专利名称：一种检测cebpa基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测CEBPA基因突变的试剂盒。
背景技术：
一、急性髓性白血病分子标志物的研究概况急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是由髓系造血干/祖细胞发生 累积性获得性基因改变导致正常的细胞增殖、分化和凋亡途径发生改变的一种恶性疾病， 是成人急性白血病的主要类型，分类复杂，发病机制至今尚不明确，在临床及遗传学上均具 有显著异质性。成人AML患者中大约55%可鉴定出细胞遗传学异常，大约45%的AML患者 表现为正常核型。近来在正常核型AML中鉴定出了多种有重要临床预后价值的分子标记， 通过分子标记进行危险分层在诊断、治疗中的作用越来越大。目前国际上更倾向于根据病 人对治疗的反应性及结局将其分为预后好、预后中等、预后差三类，其中细胞遗传学改变是 最常用的对预后进行分层的标准，被纳入中危组的正常核型AML是细胞遗传学分类中人数 最多的一个亚型，也是目前研究的热点之一。最新公布的WHO白血病分类标准中，强调在初 诊评估时就应对骨髓样本进行全面的细胞遗传学分析。AML亚类的定义涉及特异染色体易 位和基因突变，常见的NPM1、CEBPA、FLT3、RUNX1和KIT突变，在AML中有重要诊断和预后意 义。特别是NPM1、CEBPA和FLT3突变，在新修订的分类标准中已成为AML重要的预后参考 指标，可能成为新的治疗靶点。2010年发表的欧洲国际专家组的AML诊治方案中(Blood， 2010，115 :453-474)，认为临床工作中应检测NPM1、CEBPA和FLT3突变，至少正常核型AML 在治疗前均应检测这些重要的突变。这些突变可单独出现或非随机的联合出现，且不能孤 立的看待这些联合突变，即使是同一亚型中同时出现的不同基因改变，也会有不同的临床 过程。二、CEBPA基因与急性髓性白血病1、CEBPA 基因由基因突变导致的细胞增殖、分化和细胞凋亡途径的改变是急性髓性白血病的发 病基础。近年来，一系列的研究表明，系列特异性转录因子在正常的造血分化过程中具有重 要作用，其功能的破坏、丧失常与AML的发生有关。其中髓系转录因子CCAAT/增强子结合 蛋白-A(CEBPA)在造血系统中只表达于髓系细胞，是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重 要的转录因子，具有诱导粒系的分化和抑制增生的作用。研究发现CEBPA基因的突变和表 达水平改变与AML有关。CEBPA属于CEBP转录因子家族成员，含358个氨基酸，由定位于染色体19ql3. 1的 CEBPA基因编码而成。CEBPA基因无内含子，cDNA全长2591bp (NM_004364. 3)，内含多个翻 译起始位点，翻译起始位点多样性是由CEBPA基因5’端的开放读码框决定的。CEBPA mRNA 可翻译表达两种蛋白CEBPA p42(42kDa)和CEBPA p30 (30kDa)。CEBPA p42包括3个转录 激活结构域(TE-I、TE-II和TE-III)和亮氨酸拉链碱性区(bZIP)，通过亮氨酸拉链CEBPA 与DNA结合，并与其他蛋白形成同源或异源二聚体。与CEBPA p42相比，CEBPA p30缺乏转
3录调节结构域，它刺激相关靶基因转录的效率明显降低，且对CEBPAp42介导的靶基因转录 激活产生抑制作用。这是由于CEBPA p42自身形成CEBPA同源二聚体，和CEBPA p30形成 CEBPA异二聚体，后者的DNA结合能力和转录激活能力减弱，同时还缺乏抗有丝分裂活性。CEBPA在造血系统中的作用包括①诱导粒系分化CEBPA基因表达起始于造血干 细胞(HSC)阶段，在髓系祖细胞向粒细胞分化过程中发挥重要调节作用，其在粒/单核祖细 胞(GMPs)上的表达水平随粒细胞和巨噬细胞的发展而逐渐上调；CEBPA的破坏可以导致髓 系祖细胞向粒系分化进程的阻滞；有研究发现，在CEBPA缺失的小鼠中没有成熟的粒细胞 存在，而其他细胞系不受影响；②抑制细胞增殖通过在体外对基因敲除小鼠的分析和白 血病细胞的检测，已经对CEBPA促进细胞生长停滞的能力进行了一定的研究，并且建立了 数个关于CEBPA诱导细胞生长停滞的模型；③抑制细胞凋亡目前的研究提示CEBPA可以 通过与核因子NF-KB p50相互作用诱导bcl-2表达，从而抑制造血细胞株Ba/F3凋亡；研究 还发现，在低危的AML患者中CEBPA基因与bcl_2 RNA水平密切相关，且通过诱导bcl_2表 达来抑制细胞凋亡。2、CEBPA 基因突变Pabst等首次报道了人类肿瘤中的CEBPA基因突变，发现在无t的AML-M2患者中 16%的患者存在CEBPA基因突变，占全部AML患者的7. 3%，共检测到5种缺失、2种插入 和4种点突变。近几年发现该突变仅在造血系统恶性肿瘤中发现，在AML患者中的发生率 约占5 16%，主要见于正常核型和9q缺失的AML。CEBPA突变有两个亚型N端突变和C 端突变。N端移码突变使正常的CEBPA蛋白即CEBPA p42翻译表达过早终止，而CEBPA p30 的翻译表达过度，从而诱导细胞增殖。C端结构性突变导致亮氨酸拉链结构域(bZIP)的断 裂，影响DNA与其他CEBPA蛋白的结合和二聚体形成。在绝大多数AML患者中，C端突变出 现在CEBPA等位基因中的一个并且常伴有另一等位基因上的N端突变。