专利名称：藏羚羊-牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法
技术领域：
本发明涉及一种种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，尤其涉及藏羚 羊-牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法。
背景技术：
哺乳动物体细胞核移植技术是指将供体细胞核放入预先去核的成熟卵母细胞内， 形成一个新的核质重组体，移入核在受体胞质作用下，发生发育程序重编，使核质重组体与 正常受精卵一样，经细胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体。体细胞核移植理论上 可以产生无限的克隆个体，有可能利用核移植技术克隆大量的珍稀濒危动物。到目前为止， 世界上异种克隆成功的有印度野牛(Lanza et al.，2000)、东方盘羊(Loi et al.，2001)、 非洲野猫(G0mez et al.，2004)、灰狼(Kim et al.，2007)、阿尔卑斯野山羊(Folch et al.，2009)。它们的出生证明种间核移植在实践上是完全可行的，在野生动物保护、珍稀动 物和濒危动物的拯救中可发挥其重要作用。藏羚羊(Pantholops hodgsoni)隶属于偶蹄目牛科山羊亚科藏羚属，青藏高原特 有物种，属国家一级保护动物和《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)中严禁进行贸 易活动的濒危动物，主要分布在中国境内的青海、西藏、新疆三省的高寒荒漠化草原、高寒 草原和高寒草甸地区，平均生活在海拔4100 5500m之间恶劣的环境中。由于环境因素导 致难以对藏羚羊进行深入研究，目前关于藏羚羊的研究主要以宏观动物学研究为主，包括 动物行为、种群分布、个体生物学、系统发生学、寄生虫、疾病的诊断和治疗、羊绒的物理和 化学性质等。关于藏羚羊胚胎学、发育生物学、分子生物学和细胞生物学的研究较少。因此， 研究藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育可以推动藏羚羊细胞生物学、分 子生物学、胚胎学、保护生物学和发育生物学的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可获得高活力胚胎的藏羚羊_牛种间体 细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法。为解决上述问题，本发明所述的一种藏羚羊-牛种间体细胞核移植胚胎的构建与 体外发育方法，包括以下步骤(1)卵巢的采集将刚屠宰的牛的卵巢剪取后，放入装有生理盐水、温度为20 25°C的保温瓶中，然后抽取牛卵巢表面上直径2 8mm间的卵泡；抽取的卵泡液用其1 2 倍体积的拣卵液稀释后，拣取卵泡液中卵丘-卵母细胞复合体；(2)卵母细胞的体外成熟培养将所述步骤(1)所得的卵丘_卵母细胞复合体用 成熟液清洗后，在饱和湿度二氧化碳培养箱中成熟培养20 24h，得到成熟卵母细胞；(3)成熟卵母细胞的手导式去核将所述步骤(2)所得的成熟卵母细胞经卵丘 颗粒细胞去除、卵母细胞化学显核、透明带的消化、卵母细胞去核后，得到去核受体卵母细 胞；
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(4)供体细胞准备与细胞融合将培养在24孔板中的供体细胞与所述步骤(3)所 得的去核受体卵母细胞采用化学辅助融合法进行细胞融合，得到种间克隆胚胎；(5)种间克隆胚胎激活与体外培养将所述步骤(4)所得的种间克隆胚胎在T20 微滴中平衡20 30min，待一个供体细胞和两个去核受体卵母细胞全部融合后，在胚胎培 养液中平衡3h ；然后将所述种间克隆胚胎置于ImL含钙离子载体(Ca ionophore)的溶液 中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养5min ；再将所述种间克隆胚胎转移至微滴体积为 IOyL的6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养4. 5h后完成 藏羚羊_牛种间克隆胚胎的激活；将藏羚羊_牛种间克隆胚胎激活后放入装有0. 5mL胚胎 培养液的4孔板底部的微穴中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内进行培养即可。所述步骤(1)中的牛卵巢是指牦牛、黄牛、奶牛中的任意一种的卵巢。所述步骤(1)中的拣卵液是由占总溶液体积的3%的新生牛血清(NBS)和97%的 杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)组成。