专利名称：一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药用重组人白细胞介素-Ii的制备方法。属于生物技术领域。
背景技术：
人白细胞介素-11 (IL-Il)是一种存在于人体骨髓、神经、呼吸道及消化道上皮等 多种组织，具有广泛生理功能的细胞因子，特别是其对造血系统的作用而使其具有重要的 临床价值。目前，重组人IL-Il (Neumega , Genetics Institute)已于1997年11月被 FDA批准正式上市，其适应症为化疗引起的血小板减少，成为了目前用于治疗化疗引起的血 小板减少症的唯一首选药物。IL-11是在20世纪80年代末才被发现的，其发现源自骨髓基质细胞株PU-34的培 养液能刺激过量IL-6抗体中和的T1165细胞株的生长。1990年，Paul SR等克隆到完整的人 IL-IlcDNA，此后其结构与功能被逐渐揭示。人IL-Il的基因位于19号染色体ql3. 3-13. 4 区，全长为7Kb，含5个外显子和4个内含子。人IL-llcDNA编码199个氨基酸的多肽，N端 21个aa组成信号肽，成熟蛋白由178个aa残基组成。成熟蛋白中无半胱氨酸残基，因而无 分子内和分子间二硫键的结构，并且也没有潜在的糖基化位点，同时其Pl值高达11. 7,与 功能相关的自细胞介素6无DNA水平的同源。IL-Il主要由间充质来源的粘附细胞(如骨髓基质细胞、基质成纤维细胞、胚肺成 纤维细胞等)产生。IL-Il是生长因子家族成员，所述家族包括生长激素、G-CSF和其他生 长因子。IL-Il也是细胞因子家族成员，所述家族包括IL-6、白血病抑制因子(LIF)、制瘤 素M(OSM)和睫状神经营养因子(CNTF)，它们均通过共同受体亚基gpl30传递信号。随着 研究的深入，人们发现IL-Il是一种多功能的细胞因子，具有广泛的生物学活性。IL-Il主 要的生物学功能是对造血系统各系细胞增殖的刺激与促进作用。例如，IL-Il与一些在细 胞增殖分化不同阶段先后发挥作用的细胞因子(包括IL-3、IL-4、SCF、GM-CSF等)协同作 用，刺激多能造血干细胞、多能定向干细胞和单能定向干细胞的增殖；IL-Il单独使用或与 其它细胞因子协同，对红细胞生成的多个阶段均有刺激作用；对髓系祖细胞的分化成熟及 B淋巴细胞的发育也有促进作用；IL-Il对巨核细胞和血小板生成的不同阶段均有刺激作 用，不仅使巨核细胞集落数及大小增加，而且可提高外周血血小板的数量。此外，在不同动 物模型中还观察到IL-Il对一些非造血组织也具有一定的生物学效应，例如在脑、脊神经 元、肠道及睾丸组织中能检测到IL-Il的表达；调节肠上皮细胞的生长；抑制脂质形成；诱 导急性期反应蛋白的合成；刺激破骨细胞的发育以及神经祖细胞的增殖等。血小板对于在受伤部位维持止血和起始血凝块的形成中的作用非常重要。在血小 板减少症的患者中，无法形成血凝块是最直接的后果，严重的血小板减少症导致典型模式 的出血，重度胃肠道和中枢神经系统出血可能是致命的。如果血小板形成过程中的某一步 骤受干扰而导致无法形成血小板、血小板分布异常、血小板损坏增加和/或损耗增加，就会 表现为血小板减少症。引起血小板减少症的因素可分为先天性的和获得性的，例如先天性 无巨核细胞增生；细胞毒性的化学药物治疗等。血小板减少症是肿瘤放化疗法的潜在致命性并发症在IL-11的生物学活性中，最为突出和重要的是剂量依赖性升高外周血血小板的 数量，提示了 IL-11的重要的临床价值，即可能是一种治疗血小板减少症的药物。自IL-11 被发现后，美国Genetics Institute就开始了重组人IL-11 (rhIL-11)的研发工作，经过6 年多的临床前和临床研究，于1997年获FDA批准上市，商品名为Neumega，用于治疗肿瘤放 化疗引起的血小板减少症，替代血小板输注。如本领域普通技术人员理解的，目前国内外多采用大肠杆菌(如中国专利 99112322. 0,99125600. X)和酵母(如中国专利200710162970. 1)表达系统来生产IL-11产 品。就表达系统本身而言，大肠杆菌和酵母表达系统各有其优缺点。然而，就无分子内/分 子间二硫键、无潜在糖基化位点的人IL-11而言，用酵母表达时会出现糖基化，糖基化程度 不易控制，同时，相对于大肠杆菌表达系统，酵母表达系统的发酵周期长，工艺难度大，成本 高，工艺稳定性差；用大肠杆菌表达，表达量高，利于纯化。大肠杆菌表达系统因其表达量 高，工艺简单，成本低廉，所以目前国内外大多采用大肠杆菌表达系统表达人IL-11。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种药用重组人白细胞介素-11的 制备方法，本发明具有工艺简单，表达量高，稳定性好，产品均一，生产成本低，环保，活性高 的特点，且提高药品的安全性、可控性和有效性，适用于工业化生产。