专利名称：有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药工程领域，特别是一种有利于重组人组织型纤溶酶原激酶衍 生物(rPA)大规模复性时提高复性率的高效混合装置。
背景技术：
急性心肌梗塞是严重危害人类健康的疾病，死亡率极高。据统计，每年有超过100 万人被急性心肌梗塞夺去生命。流行病学调查显示，在中国急性心肌梗塞的发病率约为万 分之五，心脏病高居我国居民疾病死因的第 二位。溶栓治疗因具有快速、简便、经济、易操作 的特点，已经成为急性心肌梗塞治疗公认的有效方法，在我国更是成为治疗急性心肌梗塞 的主要手段。因此，研制和发展高效、安全、不良反应小的溶血栓药物，一直也是世界范围的 研究热点。溶栓药物的经过几十年的发展，新型溶栓药物的研发大大改进了溶栓的开通率和 安全性。目前rPA因其具有溶栓作用强、起效迅速、维持时间长、再通率高、不良反应小、 使用方便等特点已经成为第三代溶栓药物的代表之一。rPA是天然组织型纤溶酶原激酶 (tPA)的缺失突变体，只保留了 tPA丝氨酸蛋白酶区(与酶的活性有关)和Kringle2区(与 纤维蛋白定向性质有关)。因不含糖基化位点，可以利用基因重组技术在大肠杆菌中表达生 产。rPA含有18个半胱氨酸，有9对分子内二硫键，在大肠杆菌中表达时基本全部以包涵体 形式存在。外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时形成的包涵体不可溶、无生物活性。要将无 生物活性的包涵体蛋白质恢复成为有活性的目的蛋白，必须对其进行体外复性。但常规复 性的活性回收率不高，一般仅为5% _10%，尤其是大规模工业化复性，复性率更低，这直接 制约了许多药物蛋白成本的降低。稀释复性法因操作简单，对设备要求不高，目前仍是工业生产中最常用和有效的 蛋白质折叠复性的方法。蛋白质复性过程最大的副反应就是聚集反应，它是发生在两个分 子或多个分子之间的一种反应，因此变性蛋白质在复性液中的最终浓度对聚集反应的影响 非常明显。所以在常规的稀释复性中，为了减少聚集提高复性率，通常需要在很低的蛋白质 浓度(10-50yg/ml)下进行复性。由于蛋白质浓度很低，复性过程处理的料液量极大，一般 复性缓冲液体积为变性蛋白溶液的20-100倍，不利于复性操作和工业化放大。因此，在复 性过程中，特别是在大规模工业化复性中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高 复性收率的关键。抑制变性蛋白聚集的方法除了在复性液中添加适宜浓度的变性剂(如尿素和盐 酸胍等)、稳定剂(L-精氨酸或Tris)和表面活性剂外，还可以通过改进稀释复性时溶液的 高效、快速、温和混勻的方式，使复性时的变性蛋白溶液快速、均勻、温和地混合到大量的复 性缓冲液中。通过这种溶液分配方式的改善来减少变性蛋白的聚集，以提高目的蛋白的复 性率。目前已报道的大规模复性方法中，在复性罐中一般采用平叶浆，平叶浆产生的剪切力大，容易导致变性蛋白的聚集和复性蛋白的变性失活。另外，常规复性时变性蛋白溶液一般 只通过液面上一个点加入到大量的复性缓冲液中，导致局部未复性蛋白浓度瞬间过高，且又 脱离变性剂的防聚集保护，局部变化剧烈，变性蛋白大量聚集，导致最终复性率不高。
发明内容
本发明提供一种有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，以解决上述背景技 术中存在的技术问题，即采用平叶浆产生的剪切力大，容易导致变性蛋白的聚集和复性蛋 白的变性失活。另外，常规复性时变性蛋白溶液一般只通过液面上一个点加入到大量的复 性缓冲液中，导致局部未复性蛋白浓度瞬间过高，且又脱离变性剂的防聚集保护，局部变化 剧烈，变性蛋白大量聚集，导致最终复性率不高。为解决上述技术问题，本发明的一种有利于rPA大规模复性的高效混合复性装 置，用以向复性缓冲液内加入变性蛋白溶液，包括容器，内装所述复性缓冲液；进液管，一端 为出液端，所述出液端设有多个喷嘴，另一端为进液端，通以所述变性蛋白溶液；螺旋桨，插 入所述复性缓冲液的液面下方。其中，所述多个喷嘴均插入到所述复性缓冲液的液面下方。其中，所述进液管的出液端具有一个出液管，所述出液管上设有所述多个喷嘴。其中，所述多个喷嘴的高度不同。其中，所述进液管的出液端具有多个出液管，每一所述出液管上均设有所述多个 喷嘴。其中，每一所述出液管上均设有多个不同高度的喷嘴。其中，所述螺旋桨为单层或多层螺旋桨。其中，所述螺旋桨为1-3层。本发明的rPA包涵体大规模复性时所使用的变性蛋白加入混合装置，可有效抑制 rPA包涵体在复性时的聚集反应，显著提高目的蛋白的复性率。与常规报道的搅拌和变性蛋 白加入方式比较，复性率极大提高。另外该高效混合方式易于操作，十分利于rPA包涵体的 大规模工业化复性，对于基因工程重组蛋白药物的工业化生产具有重要意义。
图1为本发明第一实施例的示意图；图2为本发明第二实施例的示意图；图3为本发明第三实施例的示意图。附图标记说明1-容器；2-进液管；3-螺旋桨。
