专利名称：利用基因工程菌耦合发酵合成gdp-岩藻糖的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及基因工程菌株的构建技术，尤其是一种利用基因工程菌耦合发酵合成GDP-岩藻糖的方法。
背景技术：
牛乳尤其是婴儿配方奶粉作为一种高级食品，对新生儿的生长发育起到了举足轻 重的作用，但越来越多的临床研究表明母乳具有奶粉不可代替的生理功能。与非母乳喂养 相比，母乳喂养可大大降低胃肠感染、中耳炎、呼吸道感染、菌血症、脑膜炎、坏死性结肠炎 及其它泌尿系统疾病的发生率。母乳之所以能够有效降低新生婴儿的发病度和死亡数，主要归因于其含有抗感 染、抗炎症等多种免疫调节因子，主要包括分泌型抗体(SlgA)、寡糖、乳铁蛋白、白细胞、细 胞因子等。其中人乳寡糖其含量在乳糖、脂类之后，成为人乳中第三大物质。很多研究表明， 人乳寡糖不仅具有明显的抗感染和某些重要的非特异性免疫学功能，而且能促进婴儿消化 道中双岐杆菌的增殖，并使梭状芽胞杆菌和肠球菌的数量大大减少。人乳寡糖的抗病原菌 感染作用已被阐明。病原菌侵入机体的第一步也是关键步骤就是在粘膜上皮细胞的粘附， 其主要通过病原菌表在抗原与上皮细胞受体相结合。人乳寡糖的抗病原菌粘附功能引起了 人们的广泛关注，并且许多医药公司也开始进行以人乳寡糖及其类似物的抗粘附药物的开 发与临床研究。人乳寡糖的大量获得并不容易，近年来，化学法合成糖类物质已取得了较大进步， 已能够合成十个糖残基以上的寡糖，但由于合成路线的复杂以及糖苷供体的昂贵，大多数 工艺仍无法达到规模生产，目前，利用基因工程技术构造代谢工程菌是规模化制备人乳寡 糖最有前途的方法，但是，如何获得大量廉价的糖基供体对于寡糖的制备也是至关重要的， 人乳寡糖以岩藻糖基化寡糖为主，GDP-岩藻糖就是岩藻糖基化寡糖合成过程中一个重要的 中间产物，在寡糖合成途径中是一重要中间体，如何能快速制备GDP-岩藻糖也是制备寡糖 的一种重要过程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用基因工程菌耦合发酵 合成GDP-岩藻糖的方法，通过本方法所获得的基因工程菌株使得酶基因的拷贝数增加，酶 的表达量明显提高，作用于底物GDP-甘露糖合成GDP-岩藻糖效率很高。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种利用基因工程菌耦合发酵合成⑶P-岩藻糖的方法，步骤如下(1)基因扩增根据大肠杆菌K-12E. coli-K12基因组中⑶P-甘露糖4，6_脱水酶 和GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3，5-变旋酶/4-还原酶的序列设计引物，克隆出大肠杆菌中 的⑶P-甘露糖4，6-脱水酶和⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖3，5-变旋酶/4-还原酶基因；(2)重组质粒的构建用酶切连接的方法分别将上述两种目的基因与载体pET-22b相连，得到携带目的基因的重组表达载体，扩增后酶切验证，验证正确得到质粒 pET-22b-gmd 或 pET_22b_wcaG ；(3)基因工程菌株的构建将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株 BL21 (DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株BL21 (DE3) /pET_22b-gmd和BL21 (DE3) / pET_22b_wcaG ；
(4)混合发酵合成⑶P-岩藻糖将步骤(3)得到的两基因工程菌株于培养基中混 合发酵，在发酵过程中以IPTG为诱导剂，以GDP-甘露糖为底物合成GDP-岩藻糖。而且，所述步骤(2)中扩增采用的是将质粒转化到大肠杆菌DH5 α的感受态细胞 中扩增，扩增后酶切验证，正确后用于步骤(3)的转化。而且，所述步骤⑷培养基的组成成分为BL21 (DE3) /pET_22b-gmd 25g/L ； BL21 (DE3) /pET-22b-wcaG 25g/L ；GDP-甘露糖 30g/L ；植酸 5g/L ；KH2P0425g/L ；MgSO4. 7H20 5g/L ；ATP 5g/L ；Nymeen S_2154g/L。本发明的优点和积极效果是1、本发明中的菌种构建方法应用E. coli表达系统，以大肠杆菌为基础，运用基因 工程重组技术构建BL21 (DE3) /pET-22b-gmd基因工程菌株和BL21 (DE3) /pET_22b_wcaG基 因工程菌株，应用混合发酵技术，以GDP-甘露糖为发酵底物合成GDP-岩藻糖，实现代谢途 径中各种酶的高效表达，进而达到GDP-岩藻糖的大量合成，不仅为批量生产人乳寡糖提供 有效的途径，同时也为天然寡糖药物的生产提供原料，具有较强的基础理论研究价值以及 经济和社会效益，市场开发前景广阔。2、本发明涉及的GDP-岩藻糖的生产方法合成路线简单，不涉及昂贵的中间产物 和复杂精密的设备，有效降低了生产成本，提高了生产效率，具有较高的经济效益。
