23 (6) :105-107.)(中国农业科学院草 原研究所)苜蓿尖镰孢菌Fusarium oxysporum(曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地 区苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23 (6) 105-107.)(中国农业科学 院草原研究所)苜蓿匍柄霉Stemphylium botryosum(侯天爵.我国北方草地病害调查及主要病 害防治[J].中国草地，1993，3:56-60.)(中国农业科学院草原研究所)二、对靶标菌孢子的萌发抑制1.苜蓿根腐病菌孢子悬浮液的制备PDA培养基马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水lOOOmL，pH7. 0。将苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)接种于PDA培养基，于28°C恒温培养箱中培 养5-6d，待菌丝长满培养基后用无菌水洗去气生菌丝，400nto日光灯照射下培养产孢，待 2-3d产孢后，用无菌水洗下孢子，经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝并加入0. 02% Tween-20 制成孢子悬浮液在4°C下保存备用，浓度为106cfu/ml。2.拮抗放线菌的制备(1)菌株发酵液的制备将菌株NMG6-3-9接入发酵培养基，28°C下振荡培养4-5d，将发酵液离心取上清 液，将上清液过滤，收集滤液，将滤液记作菌株NMG6-3-9发酵滤液，菌株NMG6-3-9发酵滤液
21中的孢子浓度为108cfu/mL。3.拮抗放线菌的筛选将发酵滤液与上述实验1中制得的孢子悬浮液等体积混合，取一滴上述混合液 滴加在表面用火棉胶处理过的盖玻片上，每处理5个重复。在25°C下保湿培养6h后检 查空白对照中苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)孢子的萌发，当空白对照中苜蓿茄镰孢 菌(Fusarium solani)孢子的萌发率达到85%后，检查所有处理苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)的孢子萌发率(以孢子芽管长度大于孢子长度一半者为萌发)。试验重复5次。按以下公式计算孢子萌发抑制率
孢子萌发抑制率(Q/0) 二对照孢子子萌发率x 100%
对照孢子明发率空白对照组方法方法与实验组一致，只是将发酵液替换为无菌水。实验设3次重复。结果对照组，有85 %的孢子萌发，形成细长且均勻的菌丝；实验组菌株 NMG6-3-9对孢子萌发抑制率达100%，并且使孢子萌发速率降低，并使分生孢子细胞及其 萌发出的芽管畸形，进而可以降低其侵染寄主的能力。三、菌株NMG6-3-9对植物病害的生物防治采用室内苗期灌根接种法对NMG6-3-9进行防治苜蓿根腐病试验。苜蓿根腐病是 由苜蓿茄镰孢菌Fusarium solani引起的。苜蓿茄镰孢菌Fusarium solani (曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地区苜 蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23 (6) :105-107.)(中国农业科学院草 原研究所)。苜蓿(中苜1号)种子购自国家种质牧草中期库，产品目录号为00068。井岗 霉素购自农资商店；Czapek，s 培养液(蔗糖 30g、NaN03 2g、KC1 0. 5g、K2HP04 3H20 lg、 MgS04 7H20 0. 5g、FeS04 7H20 0. 01g、蒸馏水 lOOOmL, pH 自然。靶标菌孢子悬液的制备将病原菌用Czapek’ s培养液28°C，120r/min摇瓶培 养96h，得到病原菌的孢子悬液，用血球计数板计算孢子悬液浓度，孢子悬液中孢子浓度为 106cfu/mLo菌株NMG6-3-9发酵滤液的制备将菌株NMG6-3-9接入发酵培养基，28°C下振荡培 养4-5d，将发酵液离心取上清液，将上清液过滤，收集滤液，将滤液记作菌株NMG6-3-9发酵 滤液，菌株NMG6-3-9发酵滤液中的孢子浓度为108cfu/mL。供试土样自然土灭菌后待用。灭菌后的土壤分装于不同的育苗杯中(高15cm， 直径8cm)，每杯装入灭菌土 200g，放在边缘较高的搪瓷盘内。播种前两天沿盆边缘充分浇 水，使其自然吸水。苗期管理苜蓿种子用0. 新洁尔灭消毒3min，用清水冲洗干净，放入28-30°C 温箱中，待其露白后或芽长0. 5cm时播种。在人工气候室内育苗，白天温度保持在24-26°C， 夜间15-18°C，土壤湿度保持在60% -80%。接种方法待苜蓿幼苗生长30d后(将播种当天记作第0天)，将菌株NMG6-3-9的 发酵滤液(108cfu/mL)灌于幼苗根部，每株10mL ；3d后同样将病原菌悬液(106cfu/mL)灌根接种，每株10m]+。以5％井冈霉素水剂(浓度为50 u g／mL)灌根处理的植株为农药对照、以发酵培养基及清水灌根处理的植株作为空白对照。每20个育苗杯为一处理，每杯4株，每处理3次重复。定期调查发病情况，45d后统计病情指数及相对防治效果。病害分级参照如下标准进行
病情分级标准
o级一健株，表观无症状；
l级一根茎或主根局部有病斑，但不连片；
2级一主根、侧根及根茎部有病斑且连片，但不超过l／3；
3级一l／3一l／2根及根茎部被侵染变色，且侧根明显减少；
4级一根及根茎部变色、局部腐烂，维管束明显变褐，植株生长受抑制且矮小枯黄；
5级一根部腐烂、维管束变黑且植株萎蔫死亡。
发病率‘％，’醫×100％
熊撇驾>--器鸚器×100
防治效果‘％， ‘工一等驪，x lOO％‘对照指清水对照，
上述计算公式中对照均指清水。
各级代表级值为o、l、2、3、4、5，最高代表级值为5。
试验结果(表11)表明，供试拮抗菌I'xN(；6—3—9的发酵液可以降低苜蓿根腐病的发病率和病情指数，病情指数为16．35，相对防效达81．50％，高于CK3(5％井岗霉素水剂)的处理防效60．78％。另外从表中结果可以看出CK2(发酵培养基)的病情指数虽然比清水对照的低，但是差异很小，其对植株的发病虽有影响却不是防病的主要因素，防病的主要因素为拮抗菌k~Vl(-；6—3—9的代谢产物。在盆栽试验中，拮抗菌能够有效减轻病情，显示出较为理想的应用潜力。
表11拮抗菌I'xN(；6—3—9对苜蓿根腐病的盆栽防病效果
权利要求
灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)NMG6-3-9，其保藏编号为CGMCC No.3441。