AML患者所发生的 CEBPA突变有一个非常显著的特征，就是迄今为止还没有研究发现存在双等位基因的无效 突变(null mutation) οCEBPA在造血系统髓系分化、细胞增殖和细胞凋亡过程中都具有十分重要的作用， 突变的CEBPA基因通过多种途径和机制参与了 AML的发生。已发现CEBPA突变者外周血原 始细胞高，血小板低，较少发生淋巴结和髓外浸润，亦较少合并FLT3-ITD突变。正常核型 AML 单独出现 CEBPA 突变预示预后良好(FrohlingS, Schlenk RF，Stolze I，et al. CEBPA mutations in younger adults with acute myeloid leukemia and normalcytogenetics prognostic relevance and analysis of cooperating mutations. JClin Oncol. 2004, 22 :624_633 ；Dufour, Α.，Schneider，F.，Metzeler, K. H.，et al. Acute myeloid leukemia with biallelic CEBPA gene mutations and normal karyotyperepresents a distinct genetic entity associated with a favorable clinicaloutcome. J. Clin. Oncol. 2010, 28 (4)，570-577)，与高完全缓解率(CR)、无复发生存率(RFS)和5年整体存活率(OS)相关。 对正常核型AML患者常规筛查CEBPA突变，对完善个体化治疗有重要意义。另外CEBPA突 变可阻滞髓系祖细胞向粒系正常分化，可能成为AML靶向治疗的新的靶标(Preudhomme C， Sagot C，Boissel N，et al. Favorableprognostic significance of CEBPA mutations in patients with de novo acutemyeloid leukemia :a study from the Acute. Leukemia French Association(ALFA) · Blood，2002，100 :2717_2723)。
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3、CEBPA突变的检测CEBPA突变的检测在AML患者的诊断、分层、预后评估及治疗方案选择中具有重要 意义，但针对此突变的筛查一直未能在临床上开展。原因是①突变类型多样，可能是一种 或多种突变同时出现，但目前只分析了有限的几种CEBPA突变的功能价值，因此筛查分析 最好能覆盖全部CEBPA突变类型；②突变分布在CEBPA基因的全部编码区、序列片段长、GC 含量高，尽管核苷酸测序是检测基因突变的金标准，但针对CEBPA突变的测序耗费的时间 长，费用高；有研究认为片段长度分析是筛查CEBPA突变的敏感方法，但目前似乎只能检测 到CEBPA的主要功能区域，尚有待完善。使用常规筛查方法并不理想，需要开发更快速、简 {g>^iS>%%WffS^fe (Tobias Benthaus,Friederike Schneider,Gudrun Mellert,et al. Rapid and sensitive screening forCEBPA mutations in acute myeloid leukaemia. British J. of Haematology，2008，143 :230_239)。对于AML这样一组在细胞和分子遗传学上存在高度异质性且这些异质性可对诊 断、治疗及预后产生重要影响的疾病，对初诊患者应考虑进行全面的细胞遗传学及分子生 物学异常的检测，其检测结果将作为诊断及治疗选择的重要依据。但目前我国在这些研究 方面尚处于初步阶段，只有部分分子标记应用于临床检查，尚有很多有利于患者诊断、预后 评估及治疗的分子标记如CEBPA、MLL-PTD、FLT3-TKD等急需开展起来。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测CEBPA基因突变的试剂盒。本发明提供了由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成的专用引物；所述引 物对1由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述引物对2由序列 表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述引物对3由序列表的序列5所 示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物对4由序列表的序列7所示DNA和序列 表的序列8所示DNA组成。本发明还提供了一种检测CEBPA基因突变的试剂盒，包括所述专用引物。所述试剂盒还可包括ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer。所述试剂盒具体可由所述专用引物和ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer组成。所述CEBPA基因的核苷酸序列具体可如序列表的序列9所示。