所述步骤(2)中的成熟液是由占总溶液体积的10%的胎牛血清(FBS)和90%的 含 0. 22g/100mL NaHCO3 的 TCM199 基础培养液及 0. 22mg/100mL 的丙酮酸钠、238mg/100mL 的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、75 μ g/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素、10 μ g/mL的卵泡 刺激素(FSH)、20 μ g/mL的促黄体生成激素(LH)、1 μ g/mL的17 β雌二醇(17- β E2)组成。所述步骤(2)中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为38. 5°C、含5% CO2的饱 和湿度空气的二氧化碳培养箱。所述步骤(4)中的供体细胞为藏羚羊耳部组织的成纤维细胞。所述步骤(5)中的胚胎培养液是由0. 6294g/100mL的NaCUO. 0534g/100mL的 KC1、0. 0162g/100mL 的 ΚΗ2Ρ04、0· 0251g/100mL 的 CaCl2 · 2Η20、47 μ L/100mL 的乳酸钠 (Sodium lactate)、0· 01g/100mL 的 MgCl2 · 6Η20、0· 2106g/100mL 的 NaHC03、0. 0033g/100mL 的丙酮酸钠(Sodium pyruvate),0. 0146g/100mL 的 L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、 2mL/IOOmL的必需氨基酸、lmL/100mL的非必需氨基酸、0. 8g/100mL的牛血清白蛋白(BSA)、 0. 005g/100mL 的庆大霉素和 0. 001g/100mL 的酚红(Phenol-red)组成。所述步骤(5)中的T20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羟 乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值 至7. 2 7. 4的溶液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明选择青藏高原特色动物——藏羚羊作为研究对象，以藏羚羊皮肤成纤维 细胞作为供体细胞，牛卵母细胞作为受体胞质，利用无透明带手导式克隆技术进行藏羚羊 种间体细胞核移植胚胎的构建，建立了克隆胚胎的微穴式培养方法，探索了以牛卵母细胞 作为受体胞质进行藏羚羊克隆的可行性，为动物克隆技术应用于藏羚羊的保护奠定了基 石出。2、由于本发明在无透明带卵母细胞与体细胞融合技术上，采用了化学辅助融合方 法，因此，不但简化了操作技术，缩短了操作时间，而且有效提高了细胞融合效率。3、由于本发明采用了无透明带手导式克隆技术，因此，不需要贵重设备，减少了实 验室投入，简化了操作技术，适合于西北地区开展。4、由于本发明采用了微穴式胚胎培养系统，因此，有利于建立适合无透明带胚胎生长的微环境，从而提高了种间克隆胚胎的发育能力。5、运用本发明方法对分别采集的257个牦牛、808个黄牛和722个奶牛的卵巢进 行抽吸后，得到卵子数分别为1177个、3066个、3694个，每卵巢平均得卵数分别为4. 58个、 3. 79 个、5. 11 个，其卵母细胞成熟率分别为 67. 94% ±4. 1%,85. 07% ±2.2%,69. 43% 士 1.8%;牦牛、黄牛、奶牛的去核卵数分别为344个、479个、249个，复圆卵数分别为302个、 321 个、211 个，复圆率分别为 87. 79%,67. 01%,84. 73%。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明所获得的藏羚羊_牦牛种间体细胞核移植胚胎。图所显示的是两个 去核的牦牛卵母细胞与一个藏羚羊体细胞经化学辅助融合后10分钟，经Hoechst 33342染 色显示细胞核的位置在荧光显微镜下所拍摄的重构胚形态，两个卵母细胞中间发亮的点为 供体细胞核。放大倍数为100倍。图2为本发明藏羚羊_牦牛种间体细胞核移植胚胎在微穴培养系统中体外培养 72h的发育情况。图所显示的是两个去核的牦牛卵母细胞与一个藏羚羊体细胞经化学辅助 融合后，用化学方法激活，在微穴培养系统中培养72h所产生的16 32细胞胚胎。放大倍 数为40倍。
