专利名称：一种检测无鳞鱼致病菌柱状黄菌的方法和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类致病菌的检测技术，特别是无鳞鱼致病菌柱状黄杆菌的检 测方法和检测试剂盒以及相应的引物。
背景技术：
随着大口鲶、斑点叉尾鮰等名贵经济无鳞鱼的高密度养殖，细菌性疾病的发生 日益严重，特别是苗种阶段尤其明显。因此，只有不断地完善防治方法，认真贯彻“全 面预防，积极治疗”的方针，才能收到预期的防病效果。预防疾病的一个重要基础是判 断养殖水体中或鱼体内中是否存在某些特定的鱼类致病菌以及已经存在的致病菌的种类 和数量，从而才能够采取合适的方法对症下药。因此，如何快速、准确地检测和判断某 些细菌的感染，以有助于阐明其致病机理，及时治疗和控制鱼病的发生，一直就是众人 所努力攻克的难题。目前，针对致病菌的检测和诊断技术多种多样，包括选择性培养基鉴别培养 法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(DOT-ELISA)、单克隆抗体技 术(MonoclonalAntibodyTechnique)等。这些方法各有其特点，但在生产应用中多表现出 培养时间较长、只能用于粗略检测，不甚精确、敏感性和特异性差等不足。而在检测和 诊断技术中，聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)因其具有的简便、快速、 敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在该研究领域得到广泛应用。但是对 于无鳞鱼中斑点叉尾鮰和大口鲶主要致病菌柱状黄杆菌和温和气单胞菌等，目前国内尚 没有相关的PCR检测技术方面的研究报告。为了及时监控无鳞鱼养殖中的鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内或养 殖水体中是否存在致病菌的技术。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测无鳞鱼致病菌的试剂盒，包含引物A，其核 苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示，扩增来自柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)的基因。所述试剂盒还含有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的阳性对照物。本发明的另一目的是提供一种检测无鳞鱼致病菌的方法，包括以下步骤1)提取待检样本中的DNA ；2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示；3)用SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列制备标准阳性模板，并进行稀释和定 量；4)对DNA扩增结果进行检测。本发明方法步骤1)所述的待测样本取自鱼体或养殖水体。
本发明的再一个目的是提供一种选自如SEQ ID NO 1 2所示寡核苷酸序列的 用途，其用于扩增或检测来自柱状黄杆菌的基因。
图1柱状黄杆菌常规PCR测试引物及检测体系11-18 引物对FC1F/FC1R，11及12为空白对照；21-28 引物对FC2F/FC2R，21及22为空白对照；31-37 引物对 FC3F/FC3R，31 及 32 为空白对照；M DNA marker I.图2柱状黄杆菌常规PCR检测体系的特异性1 空白对照；2 豚鼠气单胞菌ATCC 15468 ； 3 嗜水气单胞菌；4 荧光假 单胞菌；5 河弧菌；6 温和气单胞菌；7-8 柱状黄杆菌；M DNA marker I.图3柱状黄杆菌常规PCR检测体系的灵敏度1-7 基因组DNA从0.2纳克到0.2菲克的10倍梯度稀释；8 空白对照；M DNA marker I.图4草鱼样品检测结果(柱状黄杆菌)1 空白对照；2-14 鱼池采集的病鱼样品；15 阳性对照；M DNAmarkerI.图5鲤鱼样品检测结果(柱状黄杆菌)1 空白对照；2-9 待检测病鱼样品；10 阳性对照；M DNAmarkerI.图6水体中柱状黄杆菌的检测结果1 空白对照；2-6 水样；7-8 阳性对照；M DNAmarkerI
具体实施例方式根据已有文献资料报道，柱状黄杆菌为常见的鱼类致病菌，在养殖无鳞鱼的发 病鱼体和养殖水体中常常存在，因此，我们选取柱状黄杆菌作为研究靶标，以PCR作为 技术手段，以保守的毒力基因序列作为靶标序列，研究和建立PCR快速检测技术体系， 从基因水平上，通过多学科的联合研究，在鱼致病性细菌的早期、快速、定量检测方面 进行一些积极的探索，加强鱼病的预防和诊断。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。本发明的实验方法均参照《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯等主编，科 学出版社2005年出版)所建议的实验条件。 实施例一弓I物的设计和阳性对照物的筛选合成1、从GeneBank上查找靶标病原菌柱状黄杆菌的保守基因序列，并根据这些序 列设计引物及探针。引物交由上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成。2、实验材料及试剂材料鱼类常见致病菌柱状黄杆菌、温和气单胞菌、河弧菌、荧光假单胞菌、 豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌。前五个菌株均购自中科院武汉水生生物研究所，嗜水气 单胞菌由四川农业大学鱼病研究中心提供。使用前均用相应的培养基活化，并用细菌基 因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取基因组DNA。将提取的基因组DNA 10倍梯度稀 释，用于评价PCR体系的灵敏度；
