专利名称：表达抗生素基因簇的载体宿主系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程或微生物学领域，具体涉及表达抗生素基因簇的载体宿主系统及其应用。
背景技术：
链霉菌是一类高GC含量革兰氏阳性细菌，一半已知的微生物抗生素来源于这个类群。生长缓慢的常温链霉菌是众多重要抗生素的来源菌株，但是快速生长的高温链霉菌资源却被发掘得很少。由于链霉菌模式菌株天蓝色链霉菌对于来源于大肠杆菌双链DNA转化有很强的限制修饰，所以几十年来，与天蓝色链霉菌分类学很近的丢失了内源质粒的没有强限制修饰系统的变铅青链霉菌菌株被用来作为基因克隆和表达的异源宿主。然而，与大肠杆菌和芽孢杆菌相比，常温链霉菌生长缓慢(在条件下用SMM培养基，M145指数生长期倍增时间是2. 2小时)。这就使得一般工业上需要2-3周的时间来产生和累积抗生素产物。快速生长的高温链霉菌已经被发现了很长的时间了。一些最早被描述的高温链霉菌菌株没有被归入到高温链霉菌属。高温链霉菌数值分类研究表明有三个主分支，五个次分支和两个单菌株分支。对16s rRNA基因以及形态学和化学特性暗示它们属于链霉菌属。 大部分高温链霉菌生长温度在^_55°C，它们是中度嗜高温链霉菌。然而一些高温链霉菌可以生长高达68 V，S. thermoautotrophicus合适的生长温度是65°C并且低于40 V就不能够生长。高温链霉菌在高温条件下生长快速，例如S. thermoviolaceus的倍增时间在50°C 只要一个小时。高温链霉菌可以产生热稳定的工业酶如木聚糖酶(xylanase)，α淀粉酶 (alpha-amylase)禾口抗生素檔菌素(granaticin)禾口氛茵毒素(anthramycin)。因为高温链霉菌还没有建立遗传操作系统，常温链霉菌被用来表达来自于高温链霉菌来源的基因和抗生素基因簇。工业生产中生长快速的宿主菌将缩短发酵周期提高生产效率。因此，本领域迫切需要建立高温链霉菌遗传操作系统，并且最好该系统生长速度快， 生产效率高。
发明内容
本发明的目的在于提供表达抗生素基因簇的载体宿主系统及其应用，所述系统生长速度快，生产效率高。在本发明的第一方面，提供一种链霉菌，该链霉菌是中度嗜温的链霉菌，能在 30-500C (较佳地37-45°C )生长，其在45°C的生长代时为小于2小时(较佳地为小于1. 5 小时，更佳地为1.1小时)。在一个优选例中，所述链霉菌在50°C的生长代时为小于2. 5小时；较佳的为小于 2. 4小时；更佳地为2. 3小时。在另一优选例中，所述的链霉菌的16s rRNA序列如SEQ ID NO 1所示；或所述的链霉菌的染色体复制起始区(ori，位于基因dnaA与dnaN之间的一段序列)序列如SEQ IDNO 3所示。在另一优选例中，所述的链霉菌在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC M 2010092 (4F)。在另一优选例中，所述的链霉菌的16s rRNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的链霉菌的染色体复制起始区(ori，位于基因dnaA与dnaN之间的一段序列)ori序列如SEQ ID NO 4 所示。在另一优选例中，所述的链霉菌在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC M 2010091 (2C)。在本发明的另一方面，提供所述的链霉菌的用途，用于作为宿主系统表达外源基因或基因簇。在本发明的另一方面，提供一种重组的宿主系统，所述宿主系统包括所述的链霉菌，以及包含于所述链霉菌中的外源基因或基因簇。在另一优选例中，所述的外源基因或基因簇整合于所述的链霉菌的基因组上；或者所述的外源基因或基因簇包含于重组载体中，所述重组载体包含于所述链霉菌中。在另一优选例中，所述的外源基因或基因簇是常温或高温来源的。在另一优选例中，所述的外源基因簇是抗生素基因簇。