专利名称：促进伤口愈合的组合物的制作方法
技术领域：
本发明为一种促进伤口愈合的组合物，特别是一种以肽为活性成分的组合物。
背景技术：
通常慢性疾病患者往往会因为身体上的不适、不方便造成一些并发症，其中，最严重的莫过于糖尿病所造成的衍生并发症。糖尿病目前仍为我国十大死因之一，且在全世界均为重要疾病。如果糖尿病没有得到足够的控制，可能会引起一些急性或慢性的并发症，如低血糖症、心血管疾病、慢性肾衰竭、视网膜病变、神经病变及微血管(microvascular)病变等；其中，微血管病变可能导致勃起功能障碍(阳痿)以及伤口难以愈合。而若发生在足部，其难以愈合的伤口则可能导致坏疽(亦即俗称的“糖尿病足”)，进而导致患者截肢。如果糖尿病得到了足够的控制，并且对血压充分控制并结合良好的生活习惯(如不吸烟，保持健康的体重等)，则可以在有效的降低罹患上述并发症的危险。初期只是脚部伤口难于愈合，若处理不当可引致截肢。若是糖尿病足未能尽快医治，可能会演变成难以复原的问题伤口 ；如同其它的问题伤口，其虽经由传统一般内科或外科治疗方法处理，但却不容易痊愈，这可能是为病人整个系统性或局部的状况不容许伤口进行正常的修复工作。这些包括了郁血性的血管病变、 未愈合的伤口、截肢后伤口愈合不好、及糖尿病足者等。若是无法妥善处理，将造成伤口的感染进一步的恶化。长期糖尿病的患者，常有血管的病变及末稍神经炎的并发症。此类病人趾端的感觉因为神经炎的关系，常常丧失知觉，因此经常会碰撞至流血而仍不自知。此类的趾端或下肢的伤口再加上末梢血管的病变和胶原蛋白不正常，非常不容易愈合，而往往演变成慢性溃疡。截肢的手术常常一节一节的往上切至膝盖以上。根据Wagner’ s的分类糖尿病足可分为五度，这种分类由伤口的大小、所到的深度和在整个足部的位置来描述一种简单的改良的分类法。它包括了溃疡所造成的严重缺氧和影响肢体血液循环的程度。治疗这种病人成功的主要秘诀，在于如何将缺氧和已溃烂病变部位的血管重建起来，而及时改良其恶化的环境。血管的病变可由轻度的病变到极严重的多处血管病变不等。为了有效治疗此等特殊伤口愈合问题，美国食品药物管理局(FDA)曾批准一种重组的蛋白质药物Regranex用于伤口愈合以治疗糖尿病患者足部溃疡，但依据其临床研究资料，发现使用“Regranex gel”的患者死于癌症者较未使用的患者多。“Regranex gel”是一种重组的血小板衍生生长因子(recombinant PDGF)，卫生署核定的适应症为“促进全层糖尿病溃疡小于或等于5公分伤口的愈合”。因生长因子使细胞分化更快速，故需持续监测使用“Regranex gel”的癌症发生率。美国FDA会在分析评估这些临床研究资料后，再做出对该药品的新建议，卫生署亦会密切注意此事的发展状况，监视血小板生长因子的用药安全，并呼吁医师为病患处方血小板生长因子药品时，应谨慎评估其用药的风险与效益，以降低不良反应的发生。可见目前市面上可购得用于促进伤口愈合的蛋白质药物具有致癌的潜在风险，仍不甚安全。
因此，针对未来的医疗需求，亟需开发一种高安全性的蛋白质药物，以应用于促进伤口愈合。
发明内容
本发明提供一种促进伤口愈合的组合物，其包含SEQ ID NO. 1的肽为活性成分。本发明的一较佳实施例中，该组合物更包括医药上可接受的载体。本发明的另一较佳实施例中，该活性成分的有效浓度为0. 1微克/毫升至200毫
克/毫升。本发明的另一较佳实施例中，活性成分的有效浓度为10微克/毫升至150毫克/毫升。本发明的另一较佳实施例中，该组合物为液体、膏状、凝胶状、或喷雾。本发明所提供的组合物，可用于接触哺乳动物伤口，以促进该伤口愈合。本发明更提供一种肽，其具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本发明更提供一种核酸分子，其编码SEQ ID NO. 1的肽。本发明更提供一种载体，其包含编码SEQ ID NO. 1的肽的核酸分子。本发明更提供一种转型微生物，其包含具有编码SEQ ID NO. 1的肽的核酸分子的载体。本发明复提供一种制造具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的肽的方法，其是培养包含具有编码SEQ ID NO. 1的肽的核酸分子的载体的转型微生物，并自该转型微生物的培养基中分离该肽。本发明的组合物是以具有SEQ ID NO. 1的序列的肽为活性成分，该肽为黏液蛋白 MUC15片段的重组蛋白。已知GenBank Accession No. BC058007的MUC15蛋白质全长为334 个氨基酸，本发明所选择的片段为GenBank Accession No. B C058007的第观至2 个氨基酸，其序列如SEQ ID NO. 1所示，将纯化所得的重组蛋白进行小鼠的动物实验，发现本发明的重组蛋白能促进小鼠背上的伤口愈合。本发明的组合物以具有SEQ ID NO. 1的序列的肽为活性成分，而可编码该SEQ ID NO. 1的肽序列的核酸分子均可用于本发明的选殖，在适当的修饰增删情形之下，多种核酸分子可用于表达本发明组合物的肽。