试剂5U/μ L Taq DNA polymerase (Promega,含 10 Xreaction buffer 禾口 25mM Mg2+)、IOmM dNTPs (Promega)、DNA marker I (Tiangen) ； Millipore H2O 高压灭菌后分
装，于-20度保存备用。3、引物、菌株测试用常规PCR测试所设计的引物和购买的菌株，PCR反应体系根据各组分的浓度 配制，扩增程序根据引物的TM值及产物的大小编写。常规PCR扩增在Bio-RadMycycler 梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测所得到的PCR产物。4、PCR体系性能测试PCR体系优化好以后，测试该体系的检测特异性及灵敏度。结果1、柱状黄杆菌A.常规PCR测试购买的细菌及设计的引物我们设计的三对引物序列如下FC1F/FC1R、FC2F/FC2R、FC3F/FC3R从图1可以看出，对于柱状黄杆菌，我们所设计的三对引物均可扩增出靶标条 带，表明购买的柱状黄杆菌、自行设计的引物以及使用的PCR扩增体系均可用于后续的 实验。考虑到常规PCR产物需要电泳等特点，我们根据经验选用FC2F/FC2R引物对(其 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 2所示，)用于后面的实验。B.常规PCR检测体系的特异性对于常见的几种非靶标鱼类致病菌，使用我们建立的常规PCR检测体系均为检 测阴性，对柱状黄杆菌为检测阳性，这表明我们所建立的常规PCR检测体系具有极好的 特异性，可以用于柱状黄杆菌的快速检测(图2)。C.常规PCR检测体系的灵敏度将提取的柱状黄杆菌基因组DNA作10倍梯度稀释，用作模板测试所建立的常规 PCR体系的检测灵敏度。实验结果表明，我们所建立的常规PCR体系可以检测到pg级 的基因组DNA，说明该体系具有较好的检测灵敏度(图3)。实施例2试剂盒的制备和组成成分组成1、PCR反应液800 μ L (10 μ L/次，80次，含核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2 所示的引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶缓冲液)2、Taq 酶 20 μ L (0.25 μ L/次，80 次)3、6% Chelex-100 16mL(DNA 提取液，200 μ L/次，80 次)4、DNA 阳性对照 160 μ L (2 μ L/次，80 次)5、灭菌超纯水 2mL制备方法将Taq酶缓冲液(终浓度2X)、上下游引物(终浓度0.6 μ M)、 dNTPs (终浓度0.4mM)、Mg2+ (终浓度4mM)依次加入离心管，用无菌超纯水补足总体积 至800 μ L。Taq酶为商品酶，购于promega公司，-20度保存。DNA阳性对照制备方 法见实施案例3。灭菌超纯水使用Millip0re纯水仪制备，高压灭菌后分装。以上成分均 需-20°C保存，使用时取出融化，短暂离心后使用。称取6g Chelex-100粉末(Bio-Rad)， 溶于IOOmL无菌超纯水中，即为6% Chelex-100溶液，4°C保存备用。
实施例3检测待测病鱼样本1)提取疑似患病鱼取样组织的DNA采集了一些患病及疑似患病的草鱼和鲤鱼样品，使用chelex-100(Bio-Rad)煮 沸法快速提取DNA。方法如下取一小块患病组织块，加入200 μ L Millipore H2O,捣 烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12,OOOrpm离心lmin，弃上清，加入200 μ L Millipore H2O重悬。充分混勻后取50 μ L加入到200 μ L 6 %的chelex-100中，混勻， 56°C保温20min，剧烈震荡混勻后于100°C保温8min，剧烈震荡，并于12,000离心3min， 取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。常规PCR扩增在 Bio-RadMycycler梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测分析得到的 PCR产物。剩余的模板于-20°C保存以备复检。2)用实施例1制备的引物扩增样本中的DNA，使用实施例2的试剂盒用以下程序做PCR反应体系(终浓度)程序IXreactionbuffer 95 V 4min0.3 μ M primer F/primer R 94°C 15s0.2mM dNTPs56°C IOs X 382mM Mg2+72 °C 15s1.25U Taq DNA polymerase 72V 5min2 μ L Template4 °C holdAdd Millipore H2O to 20 μ L3)阳性对照物及标准模板的制备用建立的常规PCR体系扩增柱状黄杆菌基因组DNA，2%琼脂糖凝胶电泳分离 得到特定的靶标条带。用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶标DNA。将回收的部分DNA加入 到连接体系中(10yL，含线性克隆载体、连接酶和连接酶buffer)，16°C连接过夜。次 日，将全部的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB 平板，37°C培养至长出菌落。挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体引物及菌落PCR验证 并挑选阳性克隆子。