具体实施例方式材料牛卵巢采集于青海省西宁市乐家湾屠宰场。一种藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，包括以下步骤(1)卵巢的采集将刚屠宰的牛的卵巢用灭菌剪刀剪取后，放入装有生理盐水、温 度为20 25°C的保温瓶中，3h内运回实验室。剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输 卵管，用生理盐水清洗3次；然后用20mL的一次性塑料注射器抽取牛卵巢表面上直径2 8mm间的卵泡；抽取的卵泡液用其1 2倍体积的拣卵液稀释后，在体视镜下拣取卵泡液中 卵丘-卵母细胞复合体。其中拣卵液是由占总溶液体积的3%的新生牛血清(NBS)和97%的杜氏磷酸缓 冲液(D-PBS)组成。(2)卵母细胞的体外成熟培养将步骤(1)所得的卵丘_卵母细胞复合体用预先 在饱和湿度二氧化碳培养箱内平衡的成熟液清洗2次，以便去除杂质；然后，在饱和湿度二 氧化碳培养箱中成熟培养20 24h，得到成熟卵母细胞。其中成熟液是由占总溶液体积的10 %的胎牛血清(FBS)和90 %的含 0. 22g/100mL NaHCO3 的 TCM199 基础培养液及 0. 22mg/100mL 的丙酮酸钠、238mg/100mL 的 羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、75 μ g/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素、10 μ g/mL的卵泡刺 激素(FSH)、20 μ g/mL的促黄体生成激素(LH)、1 μ g/mL的17 β雌二醇(17-β E2)组成。(3)成熟卵母细胞的手导式去核将所述步骤(2)所得的成熟卵母细胞经卵丘颗 粒细胞去除、卵母细胞化学显核、透明带的消化、卵母细胞去核后，得到去核受体卵母细胞。其中卵丘颗粒细胞去除是指将成熟卵母细胞移至装有0. 5mL透明质酸酶的离心 管中，用移液枪轻轻吹打2min，吹打完毕后再漩涡震荡2min。此时培养皿中卵母细胞透明带外围的卵丘颗粒细胞已经移除。卵母细胞化学显核是指将卵母细胞置于400 μ L含有20 μ L脱羰秋水仙碱(Sigma D 1925)的卵母细胞成熟液内，然后在饱和湿度培养箱内培养2h。培养完毕后将卵母细胞 从培养液中取出，用T20(HEPES缓冲的TCM199添加20%胎牛血清)清洗干净，备用。透明带的消化是指将卵母细胞放置T20微滴内，再移至50 μ L链酶蛋白酶微滴内， 消化透明带3 5min，待透明带全部消化以后，将无透明带卵母细胞放置在T20微滴内，稳 定 15min。卵母细胞去核是指在T20中添加浓度为5 μ g/mL的细胞松弛素，然后在35mm培 养皿内加入2mLT20溶液充当切卵液。将无透明带的卵母细胞转移至培养皿内，排成一列， 然后以第一极体和无透明带卵母细胞表面凸起为标识，用去核刀将第一极体和表面凸起切 掉。切掉部分为整个卵母细胞的1/3大小，另外一部分无核的卵母细胞质转移至T20中，恢 复15min，待其完全复圆后进行细胞融合。(4)供体细胞准备与细胞融合将培养在24孔板中的供体细胞——藏羚羊耳部组 织的成纤维细胞(中国科学院西北高原生物研究所提供)与步骤(3)所得的去核受体卵母 细胞采用化学辅助融合法进行细胞融合，得到种间克隆胚胎(参见图1)。其中供体细胞——藏羚羊耳部组织的成纤维细胞采用如下方法获得①采样取样时，先用灭菌的剪刀剪掉雌性成年藏羚羊个体的耳部毛发，再用剃须 刀片尽可能的剔除残留的发根。然后用香皂、蒸馏水、新洁尔灭、生理盐水、75%酒精、D-PBS 依次清洗，最后剪取Icm2皮肤组织，并将其放入已装有贮存液的50mL离心管中。②藏羚羊耳部皮肤组织原代培养将藏羚羊耳部皮肤组织用含有双抗的D-PBS浸 洗5次，每次浸泡3min ；再用含有双抗的D/F12培养液冲洗3遍后，将样本组织块放入35mm 培养皿中，用剪刀尽量将组织块剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的 培养瓶中，均勻地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶慢慢翻转，倒置放在饱和湿度二氧化碳 培养箱中，3h后轻轻翻转培养瓶，加入3 5mL D/F12培养液继续培养10 18天，得到生 长至80% 90%汇合的原代细胞。③传代与纯化将原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用无Ca2+、Mg2+的PBS 清洗2次，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0. 01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化， 得到消化液A(消化液A以铺满培养瓶底为宜)；将消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养 箱2 3min，取出，在显微镜下观察消化情况，轻轻敲打底部，然后加入与消化液A等量的 D/F12培养液终止消化，得到消化液B ；将消化液B转移至离心管中以1000转/分钟离心 5min,去上清液后，得到细胞沉淀物A ；用D/F12培养液将细胞沉淀物A轻轻混勻，传入另一 个培养瓶中，在饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3 6天，得到生长至80% 90%汇 合的皮肤成纤维细胞，该皮肤成纤维细胞呈梭型。