图1为本发明的扩增电泳图其中条带1、2、3为⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖3， 5-变旋酶/4-还原酶(wcaG)基因；条带4为Ikb DNA marker ；条带5、6、7为⑶P-甘露糖 4，6-脱水酶(gmd)基因；图2为本发明重组表达质粒pET-gmd的构建流程图；图3为本发明重组表达质粒pET-wcaG的构建流程图；图4为本发明的pET-gmd，pET-wcaG的蛋白表达电泳图；其中条带1为BL21/ pET-gmd ；条带 2 为 BL21/pET-wcaG ；条带 3 为 BL21/pET_22b ；图5为本发明利用基因工程菌株混合发酵合成GDP-岩藻糖体系的发酵流程图。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为 仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。本发明的方法概述和原理如下本发明所涉及的利用基因工程菌株耦合发酵 ⑶P-岩藻糖的体系的方法，其主要内容是利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET-22b，对 催化以GDP-甘露糖为底物合成GDP-岩藻糖的相关酶进行高效表达，构建两种酶(GDP-甘 露糖4，6-脱水酶(gmd)，⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖3，5-变旋酶/4-还原酶(wcaG))的两个重组大肠菌株，应用代谢调控手段来进行GDP-岩藻糖的高效合成。本发明中所用的两个酶基因的来源和重组载体的宿主菌分别是E.coli-K12和大 肠杆菌BL21 (DE3)，所构建的重组表达载体不仅包括编码酶的DNA序列，还具有表达该基因 所需的控制元件。一、基因工程菌的构建1、⑶P-甘露糖4，6-脱水酶基因(gmd)和⑶P_4_酮_6_脱氧甘露糖3，5_变旋酶 /4-还原酶基因(wcaG)的扩增提取大肠杆菌E. coli-K12的基因组，设计如下引物Pgmdl :5，-CATGCCATGGATATGTCAAAAGTCTCTCATC-3‘酶切位点为 Nco I。Pgmd2 :5，-CCCAAGCTTTTATGACTCCAGCGCGATC-3‘酶切位点为 HindIIIPwcaGl :5，-CATGCCATGGGCATGAGTAAACAACGAGTTTTTATTG-3'酶切位点为 Nco I。PwcaG2 :5，-CCCAAGCTTTTACCCCCGAAAGCGGT-3’ 酶切位点为 HindIII。扩增体系采用20 μ 1的PCR扩增体系 扩增条件用于扩增目的基因的PCR条件95 "C5min 72 °C5min将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物1. Ikb (gmd), 1. O(wcaG)，结果如图1所示，可以看到在约1. Okb和1. Okb处出现一条特异性条带，其大小 与目的基因大小完全吻合，连接在pET-22b载体上，得到pET-gmd，pET-wcaG将其测序可知 (委托上海生工)扩增到得(⑶P-甘露糖4，6-脱水酶，⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖3，5-变 旋酶/4-还原酶基因的DNA序列如后表。2、重组质粒的构建(1)表达载体的制备在氨苄青霉素(50yg/mL)的LB培养基中接种携带质粒pET_22b的大肠杆菌 JM109菌株(购自宝生物公司)，于37°C振荡培养过夜，将1. 5mL菌液转入微量离心管 中，12000r/min、离心30s收集菌体，弃上清，控干残液。将沉淀重悬于100 μ L预冷的溶 液 l(50mmol 蔗糖，25mmol Tris, IOmmol EDTA，PH8. 0)中，混合均勻，加入 200 μ L 新配置的溶液2(0. 2molNaOH,l% SDS)盖紧管口，轻轻摇勻，放置冰上l-2min至液体清亮，加入 15(^1^预冷的溶液3(3!1101乙酸甲，PH4. 