专利名称：一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码酶基因与应用。
背景技术：
从结构简单的病毒到结构复杂的人类，各种各样的蛋白酶抑制剂发挥着巨大的作 用。根据其蛋白结构及氨基酸序列的相似性，蛋白酶抑制剂一般被分为四种天冬氨酸类 蛋白酶抑制剂、半胱氨酸类蛋白酶抑制剂、非金属蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。其 中丝氨酸蛋白酶抑制剂是最重要，也是研究最为广泛的蛋白酶抑制剂之一。丝氨酸蛋白酶 抑制剂可以防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡，是维持生物体内环境 稳定的重要因素，存在于有些动物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂可能在脑缺血或兴奋毒性引 起的神经元死亡中起重要的作用，可能具有神经保护作用。另外在于某些动植物体内的丝 氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制其致病性微生物的蛋白酶活性，从而在针对外源侵染过程中发 挥主动防御能力。丝氨酸蛋白酶抑制剂一般为单一肽链蛋白质，丝氨酸蛋白酶抑制剂分 子一般由29-190个氨基酸组成，较多为400个左右。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列同 源性、二硫键的数目和三维结构，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为多个不同的超家族，如胰腺 胰蛋白酶抑制剂(英文名称=Kimitzinhibitor)家族、胰腺分泌类胰蛋白酶抑制剂(英文 名称=Kazal inhibitor)家族、链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(英文名称str印tomyces subtilisininhibitor)家族、Bowman-Brik型抑制剂家族，等。现在研究较多的是Kunitz型 氨酸蛋白酶抑制剂，该类抑制剂来源非常广泛，现在已经从猪胰脏、海葵、人尿、蛇、大豆、赤 小豆、天花粉、海芋、苦豆子、花生、太湖蓝藻等动植物中分离得到。其三维结构高度保守由 一个明显的疏水核心、三对高度保守的二硫键桥、三链β-折叠和一个C端α-螺旋组成， 该类抑制剂家族的研究以抑肽酶BPTI的研究为代表。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂是较为 保守的家族之一，其存在于鸟蛋、昆虫、小龙虾、哺乳动物组织和体液中，它们与血凝、纤维 蛋白溶解、胚胎发生、个体发育、炎症和免疫应答等有着密切关系。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑 制剂通常由一个或者多个重复保守的结构域组成，其结构域序列较为保守，并且其分子构 象高度保守。另外，许多Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂通常有一段信号肽，位于N末端，其 长度大约为20个氨基酸。Bowman-Brik型抑制剂首先由Bowman等于1944年利用丙酮为不 溶因子从大豆中分离出来的，分子量为6000-10000，含有大量的半胱氨酸。Bowman-Brik型 抑制剂是由71个氨基酸组成的单肽链，包含7个二硫键，BBI —般含有2个活性中心一个 是赖氨酸16-丝氨酸17 ；另一个是亮氨酸44-丝氨酸45，因此该类抑制剂可以同时抑制胰 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。在人类及高等动物中，许多丝氨酸蛋白酶存在于血液中，与凝血、纤溶有关。除存 在于血液中外，某些蛋白酶还存在与中枢神经系统，对于中枢神经系统的动态平衡起重要 作用。而相应的丝氨酸类蛋白酶抑制剂可以调节血液的凝集，并对于脑损伤及神经变性起 着极为重要的作用。在生物体中，丝氨酸蛋白酶的活性取决于其同源性丝氨酸蛋白酶抑制 剂(英文名称serpin inhibitor)的平衡。这些serpins作为其靶蛋白酶的假性底物与酶的反应部位紧密结合，在凝血、纤溶、炎症和免疫方面起着重要作用。例如serpins可通 过细胞外基质的蛋白溶解过程的调节，在神经迁移，轴突生长或成熟后突触连接的过程中 发挥重要作用。t-PA是存在与血液中的重要纤溶酶原激活剂，属于丝氨酸蛋白酶类，在脑和 胚胎发育中，与细胞移行、血管生成和组织在中枢神经系统的重塑有关，该酶的抑制剂I型 纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-I)可快速抑制该酶，从而在动物体内发挥重要作用。