④细胞冻存将皮肤成纤维细胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0. 01%乙二胺四 乙酸(EDTA)的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混勻，先在4°C保存半小时，然后将细胞 冻存盒直接放入-70°C冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞。⑤细胞复苏将装有冻存皮肤成纤维细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入37°C 水浴中融化，吸出细胞悬液放于15mL离心管中，用9倍所述细胞悬液体积的D/F12培养液进行洗涤后，以1000转/分钟离心5min，去上清后，得到细胞沉淀物B ；用D/F12培养液充 分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可。上述步骤②、③和⑤中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为37. 5°C、含5% CO2 的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱；D/F12培养液均是由占总培养液体积的10%的胎牛血 清、90%的D/F12和双抗组成。上述步骤①中的贮存液为加入双抗的T20 ；加入双抗的T20是由占总溶液体积的 20%的胎牛血清和80%的含IOmM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置 后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7. 2 7. 4的溶液。上述步骤②中的杜氏磷酸缓冲液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 0203g/100mL的 KCl、0· 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 ΚΗ2Ρ04、0· 0134g/100mL 的 CaCl2 · 2H20、 0. 01g/100mL 的 MgCl2 · 6Η20、0· 0036g/100mL 的丙酮酸钠、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的链霉素和0. lg/IOOmL的葡萄糖组成。上述步骤③中的磷酸盐缓冲液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 02g/100mL的KC1、 0. 115g/100mL 的 Na2HPO4 和 0. 02g/100mL 的 KH2PO4 组成。上述步骤④中的冻存液是由占总溶液体积的20%的胎牛血清、10%的二甲基亚 砜、70 %的D/F12和双抗组成。 上述双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。化学辅助融合法是指首先，将供体细胞培养在24孔板中；核移植时选择培养孔内底部全部长满的细胞 作为供体细胞。每次消化1孔细胞，然后将少量细胞移入到T2B(HEPES缓冲的TCM199液添 加2%胎牛血清，另添加8mg/mL BSA)的微滴中。其次，在60mm培养皿内按常规方法制作体积为25 μ L的融合微滴。然后依次将受体卵母细胞移至Τ20、植物血凝素、Τ2Β、融合液微滴内进行操作，微 滴上覆石蜡油，避免微滴蒸发和位置移动。先将受体卵母细胞移至Τ20微滴内，再移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴 内，然后转移到Τ2Β微滴中粘取一个供体细胞，再重新转移至植物血凝素微滴中，再从Τ20 微滴中移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴中，由于植物血凝素可使细胞表面具有粘 性，所以通过调整供体细胞与受体卵母细胞复合体和另一卵母细胞的位置，可形成两个卵 母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡2 3min后，再至融合槽 内以交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20 μ s，持续两次，每次间隔0. Is进行电融合即 可。