专利名称：重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体，具体涉及转移载体的分 子设计、技术路线、转移载体及其在研制重组HVT活病毒载体基因工程疫苗方面的应用，属 于生物制药领域。
背景技术：
火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)是一种无致病性的a疱疹病毒，最 初于20世纪60年代末期从火鸡体内分离得到，它属于MDV-3型，基因组为线性、双股DNA 分子，大小约为160kb。HVT与鸡的高度传染性、致瘤性疾病马立克氏病(MD)的病原马立 克氏病病毒(MDV)在遗传学和血清学上具有相关性，因此，在70年代就开始作为预防MD 的疫苗株在全球得到了广泛的应用。另外，HVT作为病毒载体携带外源保护性抗原基因方 面，与其它病毒载体相比具有许多优势使用安全，对鸡及其它动物均无致病性；接种鸡体 后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症，且终生潜伏感染，可刺激机体产生较高的抗体 水平并维持终生，接种一次即可获得终生免疫。目前，国外已成功地利用HVT作为载体表达 了多种禽病原保护性抗原基因，包括新城疫病毒(NDV)、血清1型MDV、传染性法氏囊病病毒 (IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等的保护性抗原，而且能抵抗致 死剂量病原的感染，表明HVT是有效的基因工程疫苗活病毒载体。由于HVT基因组庞大，结构复杂，而且具有很强的细胞结合性，在真核细胞中对其 进行重组操作和研究，显得困难重重。近年来，细菌人工染色体(BAC)技术在疱疹病毒上的 应用解决了这一难题。通过构建HVT全基因组细菌人工染色体，就可以方便地利用Red/ET、 Cre/loxP等现代基因重组系统对病毒进行反向遗传操作。在大肠杆菌中就可以完成对HVT 基因组的遗传修饰，与在真核细胞中相比，该重组技术具有快速有效可靠的优点。目前对于重组HVT的构建有两种方法一种是传统的方法，即利用重组转移载体 与病毒基因组共转染，将外源基因如lacZ基因等同源重组入病毒基因组中；另一种方法是 利用BAC进行重组HVT的构建。使用传统的方法即同源重组，由于受到CEF细胞的制备繁 琐、同源重组率低等因素的影响，使得重组HVT的构建较为困难，而利用BAC技术进行重组 HVT的构建可以简化繁琐的病毒筛选过程。
发明内容
技术问题本发明的目的在于，构建含有表达选择标记黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸转移酶基因 (XGPRT，gpt)和细菌人工染色体(BAC)基本功能基因序列的重组HVT细菌人工染色体转移 载体pUAB-gpt-BAC，具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性，可简化重组病毒筛选过程，在研制重 组HVT活病毒载体基因工程疫苗方面具有良好的应用前景。技术方案本发明根据大肠杆菌黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸转移酶基因(XGPRT，gpt)序列设计引物，以E.coli DH5a染色体DNA为模板采用PCR方法扩增gpt基因，用其作为外源筛选基 因，与质粒PEGFP中的CMV启动子及poly (A)连接构建gpt表达盒Egpt (CMV-gpt-polyA)， 经酶切测序鉴定后，插入到含有火鸡疱疹病毒(HVT)非必需区US2两侧基因的同源臂克隆 质粒pUAB中，构建带有筛选基因表达盒的重组克隆质粒pUAB-gpt。将单拷贝细菌人工染色 体(BAC)载体克隆到pUC18中，制备高拷贝BAC载体基本功能序列，插入到pUAB-gpt中，获 得重组HVT细菌人工染色体转移载体pUAB-gpt-BAC。包括1、重组火鸡疱疹病毒(HVT)细菌人工染色体(BAC)转移载体pUAB-gpt-BAC，大小 为16100bp，HVT非必需区US2两侧同源臂A和B之间为8800bp含黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转 移酶基因(XGPRT，gpt)基因表达盒Egpt的BAC-gpt核心序列，具有氨苄青霉素和氯霉素双 抗性。2、转移载体pUAB-gpt-BAC，是通过分子设计构建的，具体包括第一步根据HVT Fcl26株基因组序列(GenBank登录号AF291866)、gpt基因序 列(GenBank登录号:X00221. 1)和质粒pEGFP-Cl 序列(GenBank登录号U55763. 1)设计了 以下PCR扩增引物。