本发明的组合物涂抹于哺乳动物伤口上，以促进该伤口的愈合。本发明的组合物依循一般的药理常识，其剂型可为液体，包括外用液、擦液、涂液、滴液，或是膏状，包括乳霜、油膏、软膏、糊状剂、以及凝胶状、或喷雾，其为外用。本发明的组合物以具有SEQ ID NO. 1的序列的肽为活性成分，该组合物的有效浓度以该肽的具有促进伤口愈合效果的浓度为基准，可依据伤口种类、面积、以及组合物的剂型等，而分别制备不同浓度的活性成分的组合物，其有效浓度可为0. 1微克/毫升至200毫克/毫升，并可视需要而调整不同的浓度。MUC15是一种膜结合式黏液蛋白(membrane-bound mucin)，最初是从牛奶纯化而来(Pallesen et al.，2002)。人类的 MUC15 具有细胞外功能区域(extracellular domain)、 穿膜功能区域、以及细胞质尾端(cytoplasmictail)。在许多人类器官中，可通过RT-PCR检测到MUC15 mRNA的表达。本发明所选用的具有SEQ ID NO. 1的序列的肽位于MUC15黏液蛋白的细胞外功能区域，以作为本发明的组合物的活性成分。如Singh 与 Hollingsworth 的报导(Trends in Cell Biology, Vol. 16，467-476， 2006)，黏液蛋白(mucins，MUC)为一类具有高度糖化的蛋白质，表达在多种表皮细胞上， 通过细胞表达位置的不同，可将黏液蛋白分为两类膜结合式黏液蛋白(membrane-bound mucins)以及分泌式黏液蛋白(secretory mucins) 0分泌式黏液蛋白缺乏穿膜功能区域 (transmembranedomain)，因此会分泌到细胞外，其表达局限在分泌器官与细胞，所包含的成员为MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8以及MUC19。膜结合式黏液蛋白的成员则包括 MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17 以及 MUC20。由相关文献报导可知，黏液蛋白家族种类繁复，且其型态功能各异。现有已上市的唯一治疗糖尿病伤口的蛋白质药物为一种经过基因工程改造的重组血小板衍生生长因子(recombinant PDGF)，若将本发明与其相比较，由于FDA警告已上市的此重组PDGF产品有致癌危险，而本发明的组合物所选用者为大量存在于乳汁的MUC15 黏液蛋白，具有相当的生物安全性，因此本发明较具优势。故而，关于本发明的优点与精神可以藉由以下发明详述及所附图式得到进一步的了解。
图1为本发明的纯化重组蛋白(rec MUC15)的电泳图谱。图2A与2B为浓度100微克/毫升的本发明重组蛋白促进伤口愈合的情形。图3A与;3B为浓度30微克/毫升的本发明重组蛋白促进伤口愈合的情形。图4A与4B为浓度100微克/毫升的其它黏液蛋白促进伤口愈合的情形。
具体实施例方式本发明利用大肠杆菌表达MUC15的重组蛋白，在小鼠动物实验中，发现本发明的重组蛋白能促进小鼠的伤口愈合。实施例1 重组蛋白的制备本发明选择GenBank Accession No. BC058007序列的第沘至2 位氨基酸作为重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明并选殖其对应的基因片段，以用于表达本发明的MUC15片段。为了将选择的基因片段序列接入细菌表达蛋白载体中，设计5’端具有KpnI限制酶切位的引物(其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示)、以及3’端含有B10I限制酶切位的引物(其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示)，使用前述的引物对进行聚合酶连锁反应 (polymerase chain reaction, PCR)，以选殖标的核苷酸片段。将所选殖得到的标的核苷酸片段、蛋白质表达载体pET30 (+)(购自Novagen， Madison, WI, USA)分别经过限制酶 KpnI (购自 NEB, Ipswich, England)、以及 XhoI (购自 NEB, Ipswich, England)处理后，利用 T4 DNA 结合酶(Τ4 DNA ligase，购自 TAKARA, Shiga, Japan)作用，使标的核苷酸片段与载体接合，再将接合的重组载体转化进入DH5 α大肠杆菌。随后利用限制酶图谱(restriction enzyme mapping)进行筛选，再将正确大小的重组载体进行DNA测序确认。