2.菌的拮抗剂，其活性成分为灰黄链霉菌(Sti^ptomycesgriseof lavus) NMG6-3-9CGMCC No. 3441 ；所述菌为苜猜前镰孢菌Fusarium solani、苜猜尖镰孢菌Fusarium oxysporum、燕麦镰 抱菌Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、禾谷德抱菌 Peronospora aestivalis、半裸德刀菌 Fusariumsemitectum、香 蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、 苜猜壳针孢Septoria medicaginis、瓜类壳二孢Ascochytacitrullina、大丽轮枝孢 Verticillium dahlia、禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis、胶抱炭疽菌 Coiletotrichum gloeosporioides、胃 包 β 胃 Curvularia lunata、大■突 M 包 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉红聚端抱 Trichothecium roseum、丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae、古月萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora、 苜猜黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum、禾口 / 或燕麦嗜酸菌西瓜亚禾中 Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口 / 或金 胃求胃 Staphylococcusaureausο
3.根据权利要求2所述的拮抗剂，其特征在于所述燕麦镰孢菌Fusariumavenaceum 为燕麦镰孢菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065，所述立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 为立枯丝核菌Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷镰孢菌Peronospora aestivalis 为禾谷镰孢菌Peronospora aestivalis ACCC30068，所述半裸镰刀菌Fusarium semitectum 为半裸,廉刀菌 Fusarium semitectumACCC 31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 为香蕉枯萎菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense ACCC 36369， 所述瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum 为瓜果腐霉 Pythium aphani derma turn ACCC 36125，所述瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina 为瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大丽轮枝孢 Verticillium dahlia 为大丽轮枝孢 Verticillium dahlia ACCC36109，所述禾丁页囊壳Gaeumannomyces graminis 为禾丁页囊壳Gaeumannomycesgraminis ACCC 30310，所述禾弯孢霉菌 Curvularia Iunata 为禾弯孢霉菌 Curvularia lunata ACCC 36580，所述辣椒疫霉菌Phytophthora capsici 为辣椒疫霉菌Phytophthora capsici ACCC 36279, fff^MM^^ Botrytis cinereaBotrytis cinerea ACCC 30091, 所述核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 为核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC 30096，所述粉红聚端孢 Trichotheciumroseum 为粉红聚端孢 Trichothecium roseum ACCC 36459，所述胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora为胡萝卜 软腐欧文氏菌Erwiniacarotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷尔氏菌 Ralstoniasolanacearum 为青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470，所述金 黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus 为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureausACCC 01336ο
4.灰黄链霉菌(Str印 tomyces griseof lavus) NMG6-3-9 CGMCC No. 3441 在制备如下菌 中至少一种菌的拮抗剂中的应用苜猜前镰孢菌Fusarium solani、苜猜尖镰孢菌Fusarium oxysporum、燕麦镰孢菌 Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、禾谷德抱菌 Peronospora aestivalis、半裸德刀菌 Fusariumsemitectum、香 蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果腐霉 Bythiumaphanidermatum、 苜猜壳针孢Septoria medicaginis、瓜类壳二孢Ascochytacitrullina、大丽轮枝孢 Verticillium dahlia、禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis、胶抱炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、胃 包 β 胃 Curvularia lunata、大■突 M 包 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉红聚端抱 Trichothecium roseum、丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae、古月萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora、 苜猜黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum、禾口 / 或燕麦嗜酸菌西瓜亚禾中 Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口 / 或金 胃求胃 Staphylococcusaureausο