8)轻轻转动离心管，使溶液3在粘稠的细菌裂解 液中混合均勻，冰浴3-5min，12000r/min,离心5min，将上清转移到另一管中，12000r/min 钟，离心5min，再将上清液移到另一离心管中，加入2-2. 5倍体积的无水乙醇，混勻，冰浴 (或_20°C )放置30min，12000r/min,离心5min，收集质粒DNA沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀 2-3次，弃去残液，空气中干燥10-20min，用20 μ L的双蒸水溶解沉淀。所获得的pET_22b即可用作连接淀粉酶基因的载体。(2)⑶P-甘露糖4，6-脱水酶(gmd)基因和⑶P_4_酮_6_脱氧甘露糖3，5_变旋酶 /4-还原酶(wcaG)基因表达载体的构建①对载体pET_22b和gmd，wcaG的PCR产物进行双酶切，然后电泳、切胶回收酶切 后的质粒和PCR产物，均选用50 μ 1酶切体系a. 用DNA纯化试剂盒(TaKaBa公司)对上述酶切后的片段进行纯化，所获得的线性 纯化的pET-22b和gmd、wcaG即可用来构建重组质粒。②酶切后的载体和目的基因的连接，均选用IOyL连接体系 所得连接混合物采用DNA纯化试剂盒(TaKaRa公司)进行纯化，纯化后产物用于 电转化法转化大肠杆菌DH5ci。3、质粒的扩增和验证μ L大肠杆菌DH5 α的感受态细胞接E. coli-DH5 α斜面菌种接种于5mL LB培养基 中，37°C振荡培养2-3h，使细胞达到对数生长期(0D_ = 0. 5-0. 7)，将三角瓶转移到冰上 放置20min，4000r/min, 4°C离心15min，收集细胞，用300 μ L，10 %的甘油悬浮细胞，4000r/ min，4°C离心15min，此过程重复一次，最后将细胞悬浮在300 μ L，10%的甘油中，按每一份40 μ L分装到预冷的离心管，然后放置-70°C保存；使用时将感受态细胞置于冰上融化，在一管40 μ L的感受态细胞中加入4μ L上 述纯化处理的连接产物，混勻后加入已经预冷的电转化杯中，轻击液体以确保细菌与DNA 悬液位于电转化杯底部，打开电转化仪，调整到Ecl档，即专为大肠杆菌转化设置的一档； 擦干电转化杯外面的冷凝水和雾气，放进电转化仪中，按上述设定的档，启动对细胞的电转 化；转化结束后，尽可能快的取出电转杯，加入600 μ L SOC培养液，混勻后转入1. 5mL离心 管中，于37°C，180r/min慢摇Ih ；按每个平板100 μ L涂布到含氨苄青霉素(100yg/mL) 的LA平板上，37°C倒置培养过夜(16-20h)，从平板上挑取单一菌落，接种于含氨苄青霉素 (100 μ g/mL)液体LB培养基中，于37°C培养12_18h，然后小量提取质粒DNA，用相应的限制 性内切酶进行双酶切鉴定，重组质粒结构见图2、图3。
4、基因工程菌的诱导表达(1)按照步骤3中描述的方法制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，并利用少量提取 质粒验证正确的基因工程菌的质粒pET-22b-gmd或pET-22b-WCaG，依照上述方法进行转化 实验；(2)重组菌株重组BL21(DE3)的诱导①从平板上挑取单一菌落，接种于含氨苄青霉素(100 μ g/mL)液体LB培养基中， 于 37°C培养 12-18h ；②按1 %的接种量接过夜培养物于30mL含60 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中；③37°C振荡培养，当 OD6tltl = 0. 4-0. 6 时加入 IPTG，终浓度至 0. ImmoL/L ；④在20°C下诱导4h，取样检测；(3) SDS-PAGE 表达分析①凝胶制备溶液组成12%分离胶(IOmL)HiL5%浓缩胶 (4mL)mL30% 丙烯酰胺4.00. 67Tris-HCKl. 5M)pH8. 82.5-Tris-HCl (1. 0Μ)ρΗ6· 80. 510% SDS0.10. 0410%过硫酸铵0.10. 04TEMED0. 0040. 004去离子水3.30.7②样品处理将ImL培养液置于小型离心管中，于4°C下12000r/min离心3min ；除上清，使沉 淀的菌体尽可能“干燥”；重悬菌体于IOOyLlXSDS-PAGE电泳上样缓冲液，并进行充分混 合；100°C下煮沸5min，离心取上清，样品保存于-20°C直到进行蛋白电泳分析，电泳结果见 图4。二、重组工程菌株的混合发酵合成⑶P-岩藻糖在250ml的摇瓶中30mL的LB培养基中进行，其组成成分为(g/L) :BL21 (DE3)/ pET-22b-gmd25 (菌体重量为湿重)；BL21 (DE3) /pET-22b_wcaG (菌体重量为湿重)25 ；GDP-甘露糖 30 ；植酸 5 ；KH2P0425 ；MgSO4. 