在另一优选例中，所述的抗生素是由链霉菌或放线菌产生的抗生素。在另一优选例中，所述的抗生素选自氨茴霉素，放线紫红素，有效霉素，林可霉素，红霉素，土霉素，金霉素，四环素，碳霉素，竹桃霉素，麦迪霉素，特曲霉素，制霉菌素，两性霉素，博莱霉素，雷帕霉素，替考拉宁，万古霉素，去甲金霉素，多黏菌素B，达托霉素，妥布霉素，链霉素，奈替米星，阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，链霉素，普那霉素，多拉菌素，阿维菌素。在本发明的另一方面，提供一种表达外源基因或基因簇的方法，包括培养所述的重组的宿主系统，使之表达外源基因或基因簇。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了用分离得到16S rRNA构建的一个基于邻接法(neighbor-joining)模型的进化树。图2显示了扫描电镜观察在MS培养基生长2天的4F和2C菌株样品的生长情况， 可以看到形成了长的光滑孢子链。图3显示了将各分离得到的菌株的孢子悬液进行10倍系列稀释后涂布在MS培养基上，分别于30，37，45°C进行培养，并在不同的时间点进行拍照记录观察。图4显示了同等数目的孢子接种到TSB液体培养基(配方0xoid tryptonesoya broth powder (CM129) 30 克，加蒸溜水到 1000ml ；或参见 T. Kieser.，M.J.Bibb.， M. J. Buttner. , K. F. Chater. , D. A. Hopwood, page412, Practical Streptomycesgenetics, The John Inns Foundation, Norwich, England. 2000)培养，在不同的时间点收菌取样，观察4F和M145在不同温度的生长速率。
图5显示了定量研究放线紫红素的产生情况，同等数量的M145孢子和4F接合子在不加KH2POjP CaCl2的R2YE液体培养基发酵培养，Iml培养液在不同的时间点测量OD值。图6显示了 4F的发酵产物进行LC-MS分析，观察氨茴霉素的质量峰。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究和筛选，找到了一种快速生长的中度嗜温的高温链霉菌，该链霉菌能够进行遗传转化，可以成功表达外源的基因或基因簇。所述的链霉菌的生长速度约是天蓝色链霉菌的2倍，且是中度嗜温的高温链霉菌，具有良好的生产应用价值。如本文所用，所述的“基因簇”指多个基因排列(如串联)而成的基因组合，该多个基因在功能上密切相关，通常一个基因簇含有1-100个基因。如本文所用，所述的“中度嗜温的链霉菌”指能在30-50°C (较佳的37-50°C ；更佳地37-45 °C )生长的链霉菌。如本文所用，所述的“代时”指链霉菌在对数生长期菌体量倍增一次所需要的平均时间，数值上与该链霉菌细胞复制周期的平均时间长度相同。通常以小时为单位。如本文所用，所述的“抗生素”是具有抑制微生物生长和繁殖，甚至杀死微生物功能的一种化学物质。抗生素应用广泛，除了用于抑制微生物，有的还可抑制肿瘤细胞、酶，或可降低胆固醇等。抗生素的来源包括细菌、放线菌、霉菌、真菌等微生物，植物，动物。此外，也可用全化学或半化学的方法来生产抗生素。如本文所用，所述的“外源基因(簇)”与“异源基因(簇)”可互换使用，都是指非链霉菌本身自带的基因(簇)。所述的外源基因或基因簇是常温和高温来源的。链霉菌链霉菌是微生物中抗生素产生的主要类群，但是常温链霉菌常常生长缓慢，工业生产过程中往往需要较长的发酵周期周)，与大肠杆菌芽孢杆菌相比消耗更多的能量和材料。鉴于现有的常温链霉菌生长缓慢的问题，本发明人进行了反复研究和筛选，从而获得了快速生长(两倍快于天蓝色链霉菌)的中度嗜温的高温链霉菌。利用所述的链霉菌可成功表达来自于高温和常温链霉菌的基因簇。因此，本发明提供了一种链霉菌，该链霉菌是中度嗜温的链霉菌，能在30-50°C生长，其在45°C的生长代时为小于2小时；较佳地为小于1. 5小时；更佳地为1. 