所述CEBPA基因突变具体可为插入突变或缺失突变，所述ABI PRISMTM 3730 DNAAnalyzer具体用于GeneScan程序电泳和片段长度分析。所述专用引物在制备检测CEBPA基因突变的试剂盒中的应用也属于本发明的保 护范围。所述专用引物可用于检测CEBPA基因突变。所述CEBPA基因的核苷酸序列可如序列表的序列9所示。所述CEBPA基因突变具体可为插入突变或缺失突变。CEBPA突变中，单核苷酸置换仅占0.6%，99%以上都是缺失或插入突变。应用本 发明的专用引物进行PCR扩增片段长度分析(1个以上核苷酸的插入或缺失均可检测出)， 可鉴定99 %的CEBPA突变，对不同通过PCR扩增片段长度分析检测出的极少数样本，可以进 行测序分析。用本发明的引物对结合PCR扩增片段长度分析，检测灵敏度为1 5% (测序检测为10% )，该方法在敏感性、准确性方面可能与传统测序方法相媲美，而且更加快速、 简便、价廉。本发明的专用引物可用于检测AML患者骨髓细胞CEBPA突变情况，分析鉴定CEBPA 突变及多态位点，研究CEBPA基因突变及多态位点在我国AML患者中发生的频率和类型，发 现新的突变类型，总结分析我国患者的CEBPA基因突变及多态位点的特点。本发明对于AML 患者常规筛查CEBPA突变有重要临床意义，有助于进一步认识我国AML患者的分子特征，完 善基因诊断体系，用于更精确的分子分型、个体化诊断和预后预测，为患者选择合适的治疗 方法提供基础。本发明对于临床AML诊断、分层及预后评估具有重要意义。
图1为1位正常人的片段长度分析结果。图2为编号No. 614患者的片段长度分析结果。图3为编号No. 614患者的测序结果。图4为编号No. 408患者的片段长度分析结果。图5为编号No. 408患者的测序结果；A =PCR产物1 ；B =PCR产物3。图6为编号No. 196患者的片段长度分析结果。图7为编号No. 196患者的测序结果；A =PCR产物1 ；B =PCR产物4。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为 自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。GeneScan程序可为“ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer"自带或 ABI 网上下载。Genemapper 软件可为 “ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer”自带或ABI网上下载。实施例、一、试剂盒的制备1、合成4对荧光标记的引物第一对1F:5，-FAM-GGCGAGCAGGGTCTCCGGGT-3，(序列 1)；IR :5，-TGTGCTGGAACAGGTCGGCCA-3，(序列 2)；第二对2F:5，-HEX-GCTGGGCGGCATCTGCGA-3，(序列 3)；2R :5，-CCCCGACGCGCTCGTACAGG-3，(序列 4)；第三对3F:5，-FAM-CCGGCTACCTGGACGGCAGG-3，(序列 5)；3R :5，-CGTTGCTGTTCTTGTCCACCGACTTCTT-3，(序列 6)；第四对4F:5，-HEX-CTCGGTGCCGCCGGCCT—3‘(序列 7)；4R :5，-AACCACTCCCTGGGTCCCCGC-3，(序列 8)；2、合成4对引物合成不携带标记基团的四对引物，引物序列同步骤一。以待测者的DNA为模板，分别用以上4对引物进行扩增，可以得到4种扩增产物，覆盖CEBPA基因全部编码区。3、试剂盒的组装试剂盒由步骤1合成的引物和ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer组成。二、应用试剂盒检测CEBPA基因突变1、片段长度分析在知情同意的前提下，对132位志愿者(包括正常人19例及AML患者113例)进 行片段长度分析，每位患者的分析过程均如下(1)取骨髓细胞，提取基因组DNA。(2)以基因组DNA为模板，分别用步骤一的1制备的4对荧光标记的引物进行PCR; 引物对1得到的PCR产物为PCR产物1 ；引物对2得到的PCR产物为PCR产物2 ；引物对3 得到的PCR产物为PCR产物3 ；引物对4得到的PCR产物为PCR产物4。(3)分别将PCR产物 1、PCR产物 2、PCR产物 3和PCR产物4在ABI PRISMTM 3730DNA Analyzer上使用GeneScan程序电泳后进行片段长度分析，数据经Genemapper软件处理后 得到检测片段大小。19位正常人中13位的结果一致；PCR产物1为345bp，PCR产物2为302bp，PCR 产物3为444bp，PCR产物4为415bp (其中1位的结果见图1) (A组)；另外6位的结果一 致(B组)；该两组正常人相比，PCR产物1、PCR产物2和PCR产物4的大小均相同，差异仅 在于B组的PCR产物3中均存在6bp的插入(即B组的PCR产物3为444bp和450bp两个 产物)。85位AML患者的结果与正常人的结果一致，其中35位与B组一致，其余的50位与 A组一致。28位AML患者与正常人的结果有差异(即存在插入或缺失突变)。编号No. 614 患者的结果见图2 :PCR产物1由两种产物组成，其中一个与正常人一致(345bp)，另一个 存在Ibp的缺失(344bp)；另外3个PCR产物与正常人相同。