为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，采用下述制备步骤1)对白细胞介素-ll(rhlL-ll)中融合蛋白的初步纯化，包括菌体破碎和鳌合柱 分离步骤；2)含白细胞介素-ll(rhlL-ll)的融合蛋白的肠激酶(EK酶)酶切；3)白细胞介素-11 (rhIL-11)的精细纯化，包括MacroCap SP柱层析和S-75柱层 析，得到药用重组人白细胞介素-11。所述的步骤1)中鳌合柱分离步骤的洗脱条件采用50mMTris-Cl，285-325mM的咪 唑，吐温80梯度洗脱。所述的步骤2)中肠激酶配方如下50mMTris-Cl，pH8. 0+500mMNaCl，体积百分比 含量为50%的甘油。所述的步骤2)中酶切采用的pH值为6-10的缓冲体系，体系中含有乙醇或DMS0 有机溶剂，且含有金属离子作为激活剂。所述的pH值优选为7-9。所述的pH值更优选为8. 0。所述的金属离子采用K+或Ca+。所述的K+浓度为5-8mM ；Ca+浓度为l_2mM。所述的乙醇的体积百分比含量为5-20%，DMS0的体积百分比含量为_15%。所述的乙醇含量优选为5-8%，DMS0含量优选为1_5%。本发明的有益效果是本发明采用了先进的鳌合柱洗脱条件，融合蛋白高压破碎 后过金属螯合柱后的一步纯化就可获得90%左右的纯度。还有本发明采用了自制的高纯度的重组肠激酶，肠激酶质量可控，无热源和动物源蛋白污染，批次间重复性好。并且本发 明找到了优化的酶切条件，在pH8. 0时，含K2+在5-50mM或Ca2+l_2mM，乙醇5_8%或DMSO 1-5%条件下对IL-Il融合蛋白酶切得率可达80%以上。所以按本发明路线生产的IL-Il 的N端及C端完整，产品均一，活性高，环保，为产品的使用的安全性及有效性提供保障。
图1是本发明重组人IL-Il金属离子对融合蛋白酶切影响SDS-PAGE图谱；图2是本发明重组人IL-Il有机溶剂对融合蛋白酶切影响SDS-PAGE图谱；图3是本发明重组人IL-Il原液非还原SDS-PAGE图谱；图4是本发明重组人IL-Il原液还原SDS-PAGE图谱；图5是不本发明重组人IL-Il产品纯度检测(SEC-HPLC)图谱。
具体实施例方式下面通过具体实施例，对本发明作进一步的描述。实施例1DrhIL-Il的初步纯化a.菌体破碎菌体按 1 10(w/v)比例，用 50mM Tris+500mMNaCl，pH8. 0 缓冲液 重悬。少量时可采用超声波破碎，大量时采用高压破碎。采用100-900Psi压力对悬浮于破 碎液的菌体进行了离心上清液的比较。结果表明200Psi有较高的收率和较高的纯度。b.鳌合柱分离根据融合蛋白中存在MB残基的特点，选用了 Chelating Sepharose FF作用初步纯化的填料。采用IOOmM的咪唑洗去杂蛋白，目的蛋白洗脱条件采 用50mMTris-Cl，285-325mM的咪唑，吐温80梯度洗脱，纯化结果表明，该步纯化一步纯 化就能使目标融合蛋白的纯度高达90%以上，达到了可用于酶切的目的要求。同时，也去除 了对EK酶的大量抑制物。2)含rhIL-11的融合蛋白的肠激酶酶切EK酶酶切采用高纯度的重组EK酶，EK酶配方如下50mMTris_Cl， pH8. 0+500mMNaCl,50% (V/V)甘油。对酶切条件进行了研究，采用了 20°C的温度防止融合 蛋白发生沉淀。a.通过对EK酶切的pH梯度条件摸索，在20°C条件下，采用50mM的Tris-Cl，pH5-9 的酶切体系进行酶切试验，结果表明，在PH7-9的范围内酶切效果比较理想，酶切最适pH为 8.0的体系。b.考察了该缓冲体系下各种金属离子对酶切的影响试验，其中K2+、Ca2+对酶活 性具有促进作用，Zn2+具有抑制作用。并考察了 K2+在5-200mM范围内、Ca2+在l-30mM范 围内浓度梯度对酶活性的影响，K2+在5-50mM，Ca2+l-2mM酶活性最好，然后对K2+、Ca2+对 融合蛋白酶切影响做SDS-PAGE，如图1所示，图1是本实施例重组人IL-Il金属离子对融 合蛋白酶切影响 SDS-PAGE 图谱，其中 Lanel-5 :K+浓度为 5mM，50mM，lOOmM，150mM，200mM ； Lane6-10Ca2+ 浓度为 ImM，2mM, IOmM, 20mM, 30mM ；Lane 11 control (未酶切对照)c.考察了有机溶剂对EK酶切的影响，对甲醇，乙醇，DMS0，正丙醇，乙腈，丙酮对酶 活性的影响。其中乙醇和DMSO对酶活力有意想不到的促进作用，甲醇对BEK的酶活力没有影响，而正丙醇、乙腈、丙酮对BEK具有一定的抑制作用。然后对乙醇和DMS0对融合蛋白 酶切影响做SDS-PAGE，如图2所示，图2是本实施例重组人IL-11有机溶剂对融合蛋白酶 切影响SDS-PAGE图谱，其中Lanel control (未酶切对照)，Lane2_6乙醇浓度为5%，8%， 10%, 15%,20% Lane7-11DMS0 浓度为 1 %，5%，8 %，20 %，15%，由图可知，乙醇在 5-20% 范围内，DMS01 % -15%范围内对酶切均有促进作用，其中以乙醇5-8%，DMS0在1_5%具有 意想不到的效果。