引物序列(5，-3，)酶切位点gpt-Fgc|gctagc]gtcatgagcgaaaaatacatcgNhe Igpt-Ract|ggatcc|ttagcgaccggagattggcgBamU IEgpt-FGC|GAATTCfrATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGEcoR IEgpt-rgc|gtcgac|cgcgttaagatacattgatgagtttggaSal IA-Fcg|ggatcc|acatcgggccacgttccgccBamU Ia-rgc|tctaga|gcgtcgaccg|gaattc|gatgagctgacgtgtggaXba I、EcoR Ib-fG[GAATTClAA|GTCGAClGG|AAGC'niCCACTAATATGGGCACACEcoR I、&3/1、Hindlllb-rgc|tctaga|tggcccatctaggtgattatXba I第二步以E. coli DH5 a染色体DNA为模板，用引物gpt_F、gpt_R扩增外源加压 筛选标记基因gpt，用pMD18-T克隆载体克隆，获得含有gpt基因的阳性克隆质粒pMD-gpt ；第三步用BamH I与Nhe I双酶切pEGFP_Cl质粒，切除GFP基因，同时连接gpt 片段，获得含有gpt基因的表达质粒pEgpt ；然后，以pEgpt为模板，用引物Egpt-F、Egpt-R 进行PCR扩增筛选标记基因gpt的表达盒Egpt，即CMV-gpt-poly A,与pMD18_T克隆载体 连接，获得含有gpt基因表达盒Egpt的克隆质粒pMD-Egpt ；第四步分别用引物A-F、A-R和B-F、B-R进行PCR，以HVT感染细胞总DNA为模 板，分别扩增HVT左/右同源臂A/B，用pMD18-T载体克隆，分别获得含有HVT同源臂A和B 的克隆质粒pMD-A和pMD-B ；第五步将pMD-A 用 EcoR I 和 Xba I 双酶切，pMD_B 用 EcoR I, Sea I 和 Xba I 三酶切，回收PMD-A载体片段和B片段，T4DNA连接酶连接，获得含有HVT左/右同源臂A/ B的克隆质粒pUAB ；第六步用EcoR I和Sal I分别双酶切pMD-Egpt和pUAB，回收gpt基因表达盒 Egpt和pUAB载体片段，T4DNA连接酶连接，获得含有筛选标记基因gpt表达盒Egpt的克隆质粒 pUAB-gpt ；第七步用单拷贝BAC载体pIndigoBAC-5构建高拷贝BAC载体克隆质粒 PUC18-BAC 提取pUC18质粒，Hind III单酶切，回收pUC18目的片段，与BAC载体pIndigoBAC-5 连接，电转化宿主菌DH10B，加入37°C的S0C培养基，并将其转移到1. 5mL无菌Eppendorf 管 中，37°C、220r/min振荡培养lh，4000r/min离心5min，将细菌沉淀涂布于含氯霉素34 u g/ mL和氨苄青霉素100 u g/mL的双抗LB培养基平板上，挑取克隆，摇菌16h后提取质粒，获得 高拷贝BAC克隆质粒pUC18-BAC，其中S0C培养基为LB中含有0. 2mmol/L葡萄糖，0. lmmol/ L MgS04 和 0. lmmol/L MgCl2 ；第八步将pUC18-BAC与pUAB-gpt分别用Hind III酶切，回收pUAB-gpt线性化片 段和BAC载体的基本功能基因，T4DNA连接酶连接，获得重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体 HVT-BAC 转移载体 pUAB-gpt-BAC。上述转移载体pUAB-gpt-BAC可在制备重组HVT活病毒载体基因工程疫苗方面可 以得到应用。有益效果利用高拷贝质粒来制备BAC载体是一种简单实用的方法，这种方法制备的BAC载 体功能序列比从单拷贝质粒得到的具有更多的优点。尽管在理论上，获得一定量的单拷贝 质粒可以通过细菌的大量培养来实现，但在操作中会不可避免的导致蛋白质污染以及BAC 载体质粒本身的开环和断链，给下游克隆工作带来很大的麻烦，即使用较好的质量纯化试 剂盒，这些问题也难以避免。本发明将单拷贝BAC载体pIndigoBAC-5插入到高拷贝质粒 PUC18，成功构建了高拷贝BAC克隆质粒pUC18-BAC，用于制备BAC载体DNA，只需要培养少 量的细菌即可得到足够数量的BAC载体DNA。为了能成功构建重组HVT细菌人工染色体，在转移载体中选择使用何种筛选标记 基因是影响实验过程难易以及成功与否的关键因素。火鸡疱疹病毒与I型马立克氏病病毒 相似，都具有比较严格的细胞结合特性，如果使用非加压筛选标记基因lacZ和EGFP作为遗 传标记基因，由于在表达非加压选择标记基因的细胞中含有大量的野生病毒，重组病毒难 以筛选出来，病毒的蚀斑纯化将变得十分困难。