将确认的重组载体再次转化进入BL21大肠杆菌菌株，以表达本发明的重组蛋白。 将转化的BL21菌液涂抹于培养皿上，经过37°C、12至14小时的培养后，挑选一菌落接种于 1毫升(ml)的LB培养液，再经过5至8小时培养后，吸取100微升(μ 1)菌液加入100毫升LB培养液置于250毫升锥形瓶中继续培养，当菌液的0. D. 600nm吸光值达到0. 3时，加入 ImM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG ； 购自Sigma-AldrichJt. Louis，M0，USA)以刺激细菌大量表达重组蛋白；再培养12至14小时的后，将菌液打散于含有IOmM咪唑(imidazol ；购自Sigma-Aldrich, St. Louis, M0, USA) 的结合缓冲液(bind buffer)，再利用超音波震碎。依据供货商建议的步骤，将此菌液利用 Ni-NTA His-Bind 树脂(Ni-NTAHis-Bind resins ；购自 Novagen，Madison, WI, USA)纯化， 之后将纯化蛋白质进行电泳分析，确定蛋白质的大小与产量，其结果如图1所示。图1为本发明的纯化重组蛋白的电泳图谱。纯化后的重组蛋白大约为30kDa，且与对照组的血清蛋白(BSA)比较后，确定培养100毫升的菌液能纯化获得1毫克的重组蛋白。实施例2 动物伤口愈合试验取14周大、公的、C57B L/6的小鼠8只，先以4%的水化氯醛(10ml/kgchloral hydrate ；购自Merck，Darmstadt, Germany)将小鼠麻醉，刮去小鼠背上的毛发，并替小鼠背上的皮肤消毒，随后使用直径1公分的打洞器在小鼠背上打出两个伤口。以2%海藻酸钠作为对照组，将浓度100微克/毫升的本发明重组蛋白(溶于2%海藻酸钠)作为实验组，每天分别将溶液涂抹于小鼠背上的伤口，并在隔天拍摄小鼠伤口的情况。以Image-Pro Plus software(购自Media Cybernetics,Bethesda,MD,USA)分别定量不同天数的的伤口面积， 利用Mudent，s-test统计实验结果，其结果如图2A与2B所示。图2A与2B为浓度100微克/毫升的本发明重组蛋白促进伤口愈合的情形。由图2A可见，相较于2%海藻酸钠的对照组，本发明具有显著地促进伤口愈合的效果。以第7 天的情形为例，对照组的伤口大小为42. 42 士 18. 69平方毫米，而实验组仅剩24. 75 士 15. 73 平方毫米；至第10天时，对照组的伤口大小尚余14. 10士5. 00平方毫米，而实验组更仅剩 6. 71 士3. 17平方毫米；其统计分析数据如图2B所示，可见本发明确实具有良好的促进伤口愈合的效果。另取7周大、公的、C57BL/6的小鼠9只改以较低浓度进行测试，其结果如图3A与 3B所示。由图3A可见，当浓度降为30微克/毫升时，本发明重组蛋白相较于2%海藻酸钠的对照组，图3B仍明显具有促进伤口愈合的功效。此外，改以MUC20黏液蛋白进行伤口愈合实验，以佐证本发明的功效。取8周大、 公的、BALB/C的小鼠8只配合浓度100微克/毫升的MUC20重组蛋白进行实验，其结果如图4A与4B所示。图4A所示由伤口愈合情形可见，MUC20黏液蛋白相较于对照组，图4B所示并无明显促进伤口愈合的情形，可知纵使同为黏液蛋白类型的蛋白质，并非每一种均具有促进伤口愈合的功效，足见本发明的可贵且具有高度的新颖性与进步性。本发明的权利要求；凡其它未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在本发明的权利要求内。
权利要求
1.一种促进伤口愈合的组合物，其特征是包含SEQ ID NO. 1的肽为活性成分。
2.如权利要求1的组合物，其特征是更包括医药上可接受的载体。
3.如权利要求1的组合物，其特征是其中该活性成分的有效浓度为0.1微克/毫升至200毫克/毫升。
4.如权利要求1的组合物，其特征是其中该活性成分的有效浓度为10微克/毫升至150毫克/毫升。
5.如权利要求1的组合物，其特征是其中该组合物为液体、膏状、凝胶状、或喷雾。
6.如权利要求1的组合物，其特征是其可用于接触哺乳动物伤口，以促进该伤口愈合。
7.一种肽，其特征是其具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
8.—种核酸分子，其特征是其编码SEQ ID NO. 1的肽。
9.一种载体，其特征是其包含权利要求8的核酸分子。
10.一种转型微生物，其特征是其包含具有权利要求9的载体。
11.一种制造如权利要求7的肽的方法，其特征是培养权利要求10项转型微生物，并自该转型微生物的培养基中分离该肽。
全文摘要
本发明为一种促进伤口愈合的组合物，其包含以SEQ ID NO.1的肽为活性成分，该组合物可与哺乳动物伤口接触，以促进动物伤口愈合。
文档编号C12N15/63GK102258767SQ201010192739
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者谢美英, 黄敏铨 申请人:黄敏铨