专利名称：一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，特别提供了一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法。
背景技术：
自 1936 年 Klobusitzki 和 Konig 首次从美洲矛头蝮蛇(Bothrops jararaca)毒中纯化出类凝血酶以来，迄今已发现40余种蛇毒中含有类凝血酶组分，有的已被分离和纯化。其中有几种已被制成商品出售，用做临床药物研究和实验试剂。其中获得了 9种类凝血酶的全序列。过去几年中，各国科研工作者进行了包括分子克隆在内的大量的研究。通过这些研究，已经清楚认识了 30余种类凝血酶的一级结构。这些类凝血酶都有相同的保守的活性中心(His57, Aspl02, Serl95)。特别是 Vieiral 在 2004 年从 Bofhrops jararaca 中分离出了 Jaraxassin-I，并得到了其晶体，这对进一步了解类凝血酶的结构非常有帮助。蛇毒类凝血酶分布最广的是蝮亚科蛇毒。目前，已从蝮甄科二十多种蛇毒中找到蛇毒类凝血酶。其中有近十种蛇毒的TLE已被分离纯化，包括响尾蛇属二种、蝮属三种、矛头蝮属三种及烙铁头属二种。蛇毒类凝血酶制剂AncrocUIteptilases和Batroxobin，都是从矛头蝮属的蛇毒中分离纯化的。我国毒蛇蛇毒中含有类凝血酶者有尖吻蝮蛇、竹叶青、长自山白眉蝮蛇等。
发明内容
本发明的目的是充分利用药源并提供一种产率高、组分纯、药效高的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法。本发明所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备步骤为(1)、尖吻蝮蛇蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得上清液；(2)、蛇毒上清液经DEAE-S^hadex A-50离子交换层析，上样结束后，用pH7. 5的 Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用pH7. 5含 O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第4峰；(3)、第4峰用pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液透析；(4)、透析后样品经Q-kpharos离子交换层析，上样结束后，用pH8. O的Tris-HCl 缓冲溶液进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用pH8. O含O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第3峰；(5)、第3峰用ρΗ7· 5的Tris-HCl缓冲溶液透析；(6)、透析后样品经阴离子葡聚糖凝胶层析，上样结束后，用ρΗ7. 5的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用ρΗ7. 5含O 0. IM NaCL 的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一成份的尖吻
蝮蛇蛇毒类凝血酶。
上述提取分离的全过程均在常温下进行操作。本发明所述步骤(1)中的缓冲溶液是pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液。本发明所述步骤O)中DEAE-S^hadex A-50离子交换层析柱所选择的流速为 3. OmL/min。本发明所述步骤(3)中第4峰需用pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近PH8.0。本发明所述步骤中Q-kpharos离子交换层析柱所选择的流速为2. OmL/min。本发明所述步骤(5)中第3峰需用pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近PH7.5。本发明所述步骤(6)中阴离子葡聚糖凝胶层析柱所选择的流速为2. OmL/min。本发明的方法是以DEAE-S^hadex A-50离子交换层析、Q-Sepharos离子交换层析和阴离子葡聚糖凝胶层析进行单一成份的类凝血酶的制备方法。本发明可以在常温下进行操作，并具有工艺稳定、适合规模化生产、操作简单、产率高、产品纯度高等特点。
图1 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶生产工艺流程图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1本实施例所述从尖吻蝮蛇蛇毒中提取类凝血酶的步骤为(1)、取尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号10010 90g，溶于200ml pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液中，于4°C冰箱中浸泡溶解，过夜，4500转/分离心15分钟，去除沉淀，收集蛇毒上清液；(2)、DEAE-Sephadex A-50 离子交换层析柱(2. 6cmX 30cm)用 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述上清液上柱，控制流速3. Oml/min,上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；(3)、用pH7. 5含O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm 检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第4峰；、第4峰用pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 pH8. O ；(5)、Q-Sepharos 离子交换层析柱(1. 6cmX 30cm)，用 pH8. O 的 Tris-HCl 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速2. Oml/min，上样结束后，用pH8. O含 O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第3峰；(6)、第3峰用ρΗ7. 5的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 ρΗ7· 5 ；(7)阴离子葡聚糖凝胶层析柱(2. 6cmX 30cm)，用pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速2. Oml/min,上样结束后，用pH7. 5含O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一成份的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。检测纯度为95.9%。实施例2本实施例所述从尖吻蝮蛇蛇毒中提取类凝血酶的步骤为(1)、取尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号100203) 90g，溶于200ml pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液中，于4°C冰箱中浸泡溶解，过夜，4500转/分离心15分钟，去除沉淀，收集蛇毒上清液；(2)、DEAE-Sephadex A-50 离子交换层析柱(2. 6cmX 30cm)用 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述上清液上柱，控制流速3. Oml/min,上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；(3)、用pH7. 