本方法中的Τ20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羟乙基哌 嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7. 2 7. 4的溶液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。本方法中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基础培养液中所得 的溶液。本方法中的T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2 %的胎牛血清和 8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液。本方法中的融合液是指先用20mL蒸馏水溶解0. 025g MgSO4,过滤保存；再用20mL蒸馏水溶解0. 0147g CaCl2 · 2H20,过滤保存；将10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙烯醇充分溶解 于196mL蒸馏水中，然后向其分别加入2mL预先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液，过滤 后即得。(5)种间克隆胚胎激活与体外培养将步骤(4)所得的种间克隆胚胎在T20微滴 中平衡20 30min，待一个供体细胞和两个去核受体卵母细胞全部融合后，在胚胎培养液 中平衡3h;然后开始激活。先将种间克隆胚胎置于ImL含钙离子载体(Ca ionophore)的 溶液的35mm培养皿中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养5min ；再将种间克隆胚胎转移至 微滴体积为10 μ L的6- 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)中，微滴上覆石蜡油，每个微滴放入一个 克隆胚胎。然后将其在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养4. 5h后完成藏羚羊-牛种间克隆 胚胎的激活；将藏羚羊_牛种间克隆胚胎激活后放入装有0. 5mL胚胎培养液的4孔板底部 的微穴中，覆盖石蜡油，在饱和湿度二氧化碳培养箱内进行培养即可(参见图2)。其中胚胎培养液是由0. 6294g/100mL 的 NaCl、0. 0534g/100mL 的 KC1、 0. 0162g/100mL 的 ΚΗ2Ρ04、0· 0251g/100mL 的 CaCl2 · 2Η20、47 μ L/100mL 的乳酸钠(Sodium lactate)、0. Olg/IOOmL 的 MgCl2 ·6Η20、0. 2106g/100mL 的 NaHC03、0. 0033g/100mL 的丙酮酸 钠(Sodium pyruvate)、。· 0146g/100mL 的 L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、2mL/100mL 的必需 氨基酸、lmL/100mL的非必需氨基酸、0. 8g/100mL的牛血清白蛋白(BSA)、0. 005g/100mL的 庆大霉素和0. 001g/100mL的酚红(Phenol-red)组成。T20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羟乙基哌嗪乙磺酸的 TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7. 2 7. 4的溶 液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。本发明中的牛卵巢是指牦牛、黄牛、奶牛中的任意一种的卵巢。饱和湿度二氧化碳 培养箱是指温度为38. 5°C、含5% CO2的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。
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权利要求