本发明选用黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸转移酶基 因作为加压筛选标记，在加压条件下，霉酚酸(MPA)阻断了野生病毒的嘌呤代谢途径，从而 阻断了野生病毒的DNA复制，而经过同源重组将BAC-gpt目的片段正确插入到病毒的复制 非必需基因US2区的重组病毒，能够表达黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸转移酶，该酶利用外源黄嘌呤 完成了鸟嘌呤的外源补救合成，从而使得重组病毒DNA的复制能够正常进行，经过几轮筛 选野生病毒可全部死亡，而重组病毒逐渐可得到富集和纯化。为了加强核糖体小亚基对翻译起始序列的识别，以保证在CEF中能够高效表达黄 嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶，本发明在扩增正选择标记基因表达盒Egpt时，并不是将编码151 个氨基酸的456bp大小的gpt编码框简单的直接克隆到CMV早期启动子和SV40多聚腺苷 酸(polyA)尾之间，而是将gpt编码框的起始密码子ATG的上游序列按照“K0ZAK规则”进 行了优化。本发明的特点和优点如下1、本发明将单拷贝BAC载体pIndigoBAC-5插入到高拷贝质粒pUC18，成功构建了高拷贝BAC克隆质粒PUC18-BAC，用于制备BAC载体DNA，只需要培养少量的细菌即可得到 足够数量的BAC载体DNA。2、本发明选用黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因作为加压筛选标记，在加压条件 下，霉酚酸(MPA)阻断了野生病毒的嘌呤代谢途径，从而阻断了野生病毒的DNA复制，而经 过同源重组将BAC-gpt目的片段正确插入到病毒的复制非必需基因US2区的重组病毒，能 够表达黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶，该酶利用外源黄嘌呤完成了鸟嘌呤的外源补救合成， 从而使得重组病毒DNA的复制能够正常进行，经过几轮筛选野生病毒可全部死亡，而重组 病毒逐渐可得到富集和纯化。3、本发明在扩增正选择标记基因表达盒Egpt时，并不是将编码151个氨基酸的 456bp大小的gpt编码框简单的直接克隆到CMV早期启动子和SV40多聚腺苷酸(polyA)尾 之间，而是将gpt编码框的起始密码子ATG的上游序列按照“K0ZAK规则”进行了优化，以加 强核糖体小亚基对翻译起始序列的识别，保证在CEF中能够高效表达黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸 转移酶。4、本发明构建的转移载体pUAB-gpt-BAC含gpt基因表达盒的核心序列BAC-gpt， 具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性，可简化重组病毒筛选过程，在研制重组HVT活病毒载体 基因工程疫苗方面具有良好的应用前景。
四
图1重组HVT-BAC转移载体pUAB-gpt-BAC构建的技术路线图2gpt与Egpt的扩增与克隆M :DNA分子质量标准；1 :gpt片段PCR产物；2 :pMD_gpt的Nhe I和BamH I双酶 切产物；3 :Egpt片段PCR产物；4 :pMD-Egpt的EcoR I和Sal I双酶切产物图3质粒pUAB的酶切图谱M :DNA分子质量标准；1 :A片段PCR产物；2 :B片段PCR产物；3 :pMD_A的EcoR I 和XbaI双酶切产物；4 :pMD-B的EcoR I , Sea I和Xba I三酶切产物；5 :pUAB的EcoR I 和XbaI双酶切产物图4质粒pUAB-gpt的酶切图谱M :DNA分子质量标准；1 :pUAB_gpt的EcoR I和Sal I双酶切产物图5质粒pUC18-BAC的酶切图谱M :DNA分子质量标准；1、2 :pUC18_BAC的Hind III单酶切产物图6转移载体pUAB-gpt-BAC的酶切图谱M :DNA 分子质量标准；1 :pUAB-gpt-BAC 的 BamH I 单酶切产物；2 :pUAB-gpt_BAC 的XbaI单酶切产物；3 :pUAB-gpt-BAC的Nhe I单酶切产物图7转移载体pUAB-gpt-BAC的的分子图谱
五具体实施例方式1试验材料BAC载体pIndigoBAC-5为Epicentre公司产品；AxyPr印质粒小量纯化试剂盒、 DNA凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；pMD18_T克隆载体、X_gal、IPTG、限制性核酸内切酶、T4DNA Ligase、ATP、dNTP及Taq DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；含有绿色荧光 蛋白GFP基因的表达质粒pEGFP-Cl、E. coli DH5a、E. coli DH10B、DMEM培养基、胰酶为 Invitrogen公司产品；9 10日龄SPF鸡胚、火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT) Fcl26株均购自南京天邦生物科技有限公司。