牛胰 蛋白酶抑制剂(英文名称Bovin印ancreatic trypsin inhibitor,BPTI)和人体中的淀粉 样 β-蛋白前体(英文名称Amyloid beta-protein precursor, APP)都属于 Kunitz 家族 的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们不仅抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶和纤溶酶，还同时抑制血浆激肽 释放酶等丝氨酸蛋白酶，在临床广泛用于手术后的止血及术后并发的炎症反应。另外BPTI 和APP对于因子XIa、，因子XIIa也有抑制作用，从而可以直接抑制外源性的凝血系统。目前主要利用物理、化学或者生物化学方法，从动植物及微生物体内收集材料例 如动物的血液以及植物的块根块茎等提取各类丝氨酸蛋白酶抑制剂。物理方法包括机械方 法和非机械方法，机械方法主要是通过机械切力破碎细胞，常用的有高速珠磨法和勻浆法， 非机械方法一般是通过物理方法破碎细胞，常用的有冻融法和超声波法。化学方法一般是 把样品置于低温下，加入合适的化学试剂搅拌破碎细胞膜，使蛋白释放出来。生物化学方法 主要依靠生物酶解蛋白，酶解法操作条件温和，专一性高，回收率高。根据动植物蛋白的不 同生理生化性质，也可采用水溶液提取方法或者有机溶剂提取方法来得到粗蛋白。众所周知，环境微生物是一个巨大的基因资源库。相关研究指出通过DNA-DNA杂 交技术和其他独立培养技术揭示了一份IOOg 土壤样品中微生物种类趋向于在4，000种到 13，000种之间，平均每500mg的泥土中就可以提取出数十微克的DNA，这其中包含了大量 的未知功能基因。相对于纯培养技术而言，利用宏基因组文库技术开发环境未培养微生物 资源，可以使得占微生物通量99%的不可培养微生物资源开发变成现实，它将微生物基因 的探索空间扩大了上百倍。宏基因组文库技术，就是以直接分离环境未培养微生物宏基因 组DNA，克隆目标DNA到合适的载体，然后导入宿主菌进而实现对目标克隆的筛选。当前， 科学家以E. coli或者Str印tomycin Iividans作为克隆宿主，构建了各种各样的文库如 plasmid libraries、cosmid libraries、BAC libraries、fosmid libraries 等，基于基因 功能表达和序列特异性的同源筛选等给人们带来了数量巨大的新型活性酶和各种生物活 性物质。因此，利用宏基因组文库技术，研究极端环境体系未培养微生物和克隆未培养微生 物酶基因，分离筛选各类丝氨酸蛋白酶抑制剂，在理论上及在实际应用中都具有特别重要 的意义。本发明通过构建来自于广西北部湾海洋环境沉积物宏基因组文库，采用酶的直接 测序筛选策略，从基因文库里面分离得到了编码新型丝氨酸蛋白酶抑制的基因，可在宿主 细胞中大量表达该基因以生产抑制蛋白，用于丝氨酸蛋白酶活性的抑制。在致病性微生物 中针对外源侵染过程中发挥主动防御作用等方面具有广泛的用途。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因及其应用。本发明所提供的一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因，名称为spilC，来源于广西 北部湾海洋沉积物未培养微生物，具有下列核苷酸序列之一1)序列表No. 1的DNA序列及其部分序列；
2)与序列表No. 1中No. 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的蛋白质。携带该基因的质粒，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia. coli)BL21(DE3) pLysS/pGXAG59G已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. 3317，保存日期为2009年10月10日。序列表No. 1的DNA是克隆载体pGEM_3Zf (+)部分DNA序列和克隆在载体上的外 源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由642个碱基组成，重组质粒所携带的外源DNA片 段中包含完整的新型spilC基因。GC含量为51.2%。从5’端第111个核苷酸开始起始密 码子ATG到755个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的0RF(核苷酸111-755)，自 5’端的第111-113位核苷酸为spilC基因的起始密码子ATG，自5’端的第753-755位核 苷酸为spiIC基因的终止密码子TAA。该ORF —共642个核苷酸可编码由214个氨基酸组 成的蛋白。