1小时。在另一优选例中，所述链霉菌在50°C的生长代时为小于2. 5小时；较佳的为小于 2. 4小时；更佳地为2. 3小时。本发明人在研究中发现了 2个较佳的高温链霉菌2C和4F。很多链霉菌的选择标记和载体都可以在这两个菌株中使用。用链霉菌标准的原生质体制备再生和转化程序，发现2C具有很高的转化效率。2C对于来源于链霉菌的外源双链DNA几乎没有限制性，而4F 具有强的限制修饰作用。因此，作为本发明的优选方式，所述的链霉菌在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC M 2010092 GF)。更佳地，所述的链霉菌的16s rRNA序列如SEQ ID N0:1所示； 或所述的链霉菌的染色体复制起始区序列(ori序列)如SEQID NO 3所示。在一个优选例中，所述链霉菌4F具有下列生理特征可以在30_50°C的温度范围内生长，属于中度嗜热链霉菌。4F在37°C和45°C的MS培养基上可以在20小时就开始产孢，在MS固体培养基上生长速度要比中温链霉菌在30°C和37°C生长得要快。作为本发明的优选方式，所述的链霉菌在中国典型培养物保藏中心的保藏号是2C CCTCC M 2010091 (2C)。更佳地，所述的链霉菌的16s rRNA序列如SEQID NO 2所示；或所述的链霉菌的染色体复制起始区序列(ori序列)如SEQ IDNO 4所示。所述的链霉菌可用于作为宿主系统，表达外源基因或基因簇。本发明对于外源基因没有特别的限制，只要其能够被链霉菌表达。此外，外源基因还包括其变体，该变体表达的蛋白与该外源基因表达的蛋白具有相同的功能。其通过插入或删除部分碱基，进行随机或定点突变等来获得。质粒本发明还包括从所述的高温链霉菌中分离得到的线型质粒或环型质粒。本发明人从分离得到多株高温链霉菌中检测到了多个线型质粒或环型质粒，经测序这些质粒与常温链霉菌已知的质粒有较高的同源性。脉冲电泳检测到了染色体条带，显示染色体为线型构型。用保守的端粒复制相关基因扩增显示25个中的11个是保守的端粒， 这个比率与常温链霉菌的情况类似。pTSCl复制子能够在常温链霉菌和高温链霉菌中正常复制，而且来自于常温链霉菌的质粒PlJlOl，pFRL2，pFPl和pFPll也能够很好的在高温链霉菌中复制。重组的宿主系统及表达基于本发明的新发现，本发明还提供了一种重组的宿主系统，所述宿主系统包括本发明所述的链霉菌，以及包含于所述链霉菌中的外源基因或基因簇。所述的外源基因或基因簇整合于所述的链霉菌的基因组上；或者所述的外源基因或基因簇包含于重组载体中，所述重组载体包含于所述链霉菌中。较佳地，所述的重组的宿主系统可用于抗生素的生产。抗生素通常是一种化学物质(次生代谢物质，小分子化合物)，其可以通过生物工程方法进行生产。采用培养微生物的方法生产抗生素一般需要微生物细胞表达出目的抗生素生物合成途径相关的一系列酶， 通过酶的催化，将细胞内特定代谢前体经过相应的抗生素代谢途径合成目的抗生素。本发明人出乎意料地发现，本发明的链霉菌在导入外源的抗生素生物合成基因簇后，可良好地表达合成目的抗生素所需要的生物合成酶，由于本发明的链霉菌生长速度快的特点，可以显著的缩短抗生素的发酵周期，从而更快地、高效地生产抗生素。所述的抗生素可以是由链霉菌或放线菌发酵生产的各种抗生素。作为本发明的优选方式，所述的抗生素选自但不限于氨茴霉素，放线紫红素，有效霉素，林可霉素，红霉素， 土霉素，金霉素，四环素，碳霉素，竹桃霉素，麦迪霉素，特曲霉素，制霉菌素，两性霉素，博莱霉素，雷帕霉素，替考拉宁，万古霉素，去甲金霉素，多黏菌素B，达托霉素，妥布霉素，链霉素，奈替米星，阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，链霉素，普那霉素，多拉菌素，阿维菌素等。应理解，尽管实施例列举了利用本发明的链霉菌生产氨茴霉素、放线紫红素的实例，然而本领域人员知道不同抗生素的形成机制和生产方法是类似的，因此很显然本发明的链霉菌也可用于其它抗生素的生产。表达外源基因或基因簇培养本发明的重组宿主系统(重组链霉菌)，使之表达外源基因或外源基因簇的方法可以参照本领域链霉素培养(或发酵)的常规方法，本发明没有特别的限制。