7H20 5 ；ATP 5 ；Nymeen S-2155 (表面活性剂，增加细菌表面的渗透性)；反应体系用4N的NaOH将pH值维持在7. 2，反应在32°C，900r/min的 条件下进行22h，在反应过程中以IPTG为诱导剂，使终浓度为0. lmmol/L进行重组菌的诱导 表达，发酵过程如图5所示。反应前先将构建好的BL21 (DE3) /pET_22b-gmd 和 BL21 (DE3) /pET-22b_wcaG 基因 工程菌株分别在LB培养基中进行培养，将菌体生长量达到OD6tltl = 0. 5 0. 6时的菌作为 混合发酵合成GDP-岩藻糖的准备菌。反应混合物在4°C下离心，4000r/min，15min,除去菌体，取上清进行HPLC分析， 色谱条件为色谱柱=Hypersil NH2,4. 6mmX 150mm,填料粒径5 μ m ；检测器示差折光检测 器；流动相乙腈、水=80,20 (ν/ν)；柱温:25°C ；进样量:5μ L ；流速0. 8mL/min。用外标法计算⑶P-岩藻糖的产量为10mg/l，⑶P-甘露糖的回归方程如下y = 0. 001+12. 7x (R = 0. 9998)其中以峰面积y对样品浓度χ做线性回归方程。两个基因工程菌株的混合发酵，通过改变细胞通透性使工程菌株的产物作用于 ⑶P-甘露糖合成⑶P-岩藻糖。
权利要求
一种利用基因工程菌耦合发酵合成GDP-岩藻糖的方法，其特征在于步骤如下(1)基因扩增根据大肠杆菌K-12E.coli-K12基因组中GDP-甘露糖4，6-脱水酶和GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3，5-变旋酶/4-还原酶的序列设计引物，克隆出大肠杆菌中的GDP-甘露糖4，6-脱水酶和GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3，5-变旋酶/4-还原酶基因；(2)重组质粒的构建用酶切连接的方法分别将上述两种目的基因与载体pET-22b相连，得到携带目的基因的重组表达载体，扩增后酶切验证，验证正确得到质粒pET-22b-gmd或pET-22b-wcaG；(3)基因工程菌株的构建将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株BL21(DE3)/pET-22b-gmd和BL21(DE3)/pET-22b-wcaG；(4)混合发酵合成GDP-岩藻糖将步骤(3)得到的两基因工程菌株于培养基中混合发酵，在发酵过程中以IPTG为诱导剂，以GDP-甘露糖为底物合成GDP-岩藻糖。
2.根据权利要求1所述的利用基因工程菌耦合发酵合成GDP-岩藻糖的方法，其特征在 于所述步骤(2)中扩增采用的是将质粒转化到大肠杆菌DH5 a的感受态细胞中扩增，扩增 后酶切验证，正确后用于步骤(3)的转化。
3.根据权利要求1所述的利用基因工程菌耦合发酵合成GDP-岩藻糖的方法，其特征 在于所述步骤(4)培养基的组成成分为:BL21(DE3)/pET-22b-gmd 25g/L ;BL21 (DE3)/ pET-22b-wcaG 25g/L ；GDP-甘露糖 30g/L ；植酸 5g/L ；KH2P0425g/L ；MgS04. 7H20 5g/L ；ATP 5g/L ；Nymeen S-215 4g/L。
全文摘要
本发明涉及了一种利用基因工程菌耦合发酵合成GDP-岩藻糖的方法，主要内容是利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET-22b，对催化以GDP-甘露糖为底物合成GDP-岩藻糖的相关酶进行高效表达，构建生产两种酶gmd、wcaG两个重组大肠菌株，应用代谢调控手段来进行GDP-岩藻糖的高效合成。本发明中的菌种构建方法应用E.coli表达系统，以大肠杆菌为基础，运用基因工程重组技术构建两基因工程菌株，并应用混合发酵技术，以GDP-甘露糖为发酵底物合成GDP-岩藻糖，实现代谢途径中各种酶的高效表达，进而达到GDP-岩藻糖的大量合成，不仅为批量生产人乳寡糖提供有效的途径，同时也为天然寡糖药物的生产提供原料，具有较强的基础理论研究价值、经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。
文档编号C12P19/02GK101870992SQ20101020435
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者刘逸寒, 李玉, 王春霞, 贾红红, 路福平, 黎明 申请人:天津科技大学