引物合成、DNA序列测定由Invitrogen公司 完成。2试验方法2. 1引物设计与合成根据在GenBank发表的HVT Fc 126株全长基因组序列(GenBank登录号 AF291866)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因(XGPRT，gpt)序列(GenBank登录号 X00221. 1)以及质粒pEGFP-Cl序列(GenBank登录号U55763. 1)设计了以下PCR扩增引 物 2. 2gpt基因与Egpt基因的扩增与克隆以E. coli DH5 a染色体DNA为模板，以gpt_F、gpt-R作为引物用PCR扩增外源加 压筛选标记基因 gpt。PCR 条件:95°C预变性 5min ；94°C lmin，61°C lmin，72°C lmin，35 个循 环；72°C延伸lOmin。用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，可见一条大小约为500bp的 DNA带，回收gpt基因的PCR产物，用PMD18-T载体克隆，提取克隆质粒pMD-gpt，用Nhe I 和BamH I对gpt基因克隆质粒pMD-gpt进行双酶切鉴定，可见两条大小分别约为500bp和 2700bp 的 DNA 带。用BamH I与Nhe I双酶切pEGFP_Cl质粒，切除GFP基因，同时连接gpt片段，获得 含有gpt基因的表达质粒pEgpt ；然后，以pEgpt为模板，以Egpt-F、Egpt-R作为引物扩增筛 选标记基因 gpt 的表达盒 Egpt(CMV-gpt-poly A)。PCR 条件95°C预变性 5min ；94°C lmin， 55°C 90s,72°C 2min，共30个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物经lOg/L琼脂糖凝胶电泳分 析，可见一条大小约为1300bp的DNA条带。用10g/L琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物目的片段，与pMD18-T载体连接，转化 E. coli DH5a感受态细菌，涂布于15g/L琼脂LB平板(含Amp 100 y g/mL)，挑白色菌落培 养，抽提质粒，获得含有gpt基因表达盒Egpt的克隆质粒pMD-Egpt。将克隆质粒pMD-Egpt 用EcoR I和Sal I双酶切后，用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见两条大小分别约为 1300bp 和 2700bp 的条带(图 2)。
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2. 3HVT同源臂克隆质粒的构建用9 10日龄SPF鸡胚制备原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，在75cmX 75cm细胞培养 瓶中培养24h，当细胞长成单层后，接种100PFU毒量的HVT。待70%细胞出现病变，收取病 毒感染的细胞，冻融三次，SDS碱裂解法提取病变细胞总DNA。以A-F、A-R，B_F、B-R为引物，以HVT感染细胞总DNA为模板进行PCR，分别扩增 出HVT Fcl26株US2基因两侧的左、右同源臂A和B，同源臂A约2000bp (核苷酸序列位于 137758 139758)和同源臂B约2700bp (核苷酸序列位于140762 143442)。PCR条件 95 V 5min ；94°C lmin，57°C lmin，72°C 3min，进行 30 个循环后 72°C延伸 lOmin。用 10g/L 琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物，用pMD18-T载体克隆，分别获得含有HVT同源臂A和B的 克隆质粒pMD-A和pMD-B。然后，用BamH I和EcoR I双酶切分析pMD_A，EcoR I, Sea I和Xba I三酶切分 析pMD-B，进一步测序确认。然后，将pMD-A用EcoR I和Xba I双酶切，pMD_B用EcoR I、 Sea I和Xba I三酶切，回收pMD-A载体片段和B片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5 a感 受态细菌，提取重组质粒，EcoR I和Xba I双酶切鉴定，获得含有HVT左/右同源臂A/B的 克隆质粒PUAB。将克隆质粒pUAB，用EcoR I和Xba I双酶切，8g/L琼脂糖凝胶电泳分析， 可见二条长度分别约4700bp和2700bp的DNA片段，与pMD_A载体片段和B片段的理论值 相符合(图3)。