通过Blastx分析该氨基酸序列和来自于Spirosoma linguale DSM 74的一个 "proteinase inhibitor I4serpin”存在 56%的相似性，42%的一致性。本发明提供的一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因的克隆方法包括下列步骤(1)从广西北部湾海洋环境样品中提取未培养微生物宏基因组DNA，构建海洋环 境宏基因组文库；(2)从海洋环境宏基因组文库中利用直接测序筛选策略分离丝氨酸蛋白酶抑制剂 的克隆。本发明通过构建环境宏基因组文库，利用直接测序筛选策略，得到了新的编码丝 氨酸蛋白酶抑制剂的基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产丝氨酸蛋白酶抑制剂， 从而对相关病原微生物的蛋白酶活性进行抑制。本发明所提供的新的丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码酶基因在致病性微生物中，针 对外源侵染过程发挥宿主细胞主动防御作用等方面具有广泛的用途。
图1为从广西北部湾海洋环境样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。图2为广西北部湾海洋环境宏基因文库克隆的限制性内切酶EcoRI酶切分析以判 断文库质量。图3为原始克隆PGXAG59的酶切检测结果。图4为spiIC基因DNA序列分析图。图 5 为重组表达克隆 E. coli Tuner (DE3)pLacI/pGXAG59G 的构建。图6为重组质粒pGXAG59G所携带spilC基因转化大肠杆菌E. coliTuner (DE3) PLacI后得到的重组表达克隆的SDS-PAGE分析结果。图7为丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制效果分析。
具体实施例方式在本发明的实施例中所用到的主要材料包括=EcoRI限制性内切酶、T4DNA连接 酶、小牛肠碱性磷酸酶CIP、pGEM-TeaSy载体购自Promega公司，胰蛋白胨、PVPP (英文全称 Polyvinpolypyrrolidone)购自 Sigma 公司。
实施例1一种编码新型丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因spilC的克隆；主要包括下述主要步骤 1、2、3、4、5〇主要步骤1 从海洋环境样品中提取纯化宏基因组DNA，详细的方法步骤描述如 下。(1)从广西北海海洋环境体系中采集沉淀物样品，称取4-4. 5g湿润的沉积物，加 入 IOmL 的 2 份 TENS，所述 2 份 TENS 为IOOmM Tris-HCL, 40mM EDTA, 200mMNaCI，2 % (w/v) SDS，pH8. 0 ；于振荡器上充分混勻；(2)加入 25mg/mL Protease-K 100 μ L,经 70°C水浴溶解 30min,每 IOmin 搅拌混 勻一次；(3)然后置于液氮中速冻2. 5min,迅速置于_20°C低温冰箱中冷冻5min，取出后迅 即经沸水浴完全溶解。步骤3—共重复3次；(4)再置于室温静止3min ；然后在室温下经离心处理，收集上清液置于冰上，沉淀 中再加入 IOmL 的 Buffer A，所述 Buffer A 为 50mM Tris-HCL, 25mM EDTA,3% (w/v) SDS, 1.2% (w/v) PVPP, pH8.0，离心收集上清液；将所有的上清液一起混勻，置于冰上；上清液 10 15mL中再次加入0. Ig PVPP,同时加入S印hadexG_200和20mL 1份TE缓冲液；所述 1 份 TE 缓冲液为=IOmM Tris-HCl，pH8. 0，lmM Na2EDTA ；充分混勻；37°C保温 2h，每 30min 混 勻一次。离心除去PVPP ；(5)将所有的上清液用等体积的苯酚、苯酚一氯仿异戊醇以及氯仿抽提一次； 所述苯酚一氯仿异戊醇的体积比=25 24 1。(6)沉淀DNA，每5mL加入等体积的8mol/L醋酸铵，1/10体积的醋酸钾溶液；调整 醋酸钾溶液的PH为4. 8，并加入3倍体积以上的无水乙醇，于零下80°C放置15min以上；(7)以10，OOOrpm的转速进行离心收集沉淀IOmin后，用75% (ν/ν)乙醇洗涤2 3次，干燥，溶解于适量的1份TE缓冲液；得到粗制宏基因组DNA。主要步骤2 采用电洗脱法回收纯化粗制宏基因组DNA，详细的方法步骤描述如 下。(1)透析袋的处理①切取长10_20cm透析袋；②将透析袋在2% (w/v)碳酸氢钠、ImM EDTA溶液中煮沸IOmin ；③取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗；④在ImM EDTA溶液中煮沸lOmin，勿倒掉溶液；⑤让透析袋自然冷却，4°C贮存，注意在贮存期间，应始终让透析袋浸入溶液，以防 干燥；⑥使用前，用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁。(2)酶切适量的DNA，使得目标片段有Iyg左右，电泳分离后染色，确定目标片段 的位置。(3)用手术刀片切下含有目标DNA片段的琼脂糖胶条，将它放在宽平的已被1份 TAE 湿润的药匙上，所述的 1 份 TAE 为 40mmol/L 的 Tris-acetate，lmmol/L 的 EDTA，pH8. 0。(4)将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1份TAE，然后用药匙将所切胶条放入透析袋中。(5)使胶沉到透析袋的底部，去掉多余的缓冲液，使得琼脂糖胶条正好被缓冲液包 住，用夹子夹住透析袋的上部，避免产生气泡。(6)将含有胶的透析袋放在装有1份TAE的电泳槽中电泳2_3h，通常电泳强度为 4 5V/cm，则DNA被电洗脱到袋子的壁上。(7)更换电极，再反向电泳lmin，使DNA从袋壁上返回到透析袋的内腔。(8)打开透析袋，小心地倒出胶周围的电泳缓冲液于一EP管内，然后用少量的1份 TAE,加到袋中清洗，并将清洗液一并吸入EP管内。(9)染胶，检测电洗脱是否完全。(10)用苯酚、苯酚/氯仿和氯仿抽提一次，然后用酒精沉淀DNA。干燥后，溶解在 10 μ 1 1 份 TE 中。所述的 1 份 TE 为 IOmM Tris-HCl，pH8. 0 ； lmMNa2EDTA。对照图1。在实施主要步骤1和2中，1为λ/HindIII标准样，片段大小从大到 小依次为23. 13kb，9. 4kb，6. 6kb，4. 4kb，2. 3kb，2. Okb ；2为从广西北部湾海洋环境样品中 提取分离纯化以后得到的未培养微生物的宏基因组DNA，跑样量为1 μ L ;3为第三泳道为限 制性内切酶EcoRI完全酶切宏基因组DNA以判断宏基因组DNA纯度可以进行分子水平的操 作，跑样量为1 μ L。主要步骤3 海洋环境样品宏基因组文库的构建，详细的方法步骤描述如下。首先采用修改的碱变性法大量提取克隆载体pGEM_3Zf(+)质粒DNA，获得较高 纯度质粒DNA，其主要形式是超螺旋CCC，经过EcoRl酶单酶切，变为线性DNA分子，线性 pGEM-3Zf (+)质粒DNA经过CIP去磷酸化酶处理后，直接用来连接部分酶切海洋环境未培养 微生物宏基因组DNA。用EcoRl对纯化好的宏基因组DNA进行部分酶切，琼脂糖电泳分离酶切产物，将这 些片段与经过CIP去磷酸化酶处理过的pGEM-3Zf (+) DNA连接，连接产物用电转化方法导入 大肠杆菌DH5 α，在含有X-gal、IPTG、氨苄青霉素的Luria-Bertani固体平板上检测含有重 组子的白色大肠杆菌菌落。X-gal、IPTG、氨苄青霉素的浓度分别为40yg/mL、40yg/mL、 50 μ g/mL0将阳性单菌落挑板至含有50 μ g/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani固体平板上， 37°C培养至菌落为2-3mm后，再次挑板，将转化子挑取到文库保存培养基于96孔培养板孔 中，37°C恒温培养24h左右，然后保存于-80°C低温冰箱中。最终得到了 29500-30，500个白 色转化子。随机挑取12个转化子提取质粒，然后用EcoRl酶切检测，发现11个有随机插入 的外源DNA片段，平均长度为4. Okb。对照图2，其中，1 =Ikb ladder标准样，片段大小从大到小依次为10. Okb, 8. Okb, 6. Okb, 5. Okb,4. Okb,3. 5kb,3. Okb,2. 5kb,2. Okb,1. 5kb,1. Okb,750bp,500bp,250bp ；其它 泳道2-11分别为文库克隆质粒DNA经过EcoRl酶切以后的结果。主要步骤4:从宏基因组文库中分离筛选表达丝氨酸蛋白酶抑制活性的克隆，详 细的方法步骤描述如下。采用直接测序分离筛选方法，用双脱氧核苷酸法在ABI 377DNA自动测序仪上测 定DNA核苷酸序列。得到一个编号为PGXAG59的阳性克隆，携带一个可能的编码丝氨酸蛋 白抑制剂的基因。电泳检测结果表明，PGXAG59克隆所携带的外源DNA片段大小为1. Ikb0
7