将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中培养过夜，并取ImL 提取质粒DNA(普通质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，从而得到阳性 对照物。测定提取的质粒DNA的浓度，稀释到一定倍数作为阳性对照用于PCR检测。4)检测扩增DNA(方法同实施案例3的样品制备和PCR检测)待测患病草鱼的鳃糜烂，灰色或紫色，腹部充血涨肿，尾部有红色或暗红色条 纹，与柱状黄杆菌感染引起的症状接近，但不排除有其它细菌的混合感染。待测患病鲤鱼皮肤糜烂或充血，有的鱼有白绒毛状物质附着，尾部及后腹部在 水中呈白色，死亡较快。A.柱状黄杆菌检测结果(草鱼样本)见图4。在采集的13个样品中，样品6、7、8、10、12、13出现扩增条带，位 置与阳性对照的扩增条带一致，为阳性结果；样品4、11扩增的靶标条带不明显，为弱阳性；其余样品，包括空白对照均无靶标条带产生。说明柱状黄杆菌为草鱼的主要致病 菌。柱状黄杆菌检测结果(鲤鱼样本)见图5。在采集的7个样品中，样品4和7产生与阳性对照一致的靶标条带， 表明待检样品中有柱状黄杆菌存在；样品9产生的靶标条带不明显，为弱阳性；其余样 品，包括空白对照均无靶标条带生成。说明柱状黄杆菌为鲤鱼的致病菌之一。从图4和图5可以看出，对于草鱼病鱼样品，柱状黄杆菌的检出率较高，这和草 鱼的实际患病情况吻合，这表明我们建立的常规PCR检测体系具有很好的检测效果，可 以用于鱼病的检测和预测，为鱼病的防治提供科学依据。实施例4:水体样本的检测1)细菌DNA的获取从养殖水体中采样，用无菌离心管取水样lmL， 12,OOOrpm离心lmin，弃上清，加入200 μ L Millipore H2O重悬。充分混勻后取50 μ L加 入到200 μ L 6%的Chelex-IOO中，混勻，56°C保温20min，剧烈震荡混勻后于100°C保温 8min,剧烈震荡，并于12,000离心3min，取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检 测体系进行检测。常规PCR扩增在Bio-RadMycycler梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电 泳结合凝胶成像系统检测分析得到的PCR产物。剩余的模板于_20°C保存以备复检。2)用实施例1制备的引物扩增样本中的DNA，使用实施例2的试剂盒及实施例 3的PCR程序扩增及检测。3)结果见图6。在所取的5个水样本中，样本3和6有扩增条带出现，且大 小与阳性对照的一致，表明有柱状黄杆菌的检出。与该水体中鱼的患病情况一致，表明 本发明试剂盒可以用于水体检测，以预测该水体中鱼的发病情况。本发明试剂盒能快速准确地检测病鱼和养殖水体中的柱状黄杆菌，方法简便， 检测样本量大，为有针对性治疗和有效预防鱼病提供了可靠的诊断结果，避免了盲目施 治导致的农药滥用，为消费者提供安全的水产品提供了保证。本发明核苷酸序列SEQ ID NO 1 3如下SEQ ID NO 1、2 (引物对)柱状黄杆菌常规PCR特异性引物FC2F/FC2R扩增片段的序列(138bp)SEQ ID NO 1 FC2F Sense primer 5-AATATCTCAAACGAATGGAACTTC-32 4bpSEQ ID NO: 2 F C 2 R Anti-sense primer 5-TTGGCATTATTTGTCATGTTAGC-323bp扩增产物Product:138bpSEQ ID NO 3柱状黄杆菌常规PCR特异性引物FC2F/FC2R扩增片段的序列(138bp)1545 aatatc tcaaacgaat1561 ggaacttcgg atgtgtatac aacgcttaac caaacaaatt tagacgcttctaaattgtca1621 tattttcaaa atggtactcg ttttcagcta aatgctaatg ctaacatgacaaataatgcc1681 aa
权利要求
1.一种检测无鳞鱼致病菌的试剂盒，其特征是包含引物A，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示，扩增来自柱状黄杆菌的基因。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒还含有如SEQID NO 3所 示核苷酸序列的阳性对照物。
3.—种检测无鳞鱼致病菌的方法，其特征是1)提取待检样本中的DNA；2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO 1 2 所示；3)用SEQIDNO 3所示的核苷酸序列制备标准阳性模板，并进行稀释和定量；4)对DNA扩增结果进行检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是步骤1)所述的待测样本为鱼体或养殖水体。
5.—种选自如SEQID NO: 1 2所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于扩增 或检测来自柱状黄杆菌的基因。
全文摘要
本发明公开了一种检测无鳞鱼致病菌柱状黄杆菌的方法和检测试剂盒，试剂盒包含引物A，其序列如SEQ ID NO1～2所示，扩增来自柱状黄杆菌的基因，用本发明的方法可以快速准确地检测无鳞鱼体内或养殖水体是否含有致病菌，做到有针对性的防治鱼病。
文档编号C12Q1/68GK102010896SQ20101018083
公开日2011年4月13日 申请日期2010年5月5日 优先权日2009年9月3日
发明者刘衍鹏, 康琦, 肖丹, 黄冠军 申请人:通威股份有限公司