编号No. 408患者的结果见 图4 :PCR产物1由两种产物组成，其中一个与正常人一致(345bp)，另一个存在Ibp的插入 (346bp) ；PCR产物3由两种产物组成，其中一个与正常人一致(444bp)，另一个存在Ibp的 缺失(443bp)；另外2个PCR产物与正常人相同。编号No. 196患者的结果见图6 :PCR产物1 由两种产物组成，其中一个与正常人一致(345bp)，另一个存在Ibp的插入(346bp) ；PCR产 物4由两种产物组成，其中一个与正常人一致(415bp)，另一个存在41bp的插入(456bp)； 另外2个PCR产物与正常人相同。2、测序验证每位志愿者的分析过程均如下(1)取骨髓细胞，提取基因组DNA。(2)以基因组DNA为模板，分别用步骤一的2制备的4对引物进行PCR反应；引物 对1得到的PCR产物为PCR产物1 ；引物对2得到的PCR产物为PCR产物2 ；引物对3得到 的PCR产物为PCR产物3 ；引物对4得到的PCR产物为PCR产物4。(3)分别将PCR产物 1、PCR产物 2、PCR产物 3和PCR产物4在ABI PRISMTM 3730DNA Analyzer上进行测序。测序结果与片段长度分析结果一致。编号No. 614患者和正常人的PCR产物1相 比，测序结果显示的差异部分的核苷酸见图3 患者的PCR产物1由两种产物组成，其中一
7个与正常人一致，另一个存在Ibp的缺失；另外3个PCR产物与正常人相同。编号No. 408 患者和正常人的PCR产物1、PCR产物3相比，测序结果显示的差异部分的核苷酸见图5 患 者的PCR产物1由两种产物组成，其中一个与正常人一致，另一个存在Ibp的插入；PCR产物 3由两种产物组成，其中一个与正常人一致，另一个存在Ibp的缺失；另外2个PCR产物与 正常人相同。编号No. 196患者和正常人的PCR产物1、PCR产物4相比，测序结果显示的差 异部分的核苷酸见图7 患者的PCR产物1由两种产物组成，其中一个与正常人一致，另一 个存在Ibp的插入；PCR产物4由两种产物组成，其中一个与正常人一致，另一个存在41bp 的插入；另外2个PCR产物与正常人相同。
权利要求
由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成的专用引物；所述引物对1由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述引物对2由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述引物对3由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物对4由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成。
2.一种检测CEBPA基因突变的试剂盒，包括权利要求1所述专用引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括ABIPRISMTM 3730DNA Analyzer。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由所述专用引物和 ABIPRISMTM 3730 DNA Analyzer 组成。
5.如权利要求2至4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述CEBPA基因的核苷酸序 列如序列表的序列9所示。
6.如权利要求2至5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述CEBPA基因突变为插入 突变或缺失突变；所述ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer用于GeneScan程序电泳和片段长 度分析。
7.权利要求1所述专用引物在制备检测CEBPA基因突变的试剂盒中的应用。
8.权利要求1所述专用引物在检测CEBPA基因突变中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述CEBPA基因的核苷酸序列如序列表的 序列9所示。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述CEBPA基因突变为插入突变或缺失突变。
全文摘要
本发明公开了一种检测CEBPA基因突变的试剂盒。本发明公开了引物对1、2、3和4组成的专用引物；引物对1由序列表的序列1和序列2所示DNA组成；引物对2由序列表的序列3和序列4所示DNA组成；引物对3由序列表的序列5和序列6所示DNA组成；引物对4由序列表的序列7和序列8所示DNA组成。本发明还提供了包括专用引物的检测CEBPA基因突变的试剂盒。本发明对于AML患者常规筛查CEBPA突变有重要临床意义，有助于进一步认识我国AML患者的分子特征，完善基因诊断体系，用于更精确的分子分型、个体化诊断和预后预测，为患者选择合适的治疗方法提供基础，对于临床AML诊断、分层及预后评估具有重要意义。
文档编号C12N15/11GK101948829SQ201010180898
公开日2011年1月19日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者刘艳荣, 李玲娣, 李金兰, 牛继红, 秦亚溱, 阮国瑞, 陈珊珊, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院