对照图3，其中，1 Ikb ladder标准样，片段大小从大到小依次为10. Okb, 8. Okb, 6. Okb, 5. Okb, 4. Okb, 3. 5kb，3. Okb, 2. 5kb，2. Okb, 1. 5kb, 1. Okb, 750bp, 500bp, 250bp pGXAG59/EcoRI ；2 酶切之前提取纯化得到阳性克隆pGXAG59的质粒DNA ；3为EcoRl酶切 阳性克隆PGXAG59的质粒DNA的结果。主要步骤5 重组质粒E. coli BL21(DE3)pLysS/pGXAG59G上表达丝氨酸蛋白酶抑 制活性的基因的测序和开放阅读框ORF分析，详细的方法步骤描述如下。用软件DNAStar对直接测序所得到的序列进行拼接，用NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的软件对 DNA 序列进行 分析，如 ORF finder (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html), Blast (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)。阳性克隆pGXAG59所携带的外源DNA由1128个碱基组成，对照图4，从5’端第 111个核苷酸开始起始密码子ATG到755个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个最有可能 的完整0RF(核苷酸111-755)，自5’端的第111-113位核苷酸为spilC基因的起始密码子 ATG,自5’端的第753-755位核苷酸为spilC基因的终止密码子TAA。经过Blastn软件比 较，PGXAG59携带的外源DNA序列在DNA水平上找不到与现有GenBanK数据库中任何DNA序 列存在同源性。表达丝氨酸蛋白酶抑制活性的基因spilC编码一个含214个氨基酸的蛋白 质，用简单组件结构研究工具(英文名称Simple Modular Architecture Research Tool, SMART,http://smart, embl-heidelberg. de)分析，由DNA序列推测的来自于未培养微生物 的表达丝氨酸蛋白酶抑制活性的SpilC蛋白组件结构，发现一个可能的独立催化区域功能 结构，该催化结构域由第一个氨基酸ATG开始，到第213个氨基酸结束。编码目的蛋白的基 因一共包含642个核苷酸，编码一个由214个氨基酸组成的多肽，用Blastp分析该ORF氨 基酸序列，发现该氨基酸序列和来自于Spirosoma linguale DSM 74的一个“proteinase inhibitor Mserpin”存在56 %的相似性，42%的一致性。该氨基酸序列编码的唯一保守 性假定蛋白没有明显的亲疏水性，没有形成明显的跨膜结构区域，也不存在低复杂度结构。对照图4，spilC基因DNA序列以及目标ORF所编码的氨基酸序列分析。实施例2spilC基因重组表达质粒的构建。利用美国Novagen公司提供的质粒pETBlue-2作为表达载体和Ε. coliTuner (DE3) pLacI作为宿主细胞进行目标基因的异源高效表达；设计正向扩增引物rei :5’ -TTAGGA TCCGATGTTCCTTATGAACGCC-3，，引入 BamHI 酶切位点 GGATCC ；反向扩增引物 RGl 5，-ATA AGCTTCTCCGGCTGCATCACTTTC-3，(NotI)弓丨入 HindiII 酶切位点 AAGCTT ；扩增该 ORF(核 苷酸111-755)，一共214个核苷酸。将PCR产物与pETBlue-2载体连接后转化大肠杆菌 NovaBlue细胞并在含X_gal和IPTG的Luria-Bertani固体平板上筛选正向连接的阳性克 隆，将包含重组表达质粒DNA的大肠杆菌细胞命名为PGXAG59G。将pGXAG59G质粒转化至 Tuner (DE3) pLacI 得菌株 Tuner (DE3) pLacI/pGXAG59G。ExPASy 网站相关软件分析 pGXAG59G 的 Theoretical pI/Mw (理论等电点 / 分子量)为4. 53/28727. 28。重组质粒E. coli BL21 (DE3) pLysS/pGXAG59G已在中国普通微生物菌种保藏管理 中心完成微生物保存，保存编号为CGMCC No. 3317，保存日期为2009年10月10日。实施例2请参考图5。图5为重组质粒E. coli BL21 (DE3)pLysS/pGXAG59G的构建检测结果。1 =Ikb ladder标准样，片段大小从大到小依次为10. Okb,8. Okb,6. Okb, 5. Okb, 4. Okb, 3. 5kb，3. Okb, 2. 5kb，2. Okb, 1. 5kb, 1. Okb, 750bp, 500bp, 250bp ；2 :Ε· coli BL21 (DE3)pLysS/pGXAG59G酶切之前的质粒DNA检测结果，跑样量为5 μ L ;3 使用限制性 内切酶 BamHI 和 HindIII 酶切 E. coli BL21 (DE3)pLysS/pGXAG59G 之后的质粒 DNA 检测结 果，跑样量为5 μ 1。实施例3SpilC目标蛋白在大肠杆菌系统中的诱导表达和纯化。将已被验证正确的具有活力的重组大肠杆菌转接于IOmL含有羧苄青霉素的LB培 养基中，培养10_15h。