专利名称：同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于家畜分子生物学技术领域，尤其涉及采用(RT)PCR扩增标记技术、分 子杂交技术、酶联显色技术的基础上，发展的多病原、同步检测技术的同时检测4种常见致 鸡 产蛋下降疫病检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
近年来，在养禽业迅猛发展的同时，混合感染、交叉感染使禽的病毒病更加复杂多 变，诊断难度不断增加。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病 毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、产蛋下降综合征(Eggdrop syndrome, EDS)、传 染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis, ILT)是危害禽类产蛋下降的主要疾 病，对养殖户造成了巨大的经济损失，对人民的食品安全也带来了重大的威胁。其中对于4种病毒特性如下(1)新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)、甚1]看占病毒属(Paramyxovirus)中的一^^禾中，属ssRNA病毒。i亥病毒主 要危害鸡、火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡 群呼吸道感染和产蛋量下降。(2)传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)属于冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属的病毒，其基因组为不分节段的正链单股RNA，所引起的是鸡 的一种急性、高度接触性的呼吸道疾病。以咳嗽，喷嚏，雏鸡流鼻液，产蛋鸡产蛋量减少，呼 吸道粘膜呈浆液性、卡他性炎症为特征。(3)鸡减蛋综合征(Egg Drop Syndrome-1976，EDS-76)是一种由腺病毒引起的病 毒性传染病，EDS-76的病原是腺病毒属无囊膜的双股DNA病毒，其主要特徵是产蛋量骤然 下降，蛋壳异常，蛋体畸形，蛋质低劣。(4)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis, ILT)是疱疹病毒科 属线性双股DNA病毒，可引起的鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。本病对养鸡业危 害较大，主要危害育成鸡及产蛋鸡，发病传播快，对易感鸡群的发病率可达90%以上。现有检测方法，多是分别逐一检测，检测操作手续繁琐，不容易稳定控制检测条 件，准确性较差；也曾有类似同时检测多个病原的报道，但仅限于方法研究阶段，而且精密 度和灵敏度不高，目前，还没有可以同时检测上述4种病原的试剂盒问世。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了同时检测4种常见致鸡产蛋下 降疫病检测试剂盒，本发明还提供了建立一种可同时检测4种病原高效快速、准确性高、价 格低廉的检测方法，为解决上述技术问题，本发明的技术方案为
一、同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，该检测试剂盒可同时检测 新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、产蛋下降综合征(EDS)、传染性喉气管炎病 毒(ILT)四种病毒。同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，所述试剂盒为50头份检测剂 量，试剂盒包括(1)4种标准病毒探针的混合纤维素酯膜小盒；(2)操作过程中所用到的试剂
权利要求
1.同时可检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒可 同时检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、产蛋下降综合征(EDS)、传染性喉 气管炎病毒(ILT)4种病毒。
2.根据权利要求1所述同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病的检测试剂盒，其特征 引物如下NDV 引物序歹Ij :5，-CTT GACACC TCA TAC TGT AT-3，PCR 扩增长度(bp) 625 5' -CCC AAG CCA TAA TAA GGT CTT-3'IBV 引物序歹Ij :5，-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3，PCR 扩增长度(bp) 600 5' -TGG TCC TCT TCA AGG TG-3'EDS76 引物序列5，-AAA CGC CAA ACG GCA ATC A_3，PCR 扩增长度(bp) 485 5' -GGA ACT GTG CGA GCG AAG AA-3'ILT 引物序列5’ -ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3，PCR 扩增长度(bp) 621 5' -CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3'
3.根据权利要求1所述的同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，其特征在 于所述试剂盒为50头份检测剂量，试剂盒包括(1)4种标准病毒探针的混合纤维素酯膜小盒；(2)检测操作过程中所用到的试剂标记用组分和检测用组分。
4.根据权利要求3所述的同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，其特征在 于所述的标记用组分包括buffer、dNTP、Mgcl 2、HPR I、M-MLV、Bio-16_dUTP、Taq 酶、4 种 引物；所述的检测用组分包括SV-AP、BCIP、NBT、预杂交液、杂交液、洗涤液、缓冲液和显色 液。
5.同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒的检测方法，其特征在于(1)检测样品的制备①取按样本要求预处理的液体抽提组织核酸，可参照下述组分先在42°C作用Ih: ddH20 11. 5 μ L,10XPCR Buffer 4μ L, dNTP (各 10mmol/L) 2 μ L，RNA 酶抑制剂 0· 5 μ L， M-MLV 0· 5 μ L，4 种探针引物(各 20pmol/μ L) 1· 5 μ L ；②病原核酸的标记，使用生物素Bio-16-dUTP对扩增产物进行标记，反应体系可参照 ddH20 6 μ L，10 X PCR Buffer 3 μ L,Mg2+(25mmo 1/L) 4 μ L，dNTP (各 2· 5mmol/L) 2· 5 μ L，Bi o-ll-dUTP 8 μ L, Taq enzyme (5U/μ L) 0· 5 μ L，4 种探针引物(各 IOpmo l/yL)3yL，模板 2μ L ；其中 PCR 扩增程序95 "C 2mi η, 94. 5 °C 30s, 55 °C 40s, 72 °C lmin，30 个循环， 72 °C IOmin ；(2)置于检测试剂盒中进行杂交反应，根据显色变化判断疾病，以出现蓝紫色显色点为 阳性，既有该病原的存在。
全文摘要
本发明是借助分子生物学技术(RT)PCR方法，得到新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，PCR技术扩增出产蛋下降综合征(Egg drop syndrome，EDS)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis，ILT)4种病毒基因的各一段保守序列作为探针，选用纤维素膜作为基质(即检测试剂盒中最为重要的基础平台)从病料中提取目的病原核酸，并在(RT)PCR时加入标记bio-16-dUTP，获得的标记的PCR产物。将标记后的产物放置检测试剂盒进行杂交检测，通过观察杂交颜色的变化来实现对生物样品的快速、高效判断及分析。
文档编号C12Q1/68GK102002533SQ201010181619
公开日2011年4月6日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者任素芳, 凌宗帅, 安静, 张伟, 徐怀英, 朱小玲, 李明辉, 李贵玲, 王友令 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所