具体实施例方式为了使本发明的形状、构造以及特点能够更好地被理解，以下将列举较佳实施例 并结合附图进行详细说明。本发明的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，于复性罐等类似的容器1 内装有复性缓冲液，通过进液管2向复性缓冲液内加入变性蛋白溶液。进液管2的一端为出液端，其出液端具有一个出液管，出液管上设有多个不同高度的喷嘴，所述多个喷嘴均插 入到复性缓冲液的液面以下，进液管2的另一端为进液端，进液端通以变性蛋白溶液，变性 蛋白溶液通过多个喷嘴直接均勻的加入到复性缓冲液液面以下。进液管2的出液端也可分为多个出液管，每一出液管上均设有多个不同高度的喷 嘴，所述多个喷嘴均插入到复性缓冲液的液面以下。从一个进液端进入的变性蛋白溶液从 多个出液管流入复性缓冲液中，配合多层螺旋桨3，以满足复性缓冲液量较多时的需要，使 得变性蛋白溶液能够快速均勻的加入。容器1内的液面下装设有螺旋桨3，该螺旋桨3可以为单层或多层，优选的，该螺旋 桨3为1-3层。变性蛋白溶液进液时，通过该螺旋桨3的搅拌作用，避免局部瞬间浓度过高 而产生聚集沉淀。且螺旋桨的剪切力较平叶桨小，可以避免变性蛋白的聚集和复性蛋白的 变性失活。实施例1100L规模的高效混合复性装置图1为本发明第一实施例的示意图，如图所示，本实施例中
1.螺旋桨采用单层螺旋桨，减小剪切力。2.变性蛋白加入复性液中的进液管其出液端采用单管多喷嘴设计，且喷嘴全部 在液面以下，保证变性蛋白快速均勻加入到复性液中，避免局部瞬间浓度过高而产生聚集 沉淀。实施效果和常规复性装置相比，本装置实现复性率提高25%以上。实施例2300L规模的高效混合复性装置图2为本发明第二实施例的示意图，如图所示，本实施例中1.螺旋桨采用双层螺旋桨，减小剪切力。2.变性蛋白加入复性液中的进液管出液端采用双管多喷嘴设计，且喷嘴全部在 液面以下，保证变性蛋白快速均勻加入到复性液中，避免局部瞬间浓度过高而产生聚集沉 淀。实施效果和常规复性装置相比，本装置实现复性率提高22%以上。实施例3500L规模的高效混合复性装置该高效混合复性装置见附图3，关键结构说明如下1.螺旋桨采用三层螺旋桨，减小剪切力。2.变性蛋白加入复性液中的进液管出液端采用三管多喷嘴设计，且喷嘴全部在 液面以下，保证变性蛋白快速均勻加入到复性液中，避免局部瞬间浓度过高而产生聚集沉 淀。实施效果和常规复性装置相比，本装置实现复性率提高20%以上。本发明的rPA包涵体大规模复性时所使用的变性蛋白加入混合装置，可有效抑制 rPA包涵体在复性时的聚集反应，显著提高目的蛋白的复性率。与常规报道的搅拌和变性蛋 白加入方式比较，复性率极大提高。另外该高效混合方式易于操作，十分利于rPA包涵体的 大规模工业化复性，对于基因工程重组蛋白药物的工业化生产具有重要意义。以上对本发明的描述是说明性的，而非限制性的，本专业技术人员理解，在权利要 求限定的精神与范围之内可对其进行许多修改、变化或等效，但是它们都将落入本发明的 保护范围内。
权利要求
一种有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，用以向复性缓冲液内加入变性蛋白溶液，其特征在于，包括容器，内装所述复性缓冲液；进液管，一端为出液端，所述出液端设有多个喷嘴，另一端为进液端，通以所述变性蛋白溶液；螺旋桨，插入所述复性缓冲液的液面下方。
2.如权利要求1所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于，所述 多个喷嘴均插入到所述复性缓冲液的液面下方。
3.如权利要求2所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于，所述 进液管的出液端具有一个出液管，所述出液管上设有所述多个喷嘴。
4.如权利要求3所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于，所述 多个喷嘴的高度不同。
5.如权利要求2所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于，所述 进液管的出液端具有多个出液管，每一所述出液管上均设有所述多个喷嘴。
6.如权利要求5所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于，每一 所述出液管上均设有多个不同高度的喷嘴。
7.如权利要求3或5所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于， 所述螺旋桨为单层或多层螺旋桨。
8.如权利要求7所述的有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，其特征在于，所述 螺旋桨为1-3层。
全文摘要
一种有利于rPA大规模复性的高效混合复性装置，用以向复性缓冲液内加入变性蛋白溶液，包括容器，内装所述复性缓冲液；进液管，一端为出液端，所述出液端设有多个喷嘴，另一端为进液端，通以所述变性蛋白溶液；螺旋桨，插入所述复性缓冲液的液面下方。由此，本发明可有效抑制rPA包涵体在复性时的聚集反应，显著提高目的蛋白的复性率。
文档编号C12M1/02GK101831379SQ201010174260
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者周祥山, 尤金花, 张元兴, 秦玉峰 申请人:山东东阿阿胶股份有限公司;华东理工大学