作为本发明的一种实施方式，提供一种生产抗生素的方法，包括将常温和高温来源的抗生素合成基因簇转化进入本发明的链霉菌，进而获得转化的链霉菌。将该转化的链霉菌在培养基中培养，再用培养后的转化链霉菌发酵获得目的抗生素。这为异源表达提供了一个可以在高温下生长的宿主菌平台。在链霉菌中导入外源基因或基因簇的方法也是本领域人员了解的，本发明没有特别的限制。较佳地，提供一种在链霉菌中转化入外源基因或基因簇的方法，包括制备链霉菌的原生质体，通过大肠杆菌接合转移的方法将含有所述外源基因或基因簇的载体转入链霉菌中，使其能够稳定复制并且表达转入的基因或基因簇。本发明的主要优点在于(1)找到了一种快速生长的中度嗜温的高温链霉菌，其生长速度2倍快于天蓝色链霉菌，可成功表达外源基因或基因簇；并且，当用于表达外源基因或基因簇时，可有效缩短发酵周期。(2)本发明的高温链霉菌可良好地、高效地生产抗生素，且可以在高温下生产，具有极大的生产应用价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法菌株、质粒、实验方法本发明涉及的菌株和质粒列出于表1中。表 权利要求
1.一种链霉菌，其特征在于，该链霉菌是中度嗜温的链霉菌，能在30-50°C生长，其在 45°C的生长代时为小于2小时。
2.如权利要求1所述的链霉菌，其特征在于，所述的链霉菌的16srRNA序列如SEQ ID NO :1所示；或所述的链霉菌的染色体复制起始区序列如SEQ ID N0:3所示。
3.如权利要求1所述的链霉菌，其特征在于，所述的链霉菌在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC M 2010092。
4.如权利要求1所述的链霉菌，其特征在于，所述的链霉菌的16srRNA序列如SEQ ID N0:2所示；或所述的链霉菌的染色体复制起始区ori序列如SEQ ID N0:4所示。
5.如权利要求1所述的链霉菌，其特征在于，所述的链霉菌在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC M 2010091。
6.权利要求1-5任一所述的链霉菌的用途，用于作为宿主系统表达外源基因或基因簇。
7.—种重组的宿主系统，其特征在于，所述宿主系统包括权利要求1-5任一所述的链霉菌，以及包含于所述链霉菌中的外源基因或基因簇。
8.如权利要求7所述的重组的宿主系统，其特征在于，所述的外源基因簇是抗生素基因簇。
9.如权利要求8所述的重组的宿主系统，其特征在于，所述的抗生素是由链霉菌或放线菌产生的抗生素。
10.如权利要求8所述的重组的宿主系统，其特征在于，所述的抗生素选自氨茴霉素， 放线紫红素，有效霉素，林可霉素，红霉素，土霉素，金霉素，四环素，碳霉素，竹桃霉素，麦迪霉素，特曲霉素，制霉菌素，两性霉素，博莱霉素，雷帕霉素，替考拉宁，万古霉素，去甲金霉素，多黏菌素B，达托霉素，妥布霉素，链霉素，奈替米星，阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，链霉素，普那霉素，多拉菌素，阿维菌素。
11.一种表达外源基因或基因簇的方法，其特征在于，包括培养权利要求7-10任一所述的重组的宿主系统，使之表达外源基因或基因簇。
全文摘要
本发明涉及表达抗生素基因簇的载体宿主系统及其应用。本发明人找到了一种快速生长和中度嗜温的高温链霉菌，该链霉菌能够进行遗传转化，可以成功表达外源的基因或基因簇。所述的链霉菌的生长速度显著快于天蓝色链霉菌，且是中度嗜温的高温链霉菌，具有良好的生产应用价值。
文档编号C12N15/76GK102277310SQ20101020033
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者覃重军, 陈威华 申请人:中国科学院上海生命科学研究院