一种藏羚羊-牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，包括以下步骤(1)卵巢的采集将刚屠宰的牛的卵巢剪取后，放入装有生理盐水、温度为20～25℃的保温瓶中，然后抽取牛卵巢表面上直径2～8mm间的卵泡；抽取的卵泡液用其1～2倍体积的拣卵液稀释后，拣取卵泡液中卵丘-卵母细胞复合体；(2)卵母细胞的体外成熟培养将所述步骤(1)所得的卵丘-卵母细胞复合体用成熟液清洗后，在饱和湿度二氧化碳培养箱中成熟培养20～24h，得到成熟卵母细胞；(3)成熟卵母细胞的手导式去核将所述步骤(2)所得的成熟卵母细胞经卵丘颗粒细胞去除、卵母细胞化学显核、透明带的消化、卵母细胞去核后，得到去核受体卵母细胞；(4)供体细胞准备与细胞融合将培养在24孔板中的供体细胞与所述步骤(3)所得的去核受体卵母细胞采用化学辅助融合法进行细胞融合，得到种间克隆胚胎；(5)种间克隆胚胎激活与体外培养将所述步骤(4)所得的种间克隆胚胎在T20微滴中平衡20～30min，待一个供体细胞和两个去核受体卵母细胞全部融合后，在胚胎培养液中平衡3h；然后将所述种间克隆胚胎置于1mL含钙离子载体的溶液中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养5min；再将所述种间克隆胚胎转移至微滴体积为10μL的6-二甲基氨基嘌呤中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内培养4.5h后完成藏羚羊-牛种间克隆胚胎的激活；将藏羚羊-牛种间克隆胚胎激活后放入装有0.5mL胚胎培养液的4孔板底部的微穴中，在饱和湿度二氧化碳培养箱内进行培养即可。
2.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，其 特征在于所述步骤(1)中的牛卵巢是指牦牛、黄牛、奶牛中的任意一种的卵巢。
3.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，其 特征在于所述步骤(1)中的拣卵液是由占总溶液体积的3%的新生牛血清和97%的杜氏 磷酸缓冲液组成。
4.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法， 其特征在于所述步骤(2)中的成熟液是由占总溶液体积的10%的胎牛血清和90%的含 0. 22g/100mL NaHCO3 的 TCM199 基础培养液及 0. 22mg/100mL 的丙酮酸钠、238mg/100mL 的 羟乙基哌嗪乙磺酸、75 μ g/mL的青霉素、ΙΟΟμ g/mL的链霉素、10μ g/mL的卵泡刺激素、 20 μ g/mL的促黄体生成激素、1 μ g/mL的17 β雌二醇组成。
5.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，其 特征在于所述步骤(2)中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为38. 5°C、含5% CO2的饱 和湿度空气的二氧化碳培养箱。
6.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，其 特征在于所述步骤(4)中的供体细胞为藏羚羊耳部组织的成纤维细胞。
7.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法， 其特征在于所述步骤(5)中的胚胎培养液是由0. 6294g/100mL的NaCl、0. 0534g/100mL 的 KC1、0. 0162g/100mL 的 ΚΗ2Ρ04、0· 0251g/100mL 的 CaCl2 · 2H20、47 μ L/lOOmL 的乳酸 钠、0. Olg/IOOmL 的 MgCl2 · 6H20、0. 2106g/100mL 的 NaHC03、0. 0033g/100mL 的丙酮酸钠、 0. 0146g/1 OOmL的L-谷氨酰胺、2mL/1 OOmL的必需氨基酸、ImL/1 OOmL的非必需氨基酸、 0. 8g/100mL的牛血清白蛋白、0. 005g/100mL的庆大霉素和0. 001g/100mL的酚红组成。
8.如权利要求1所述的藏羚羊_牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，其特征在于所述步骤(5)中的T20是由占总溶液体积的20%的胎牛血清和80%的含IOmM 羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH 值至7. 2 7. 4的溶液；其中双抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素。
全文摘要
本发明涉及一种藏羚羊-牛种间体细胞核移植胚胎的构建与体外发育方法，该方法以藏羚羊耳朵组织成纤维细胞作为供体细胞，以黄牛、奶牛或牦牛去核卵母细胞作为受体胞质，以无透明带手导式克隆技术构建藏羚羊-牛的种间体细胞核移植胚胎，采用化学辅助融合方法和微穴式胚胎培养系统，获得了高活力的藏羚羊-牛种间体细胞核移植胚胎，为动物克隆技术应用于藏羚羊的保护奠定了基础。
文档编号C12N15/877GK101880689SQ201010200550
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者于鸿浩, 徐世晓, 曹俊虎, 赵新全, 郭志林, 郭松长 申请人:中国科学院西北高原生物研究所