从IOmL LB菌液中取5_10mL加入到盛有500mL含有羧苄青霉素LB 液体培养基的IOOOmL的三角瓶中，37°C，220rpm振荡培养。2_3h后取出ImL菌液测定0D_， 当OD600到0. 4-0. 6的时候加入IPTG至终浓度为1. Ommo/L, 37°C、220rpm振荡培养IOh后， 制备粗酶液；采用Novagen公司的Ni-NTA、His_Bind Resins对重组蛋白进行分离纯化。对 制备的对照样品以及分离纯化得到的目标蛋白进行SDS-PAGE蛋白表达检测。实施例3请参照图6。图6为重组质粒pGXAG59G所携带spilC基因转化大肠杆 菌E. coli Timer(DE3)pLacI后得到的重组表达克隆的SDS-PAGE分析结果。1 采用镍柱 亲和层析技术分离春华得到的SpilC蛋白检测结果，跑样量为2μ L ；2 :E. coli BL21(DE3) pLysS/pETBlue-2蛋白检测结果，跑样量为2 μ L ；3 蛋白质标准样品带，自上而下大小依次 为116. OkDa,66. OkDa,45kDa,35kDa,25. OkDa,18. 8kDa。实施例4spilC抑制丝氨酸蛋白酶活性的测定。参照相关文献和Sigma公司活性测定方法，进行部分改进反应体系设置为2mL ； 0. 02mg/mL胰蛋白酶溶于预冷的lmmol/L HCl，取200 μ L ；取20-50 μ g已经溶于50mmol/L ρΗ7· 6磷酸钠缓冲液得SpilC蛋白样品，混合均勻，25°C温育IOmin0加入ImL 0. 5mmol/L BAEE溶液，用灭菌ddH20补充至2mL ；开始反应，连续测定5min内253nm光吸收的变化。空 白对照不加胰蛋白酶，完全活性对照不加SpilC蛋白。实施例4请参见图7，丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制效果分析。深红色1曲线图为不 添加抑制蛋白SpilC的空白对照，完全活性的BAEE和丝氨酸蛋白酶的反应速率随时间变化 的曲线；2为绿色和3为粉红色曲线图为抑制效果分析，分别是Trypsin为底物，分别添加 胰蛋白酶和抑制蛋白SpilC(150yL、180yL)以后反应速率随时间变化的曲线图。含有本发明基因的启动子、开放阅读框及其部分序列的表达载体、细胞系以及产 物丝氨酸蛋白酶抑制活性因子的酶法合成均属于本发明的保护范围。
权利要求
一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的基因spi1C，其特征在于，具有下列核苷酸序列之一1)序列表No.1的DNA序列；2)与序列表No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，从5’端第111个核苷酸开始起始密码子 ATG到755个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的开放阅读框(ORF)；所述起始密 码子ATG为自5’端的第111至第113位核苷酸，所述终止密码子TAA为自5’端的第753 至第755位核苷酸，GC含量为51.2%。
3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述开放阅读框(ORF)—共642个核苷酸 可编码由214个氨基酸组成的蛋白。
4.含有权利要求1所述基因的DNA序列的表达载体。
5.含有权利要求1所述基因的细胞系。
6.含有权利要求1所述的基因所编码的蛋白在制备丝氨酸蛋白酶活性抑制剂中的应
全文摘要
一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的基因spilC，具有下列核苷酸序列之一1)序列表No.1的DNA序列；2)与序列表No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的蛋白质。序列表中序列1的DNA从5’端第111个核苷酸开始起始密码子ATG到755个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF(核苷酸111-755)，自5’端的第111-113位核苷酸为spilC基因的起始密码子ATG，自5’端的第753-755位核苷酸为spilC基因的终止密码子TAA。本发明所提供的新的丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码酶基因针对致病性微生物侵染的过程，在发挥宿主细胞主动防御作用等方面具有广泛的用途。
文档编号C12N15/15GK101880668SQ20101016452
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者唐咸来, 李双喜, 武波, 申佩弘, 蒋承建, 郝振宇, 金科, 马格非 申请人:广西大学