2. 4筛选标记基因克隆质粒的构建用EcoR I和Sal I分别双酶切pMD-Egpt和pUAB，8g/L琼脂糖凝胶电泳回收gpt 基因表达盒Egpt和pUAB载体片段，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化DH5 a 感受态细菌，涂布在用LB配制的15g/L琼脂平皿上(含Amp 100 u g/mL)，37°C培养14h，挑 单菌落接种入LB (含Amp 100 u g/mL)，振摇培养12h，用质粒纯化试剂盒提取质粒，EcoR I 和Sal I双酶切鉴定，获得含有筛选标记基因gpt表达盒Egpt的克隆质粒pUAB-gpt。将克隆质粒pUAB-gpt，经EcoR I和Hind III双酶切，8g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可 见二条长度分别约7300bp和1300bp的DNA片段，与pUAB和Egpt基因片段的理论值相符 合(图4)。2. 5高拷贝BAC克隆质粒的构建用单拷贝BAC载体pIndigoBAC-5构建高拷贝BAC载体克隆质粒。其方法是提取 PUC18质粒，Hind III单酶切，回收pUC18目的片段，与BAC载体pIndigoBAC-5连接，电转化 宿主菌DH10B(电转条件为0. lem电转杯，2500V、200 Q、25uF)，电击完成后立即加入37°C 的 S0C 培养基(LB 中含有 0. 2mmol/L 葡萄糖，0. lmmol/L MgS04，0. lmmol/L MgCl2)，并将其 转移到 1. 5mL 无菌 Eppendorf 管中，37°C、220r/min 振荡培养 lh，4000r/min 离心 5min，将 细菌沉淀涂布于含氯霉素(Chi，34 u g/mL)和氨苄青霉素(Amp，100 u g/mL)的双抗LB培养 基平板上，挑取克隆，摇菌16h后提取质粒，获得高拷贝BAC克隆质粒pUC18-BAC。将高拷贝BAC克隆质粒pUC18-BAC，经Hind III单酶切，用8g/L琼脂糖凝胶电泳分 析，可见2条长度分别约7500bp和2700bp的DNA片段，与pUC18和BAC载体基本功能基因 线性化片段的理论值相符合(图5)。2. 6重组HVT-BAC转移载体的构建将pUC18-BAC与pUAB-gpt分别用Hind III酶切，经8g/L琼脂糖凝胶电泳，分别回收pUAB-gpt线性化片段和BAC载体的基本功能基因，DNA胶回收试剂盒纯化，T4DNA Ligase连接，转化E. coli DH5 a感受态细菌，涂布在用LB配制的15g/L琼脂平皿上(含 Amp 100u g/ml, Chi 34 ii g/mL)，37°C培养 14h，挑单菌落接种入 LB (含 AmplOO ii g/ml，Chi 34 u g/mL)，振摇培养12h，用质粒纯化试剂盒提取质粒，获得重组火鸡疱疹病毒细菌人工染 色体(HVT-BAC)转移载体pUAB-gpt-BAC，大小为16100bp，左、右同源臂A和B之间为核心序 列BAC-gpt，大小为8800bp，具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性(Amp 100ug/ml,Chl 34 u g/ mL)，在制备重组HVT活病毒载体基因工程疫苗方面可以得到应用。 上述转移载体pUAB-gpt-BAC分别用BamH I、Xba I、Nhe I单酶切，8g/L琼脂糖 凝胶电泳分析，分别获得3071bp、5415bp、7741bp三条带；2429bp、5306bp、8492bp三条带； 7089bp、9138bp两条带；与DNA片段理论值相符合(图1、图6)。
权利要求
重组火鸡疱疹病毒HVT细菌人工染色体BAC转移载体pUAB-gpt-BAC，其大小为16 100bp，HVT非必需区US2两侧同源臂A和B之间为8800bp，含黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因XGPRT，简称gpt基因，gpt基因表达盒Egpt的核心序列为BAC-gpt，具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性。