5含O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm 检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第4峰；、第4峰用pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 pH8. O ；(5)、Q-Sepharos 离子交换层析柱(1. 6cmX 30cm)，用 pH8. O 的 Tris-HCl 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速2. Oml/min，上样结束后，用pH8. O含 O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第3峰；(6)、第3峰用ρΗ7. 5的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 ρΗ7· 5 ；(7)、阴离子葡聚糖凝胶层析柱(2. 6cmX 30cm)，用pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速2. Oml/min,上样结束后，用pH7. 5含O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一成份的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。检测纯度为95.9%。实施例3本实施例所述从尖吻蝮蛇蛇毒中提取类凝血酶的步骤为(1)、取尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号100303) 90g，溶于200ml pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液中，于4°C冰箱中浸泡溶解，过夜，4500转/分离心15分钟，去除沉淀，收集蛇毒上清液；(2)、DEAE-Sephadex A-50 离子交换层析柱(2. 6cmX 30cm)用 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述上清液上柱，控制流速3. Oml/min,上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；(3)、用pH7. 5含O 0. IM NaCL的1Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm 检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第4峰；、第4峰用pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 pH8. O ；(5)、Q-Sepharos 离子交换层析柱(1. 6cmX 30cm)，用 pH8. O 的 Tris-HCl 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速2. Oml/min，上样结束后，用pH8. O含 O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第3峰；(6)、第3峰用pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 ρΗ7· 5 ；(7)、阴离子葡聚糖凝胶层析柱(2. 6cmX 30cm)，用pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速2. Oml/min,上样结束后，用pH7. 5含O 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一成份的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。检测纯度为95.9%。
权利要求
1.一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其特征在于在常温下，从尖吻蝮蛇蛇毒中提取类血凝酶的步骤为(1)、尖吻蝮蛇蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得上清液；O)、蛇毒上清液经DEAE-S印hadex A_50离子交换层析，上样结束后，用pH7. 5的 Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用pH7. 5含 0 0. IM NaCL的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第4峰；(3)、第4峰用ρΗ8·0的Tris-HCl缓冲溶液透析；(4)、透析后样品经Q-kpharos离子交换层析，上样结束后，用pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用pH8. 0含0 0. IM NaCL 的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，目的类凝血酶为第3 峰；(5)、第3峰用ρΗ7·5的Tris-HCl缓冲溶液透析；(6)、透析后样品经阴离子葡聚糖凝胶层析，上样结束后，用ρΗ7.5的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用ρΗ7. 5含0 0. IM NaCL的 Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一成份的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。
2.按照权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，特征在于所述步骤(1) 中的缓冲溶液是ΡΗ7. 5的Tris-HCl缓冲溶液。
3.按照权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其特征在于所述步骤(2) 中DEAE-S印hadex A_50离子交换层析柱所选择的流速为3. OmL/min。
4.按照权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其特征在于所述步骤(3) 中第4峰需用pH8. 0的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近pH8. 0。
5.按照权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其特征在于所述步骤(4) 中Q-kpharos离子交换层析柱所选择的流速为2. OmL/min。
6.按照权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其特征在于所述步骤(5) 中第3峰需用pH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近pH7. 5。
7.按照权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其特征在于所述步骤(6) 中阴离子葡聚糖凝胶层析柱所选择的流速为2. OmL/min。
全文摘要
一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，其具体制备步骤为蛇毒经浸泡溶解、离心；上清液经DEAE-Sephadex A-50离子交换层析；含有效成分的洗脱液经透析；透析样品再经Q-Sepharos离子交换层析；含有效成分的洗脱液经透析；透析样品再经阴离子葡聚糖凝胶柱层析，即可得到单一成份的类凝血酶；本方法可以在常温下进行操作，并具有工艺稳定、适合规模化生产、操作简单、产率高、产品纯度高等特点。
文档编号C12N9/64GK102242103SQ201010166710
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者丁忠福, 李小军, 李秀林, 王宏英, 薄学军, 薛百忠, 薛雁 申请人:辽宁诺康医药有限公司