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述燕麦镰孢菌Fusariumavenaceum为 燕麦镰孢菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065，所述立枯丝核菌 Rhizoctoniasolani 为 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis 为禾谷镰孢菌Peronospora aestivalis ACCC 30068，所述半裸镰刀菌Fusarium semi tectum 为半裸,廉刀菌 Fusarium semi tectum ACCC31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 为香蕉枯萎菌 Fusariumoxysporum f. sp. cubense ACCC 36369， 所述瓜果腐霉 Pythium aphani derma turn 为瓜果腐霉 Pythium aphani derma turn ACCC 36125，所述瓜类壳二孢Ascochytacitrullina为瓜类壳二孢Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大丽轮枝孢 Verticillium dahlia 为大丽轮枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109，所述禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis 为禾丁页囊壳 Gaeumannomyces graminis ACCC30310，所述禾弯孢霉菌 Curvularia Iunata 为禾弯孢霉菌 Curvularia IunataACCC 36580，所述辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 为辣椒疫霉菌 Phytophthoracapsici ACCC 36279, fff^MM^^ Botrytis cinerea ^MM ^ ^ Botrytiscinerea ACCC 30091, 所述核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 为核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC 30096，所述粉红聚端孢 Trichotheciumroseum 为粉红聚端孢 Trichothecium roseum ACCC 36459，所述胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora为胡萝卜软腐欧文氏菌Erwiniacarotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷尔氏菌 Ralstoniasolanacearum 为青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470，所述金 黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus 为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureausACCC 01336ο
6.—种筛选拮抗苜蓿根腐病的放线菌的方法，包括如下步骤1)从待分离样品中得到纯培养放线菌；2)用平板对峙法、抑菌圈法、牛津杯法、管碟法、挖块法、琼脂块法或滤纸片法，从步骤 1)中所述纯培养放线菌中筛选对靶标菌具有拮抗作用的放线菌菌株，得到拮抗靶标菌的放 线菌菌株；所述靶标菌为引起苜蓿根腐病的菌；3)用孢子萌发法，从步骤2)中所述拮抗靶标菌的放线菌菌株中筛选抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株，得到抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株；4)用温室盆栽活体法对步骤3)得到的放线菌菌株进行检测，得到拮抗苜蓿根腐病的 放线菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述温室盆栽活体法包括如下步骤a) 发酵培养所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株，得到含有所述抑制所述靶标菌孢子 萌发的放线菌菌株的发酵液，将所述含有所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的发 酵液接种于土壤中，得到土壤和所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的混合物；b) 将苜蓿种子接种于步骤a)中所述混合物中，培养；c)待所述苜蓿种子出苗30d后，用所述 靶标菌的孢子悬浮液进行伤根接菌，继续培养，检测防治率，防治率大于等于75%的放线菌 菌株即为拮抗苜蓿根腐病的放线菌。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步骤a)中，所述土壤和所述抑 制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的混合物中所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌 菌株的浓度为108cfu/g ；和/或，所述步骤c)中，所述伤根接菌的接种量为106cfu/g 土壤。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述步骤3)中 所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株为对所述靶标菌孢子的萌发抑制率大于等于 80%的放线菌菌株。
10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述靶标菌为苜蓿根腐病菌； 所述苜猜根腐病菌为苜猜爺镰孢菌Fusarium solani、苜猜尖镰孢菌Fusariumoxysporum 或燕麦镰孢菌Fusarium avenaceum ；所述待分离样品为土壤。
全文摘要
本发明公开了一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法。该菌株为灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)NMG6-3-9，其保藏编号为CGMCC No.3441。本发明菌株对苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能够用于生物防治苜蓿根腐病及其它多种植物病害，在生物防治病害领域具有广阔的应用前景。本发明为苜蓿根腐病的生物防治奠定基础，进而为该病生防放线菌制剂的研制与应用提供科学依据。
文档编号C12R1/465GK101851597SQ20101015592
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者刘星, 刘爱萍, 刘雅学, 周玉雷, 塔娜, 张礼生, 徐林波, 李薇, 李鹏, 狄彩霞, 王宁, 石雅琴, 荆瑞勇, 赵海霞, 闫丽英, 陈红印, 高书晶 申请人:中国农业科学院草原研究所