专利名称：一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。
背景技术：
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺形状的改良(如提高作物产量， 增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等)，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器(Daniell et al. , Trends Plant Sci. 2001,6 :219-226 ；Giddings et al.， NatureBiotech. 2000，18 :1151-1156 ；Hood and Jilka, Curr. Opin. Biotechnol. 1999，10 382-386 ；Hood and ffoodard, Plants as Factories for Protein Production 2002, pp. 119-135. Netherlands =Kluwer Academic)。对于绝大多数禾本科作物，由于其产量高、 生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积(Goto et al.，Nature Biotech. 1999,17 :282-286 ；Katsube et al.，Plant Physiol. 1999,120 :1063-1073 ；Qu et al.，Planta 2005,222 :225-233 ；Takagi et al.， Proc Natl. Acad. Sci. 2005,102 :17525-17530 ；Ye et al.，Science 2000，287 :303-305 ； Zheng et al.，PlantPhysiol. 1995，109 :777-786)。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用(外源基因的理想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等)的限制因子。植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。 基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。目前广泛应用的启动子(包括CaMV35S、ubiquitinl、ACtinl)尽管其表达效率高， 然而由于其表达不受时空限制，它在几乎所有组织中都能使外源基因表达，在进行种子中外源基因过量表达过程中，会驱动基因在种子外的其它组织中表达，既消耗生物能源，同时会导致一些可能对生物生长发育产生不利影响的代谢产物的合成。且上述启动子的表达强度尚无法满足转基因产业化的需要。若选择胚乳特异性高强度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。水稻种子储藏蛋白以谷蛋白和醇溶性蛋白为主，分别占种子全蛋白的80%和 10%。水稻谷蛋白基因只在胚乳中表达，而在其它组织中几乎检测不到谷蛋白。水稻谷蛋白由至少13个基因控制，这些基因根据其DNA序列的同源性分为GluA、GluB、GluC和GluD 四个基因亚族(Subfamily)。虽然水稻谷蛋白基因在其碱基序列上具有较高的相似性(亚族内80-96%，亚族间60-80% )，但其启动子区域却几乎没有相似性，预示着其基因表达的调控机制各不相同。来自于水稻胚乳储藏蛋白基因的启动子对于外源基因的表达具有潜在的应用价值。Qu 和 Takaiwa(Plant Biotechnol. J. 2004,2 :113-125)利用 GUS 作报告基因，研究 7 3 个水稻谷蛋白(GluB-1, GluB-2, GluB-4)，3 个醇溶蛋白(10kD, 13kD, 16kD)和 1 个球蛋白Q6kD)基因启动子的表达方式、组织表达特异性和表达强度，获得了 4个表达活性比 Ubiquitin高数倍的胚乳特异性表达启动子(GluB-4，IOkD prolamin, 16kD prolamine和 Glb-1)。Qu 等人(J.Exp. Bot. 2008,59(9) =2417-2424)进一步利用 GUS 作报告基因，对 6 个水稻谷蛋白(GluA-1，GluA-2，GluA-3，GluB-3，GluB-5，GluC)基因启动子的表达方式、组织表达特异性和表达强度进行了研究，发现GluA-1，GluA-2, GluA_3启动子在胚乳的外周特异性表达，GluB-5和GluC启动子在整个胚乳中特异性表达，而GluB-3启动子则在糊粉层和亚糊粉层中特异性表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。本发明所提供的植物胚乳特异性表达启动子，来源于稻属水稻(Oryza sativa) GluB-6基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚乳特异性表达启动子功能的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件可为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。其中，序列表中序列1是由2192个脱氧核苷酸组成。上述自序列表中序列1的5'端第2123-21 位核苷酸为植物胚乳特异性表达启动子TATA盒核心区。将启动子除TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件改变。含有上述植物胚乳特异性表达启动子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。在所述表达盒中，所述植物胚乳特异性表达启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体，所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。