2.根据权利要求1所述的转移载体pUAB-gpt-BAC，是通过分子设计构建的，具体包括第一步根据GenBank登录号AF291866的HVT Fcl26株基因组序列、GenBank登录号 X00221. 1的gpt基因序列和GenBank登录号U55763. 1的质粒pEGFP-Cl序列设计了以下 PCR扩增引物引物 序列(5’ -3’ )酶切位点gpt-F GCGCTAGCGTCATGAGCGAAAAATACATCGNhe Igpt-R ACTGGATCCTTAGCGACCGGAGATTGGCGBamH IEgpt-F GCGAATTCTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG EcoR I Egpt-R GCGTCGACCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGASal IA-F CGGGATCCACATCGGGCCACGTTCCGCCBamH IGCTCTAGAGCGTCGACCGGAATTCGATGAGCTGACGTGTGGA XbaI、EcoR IA-RGGAATTCAAGTCGACGGAAGCTTCCACTAATATGGGCACAC EcoR I.Sal I,HindIIIB-FGCTCTAGATGGCCCATCTAGGTGATTATXba IB-R第二步以E.coli DH5a染色体DNA为模板，用引物gpt_F、gpt_R扩增外源加压筛选 标记基因gpt，用pMDIS-T克隆载体克隆，获得含有gpt基因的阳性克隆质粒pMD-gpt ；第三步用BamH I与Nhe I双酶切pEGFP-Cl质粒，切除GFP基因，同时连接gpt片段， 获得含有gpt基因的表达质粒pEgpt ；然后，以pEgpt为模板，用引物Egpt-F、Egpt-R进行 PCR扩增筛选标记基因gpt的表达盒Egpt，即CMV-gpt-poly Α,与pMD18_T克隆载体连接， 获得含有gpt基因表达盒Egpt的克隆质粒pMD-Egpt ；第四步分别用引物A-F、A-R和B-F、B-R进行PCR，以HVT感染细胞总DNA为模板，分 别扩增HVT左/右同源臂A/B，用pMDIS-T载体克隆，分别获得含有HVT同源臂A和B的克 隆质粒pMD-A和pMD-B ；第五步将pMD-A用EcoR I和Xba I双酶切，pMD-Β用EcoR I、Sca I和Xba I三酶 切，回收PMD-A载体片段和同源臂B片段，T4 DNA连接酶连接，获得含有HVT左/右同源臂 A/B的克隆质粒pUAB ；第六步用EcoR I和Sal I分别双酶切pMD-Egpt和pUAB，回收gpt基因表达盒Egpt 和pUAB载体片段，T4DNA连接酶连接，获得含有筛选标记基因gpt表达盒Egpt的克隆质粒 pUAB-gpt；第七步用单拷贝BAC载体pIndigoBAC-5构建高拷贝BAC载体克隆质粒pUC18_BAC 提取PUC18质粒，Hind III单酶切，回收pUC18目的片段，与BAC载体pIndigoBAC-5连 接，电转化宿主菌DH10B，加入37°C的SOC培养基，并将其转移到1. 5mL无菌Eppendorf管中，37°C、220r/min振荡培养lh，4000r/min离心5min，将细菌沉淀涂布于含氯霉素34 μ g/ mL和氨苄青霉素100 μ g/mL的双抗LB培养基平板上，挑取克隆，摇菌16h后提取质粒，获得 高拷贝BAC克隆质粒pUC18-BAC，其中SOC培养基为LB中含有0. 2mmol/L葡萄糖，0. Immol/ L MgS04 和 0. lmmol/L MgCl2 ；第八步将PUC18-BAC与pUAB-gpt分别用Hind III酶切，回收pUAB-gpt线性化片段 和BAC载体的基本功能基因，T4DNA连接酶连接，获得重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体 HVT-BAC 转移载体 pUAB-gpt-BAC。
3.权利要求1或2所述转移载体pUAB-gpt-BAC在制备重组HVT活病毒载体基因工程 疫苗方面的应用。
全文摘要
本发明涉及重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体，属于生物制药领域。从E.coli DH5α染色体DNA中扩增黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因gpt基因，与质粒pEGFP中的CMV启动子及poly(A)连接，，插入到质粒pUAB中，构建带有Egpt的重组克隆质粒pUAB-gpt。用pUC18克隆单拷贝BAC载体制备高拷贝BAC载体基本功能序列，插入到pUAB-gpt中，获得重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体pUAB-gpt-BAC，含gpt基因表达盒的核心序列BAC-gpt，具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性。本发明构建的转移载体具有研制重组HVT活病毒载体基因工程疫苗的应用前景。
文档编号C12N15/66GK101864442SQ201010176530
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者周宇, 欧阳伟, 王永山, 范红结 申请人:江苏省农业科学院