本实施例采用在20°C条件下，50mM的Tris_Cl，pH8的条件下进行酶切步骤，激活 剂采用5-8mM K2+或l_2mM Ca2+，有机溶剂采用5_8%乙醇，1-5% DMS0。3) :rhIL-ll 的精细纯化(MacroCap SP 及 S-75 柱层析)利用rhIL-11有较高等电点的特点。在PH8. 0条件下过MacroCap SP柱，采用50mM PBNa，pH8. 0条件平衡MacroCap SP柱，上样，洗脱条件采用450mM PBNa,pH8. 0的高盐条件 洗脱目的蛋白，该步骤去除了绝大多数的杂蛋白，而使rh I L-11 一步得到了高效纯化，采 用10mM PBNa,pH8. 0平衡的Superdex-75柱上样并洗脱收集目标蛋白可以使纯化产品-药 用重组人白细胞介素-11的纯度达到99%。如图3，4，5所示，图3为纯化的rhIL-11蛋 白的非还原型SDS-PAGE电泳图，上样20ug蛋白，与上样控制带400ng(2)、200ng(l% )和 100ng(0. 5%)相比，无不可见的大于200ng(l% )的杂质，说明电泳纯度大于99%；图4为 纯化蛋白的还原型SDS-PAGE电泳图，上样20ug蛋白，与上样控制带400ng (2)、200ng(l % ) 和100ng(0. 5%)相比，无不可见的大于200ng(l% )的杂质，说明电泳纯度大于99%；图5 为纯化的rhIL-11蛋白的高效液相纯度图谱，积分统计结果见表1，表1中为高效液相纯度 图谱出现的4个峰的统计情况，其中RT为出峰的保留时间，Area为积分面积，% Area为各 峰的占总积分面积的百分比，Height为各峰的高度，从表1可以看出，表1为HPLC图谱的 积分统计情况，保留时间为13. 17min出现的rhIL-11目的峰占总液相积分面积的99. 33%, 说明rhIL-11的HPLC纯度大于99%。表 权利要求
一种药用重组人白细胞介素 11的制备方法，其特征在于采用下述制备步骤1)对白细胞介素 11中融合蛋白的初步纯化，包括菌体破碎和鳌合柱分离步骤；2)含白细胞介素 11的融合蛋白的肠激酶酶切；3)白细胞介素 11的精细纯化，包括MacroCap SP柱层析和S 75柱层析，得到药用重组人白细胞介素 11。
2.如权利要求1所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的步骤2)中鳌合柱分离步骤的洗脱条件采用50mMTris-Cl，285-325mM的咪唑，吐温 80梯度洗脱。
3.如权利要求1所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的步骤3)中肠激酶配方如下50mMTris-Cl，pH8. 0+500mMNaCl，体积百分比含量50%的 甘油。
4.如权利要求1所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的步骤3)中酶切采用pH值为6-10的缓冲体系，体系中含有乙醇或DMS0有机溶剂，且含 有金属离子作为激活剂。
5.如权利要求4所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的PH值为7-9。
6.如权利要求5所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的pH值为8.0。
7.如权利要求4所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的金属离子采用K+或Ca+。
8.如权利要求7所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的K+浓度为5-8mM ；Ca+浓度为l_2mM。
9.如权利要求4所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的乙醇的体积百分比含量为5-20%，DMS0的体积百分比含量为-15%。
10.如权利要求9所述的一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，其特征在于所 述的乙醇的体积百分比含量为5-8%，DMS0的体积百分比含量为1_5%。全文摘要
本发明公开了一种药用重组人白细胞介素-11的制备方法，采用下述制备步骤1)对白细胞介素-11中融合蛋白的初步纯化，包括菌体破碎和鳌合柱分离步骤；2)含白细胞介素-11的融合蛋白的肠激酶酶切；3)白细胞介素-11的精细纯化，包括Macro Cap SP柱层析和Superdex-75柱层析，得到药用重组人白细胞介素-11。本发明具有工艺简单，表达量高，稳定性好，产品均一，生产成本低，环保，活性高的特点，且提高药品的安全性、可控性和有效性，适用于工业化生产。
文档编号C12P21/06GK101892279SQ20101020121
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者孙黎, 王世媛, 郑建华, 郑成已 申请人:厦门特宝生物工程股份有限公司