上述植物胚乳特异性表达启动子可用于培育胚乳特异性表达外源基因的植物。利用该植物胚乳特异性表达启动子培育胚乳特异性表达外源基因的植物的方法也属于本发明的保护范围。所述培育胚乳特异性表达外源基因的植物的方法可为将所述外源基因连接于所述植物胚乳特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述外源基因的转基因植物。所述植物胚乳特异性表达启动子下游还可连接有调控基因表达的调控元件。所述调控基因表达的调控元件，该调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的元件，如增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。所述方法中，所述外源基因为蛋白编码基因和(或)非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。所述方法中，所述植物为单子叶植物或胚乳型双子叶植物。所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、大麦、高粱、燕麦等；所述胚乳型双子叶植物是荞麦、小桐子、油桐、蓖麻等。本发明的植物胚乳特异性表达启动子是通过设计引物，以水稻基因组DNA为模板，利用PCR方法从水稻中分离得到的谷蛋白基因GluB-6启动子。通过其在水稻中的表达特异性实验表明本发明的启动子使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚乳中特异性表达。说明本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。利用本发明的启动子可提高外源基因在植物胚乳中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的启动子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
图1为GluB-6启动子克隆载体pMD-GluB_6的结构示意图。图2为pMD-GluB-6的双酶切鉴定图谱。图3为GluB-6启动子融合⑶S基因植物表达载体GluB-6-pGPTV-35S_HPT的结构
示意图。图 4 为 GluB-6-pGPTV_;35S-HPT 双酶切鉴定图谱。图5为转GluB-6-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株PCR分析的电泳图谱。图6为转GluB-6-pGPTV-35S_HPT载体Ttl代水稻叶、根及茎杆中的⑶S染色结果。图7为转GluB-6-pGPTV-35S_HPT载体Ttl代水稻种子中的⑶S染色结果。图8为转GluB-6-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株种子中的⑶S荧光活性测定结果。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、植物胚乳特异性表达启动子(GluB-6启动子)的获得根据Qu等人(J.Exp. Bot. 2008，59 =2417-2424)报导，选定一个谷蛋白基因(基因名为0s02g0248800)，定名为GluB_6。从GenBank中查找GluB_6基因的上游序列，设计引物扩增GluB-6启动子。为便于载体构建，在引物上依次添加两个酶切位点(下划线所示)。 启动子的正向引物为 GluB-6HindF :5，-TTAAGCTTTTCGCTGGATTAGAATTC-3’ (Hind III)，反向引物为 GluB-6SalR :5，GCGTCGACAGCTTTTGTATATACTAATAAAAC-3‘ (Sal I)。CTAB法从水稻(野生型水稻台中65号，该品种为1936年我国台湾省育成；曲乐庆等，植物学报，2001,43 :1167-1171 ；中国科学院植物研究所保存)叶片中小量提取基因组DNA，以其为模板，以GluB-6HindF和GluB_6&ilR为引物，进行PCR扩增GluB-6 启动子序列。反应体系为10μΜ正反向引物各1μ l，10XEx Buffer 2μ1，基因组DNA 1 μ I(IOng) ,ExTaq(TaKaRa)O. 5unit，加超纯水至 20 μ 1 ；反应程序为94°C 预变性 5min，然后 94°C lmin，55°C lmin30sec, 72°C 2min30sec，30 个循环，最后 72°C，lOmin。PCR 扩增得到2. 2kb的目的条带。回收扩增产物，直接连接到PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)上， 进行测序，结果表明，扩增得到的GluB-6启动子序列大小为2192bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将测序检测表明含有GluB-6启动子片段的重组载体命名为pMD-GluB-6(其结构示意图如图1所示)。pMD-GluB-6的双酶切鉴定图谱如图2所示，图2中泳道1为 pMD-GluB-6的双酶切获得的片段，泳道2为DNA分子量标记。实施例2、植物胚乳特异性表达启动子(GluB-6启动子)表达载体构建与遗传转化1、GluB-6启动子融合⑶S基因的植物表达载体构建双元表达载体pGPTV-35S-HPT 按照文献(Qu and Takaiwa, Plant Biotech J 2004，2 :113-125)所述的方法构建，中国科学院植物研究所保存。用Ml I和Hind III双酶切pMD-GluB-6质粒和pGPTV-35S-HPT。回收含有GluB-6启动子的2192bp的酶切片段，将该片段连接到PGPTV-35S-HPT的Ml I和Hind III酶识别位点之间。将得到的重组质粒在 PCR鉴定的基础上利用&il I和Hind III进行双酶切鉴定，得到含有2. 21cbGluB-6启动子的片段。将双酶切鉴定表明含有GluB-6启动子的重组质粒命名为GluB-6-pGPTV-35S-HPT (其结构示意图如图3所示)，GluB-6-pGPTV-35S-HPT中⑶S基因位于GluB-6启动子下游，由 GluB-6启动子启动表达。其中，GluB-6-pGPTV-35S-HPT的双酶切鉴定图谱，如图4所示。 图4中泳道1为GluB-6-pGPTV-35S-HPT的双酶切图，泳道2为DNA分子量标记。2、转 GluB-6-pGPTV_;35S-HPT 水稻的获得用冻融法将GluB-6-pGPTV-35S_HPT 导入农杆菌 EHA105(Hood et al.， TransgenRes 1993，2 :208-218 ；中国科学院植物研究所保存)中，然后转化野生型水稻 Kitaake0利用潮霉素筛选方法(按照文献Hiei et al. , Plant J 1994，6 :271-282所述方法进行)，获得11株Ttl代转GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻植株。利用PCR方法对上述筛选得到的转GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻进行PCR分子检测，PCR引物为上述扩增GluB-6启动子的引物，即:GluB-6启动子的正向引物GluB_6HindF :5，-GGAAGCTTT TTAAGCTTTTCGCTGGATTAG-3，及反向引物 GluB_6SalR :5，-AAGTCGACTGCGTCGACAGCTTTT GTATAT-3，。PCR反应体系为10μΜ正反向引物各1μ l，10XEx Buffer 2μ1，基因组 DNA 1μ 1，ExTaq(TaKaRa)O. 5unit，加超纯水至 20 μ 1 ；反应程序为94°C 预变性 5min，然后 94°C lmin，55°C lmin30sec, 72 °C 2min30sec，30 个循环，最后 72 °C，lOmin。PCR 扩增得到2. 2kb的目的条带即为检测阳性。结果表明共得到9株PCR检测阳性的转 GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株。图5中，第1泳道为以pMD-GluB-6质粒为模板扩增的阳性对照，第13泳道为PCR体系中不加模板的阴性对照，第2 12泳道分别为转 GluB-6-pGPTV-35S-HPT植物表达载体的Ttl代植株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。实施例3、植物胚乳特异性表达启动子(GluB-6启动子)的功能验证对转GluB-6-pGPTV-35S_HPT水稻Ttl代植株进行组织化学染色。具体步骤将转 GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株的部分叶片、根、茎杆组织及用解剖刀从中部纵切开的开花后11天、15天、17天的灌浆期种子浸泡于⑶S反应液(0. IM NaPO4缓冲液，pH7. 0， IOmM EDTA, pH7. 0，5mM 铁氰化钾，5mM 亚铁氰化钾，1. OmMX-Gluc，0. 1 % Triton X-100)， 37°C反应。染色后的组织在70%乙醇中保存、观察，并在解剖显微镜下照相。结果表明 转GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻根、茎杆及叶中均未观察到⑶S表达，结果图6所示；开花后11天的种子胚乳外部变蓝，胚乳中心部位和胚未被染成蓝色；开花后15天的种子与开花后11天的种子相比，糊粉层、亚糊粉层、胚乳外部蓝色清晰可见，胚未被染成蓝色；开花后17天种子的整个胚乳的蓝色清晰可见，胚仍未被染成蓝色，结果图7所示。染色结果表明GluB-6启动子使β-葡糖苷酸酶(GUQ报告基因只在水稻种子胚乳中特异性表达。图6 中1、2、3、4分别为根、茎杆、叶片、叶鞘染色结果。图7中lld、15d、17d分别表示分别表示转GluB-6-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株开花后11天、15天、17天灌浆期种子的⑶S 染色结果。实施例4、转基因水稻的组织⑶S荧光活性测定对转GluB-6-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株开花后15天的灌浆期种子进行⑶S定量分析，方法按照Jefferson等的荧光检测方法(Jefferson，Plant Mol. Biol. Report, 1987, 5 =387-405)进行。具体为取1粒种子，置于1. 5ml印pendorf管中，用玻璃棒将种子碾碎，加入 30 μ 1 抽提液(50mM NaPO4 (pH7. 0)，IOmM β -Mercaptoethanol，IOmM Na2EDTA(ρΗ8· 0) ,0. 1 % SDS，0. 1 % Triton X-100)，摇勻。4°C 15，OOOrpm 离心 IOmin,取 10 μ 1上清于新管中，加入90 μ 1保温至37°C的反应液(ImM MUG)，37°C反应60分钟，加入900 μ 1终止液(0. 2Μ Na2CO3)，室温终止反应。用F-4500 (日立)型荧光分光光度计在 360nm激发波长和460nm吸收波长下检测相对4MU含量。以牛血清蛋白为对照，利用Bio-Rad Protein Assay Kit测定蛋白质含量，如图8所示。结果表明，GluB_6启动子驱动的⑶S在转基因水稻种子中表达的活性为15. 65士8. 19pmol 4MU/min/μ g蛋白。图8中，1 6分别为不同转GluB-6-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株的3粒种子中⑶S表达活性平均值1 为 11.53pmol 4MU/min/μ g 蛋白，2 为 10. 83pmol 4MU/min/μ g 蛋白，3 为 10. 67pmol 4MU/ min/yg 蛋白，4 为 29. 81pmol 4MU/min/μ g 蛋白，5 为 21. 48pmol 4MU/min/μ g 蛋白，6 为 9. 6pmol 4MU/min/ μ g 蛋白。
权利要求
1.一种植物胚特异性表达启动子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚特异性表达启动子功能的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的植物胚特异性表达启动子的表达盒。
3.含有权利要求1所述的植物胚特异性表达启动子的重组表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
4.权利要求1所述的植物胚特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用，所述转基因植物中的外源基因是在胚中特异性表达的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述培育转基因植物，是将所述外源基因连接于所述植物胚特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚中特异性表达所述外源基因的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述胚特异性表达启动子下游还连接有调控基因表达的调控元件。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA 基因和/或反义RNA基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦；所述双子叶植物是大豆、油菜或向日葵。
全文摘要
本发明公开了一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。该启动子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。
文档编号C12N1/15GK102250892SQ20101018372
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者徐秀萍, 曲乐庆, 柴志坚, 董祥柏 申请人:中国科学院植物研究所