专利名称：一种荧光t载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种荧光T载体以及其的构建方法，还涉及 该荧光T载体在基因克隆中的应用。
背景技术：
PCR(Polymerase chain reaction)是分子生物学和基因工程研究领域中的常规 实验技术，是目前基因克隆，基因或DNA片段研究的必经之路。克隆PCR产物最直接、最方便 的方法是T/A克隆。所谓T/A克隆就是将;T端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到;T端具 有单个T尾巴的T载体上。在PCR扩增过程中，由于Taq酶具有不依赖于模板的末端转移酶 活性而在PCR产物的3、端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的腺嘌呤 脱氧核苷酸(A)，从而便得50%以上的PCR产物的3、末端具有单个腺嘌呤脱氧核苷酸，即 3、端 A尾巴(Clark JM. Novel non-templated nucleotide additonreactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNApolymerases. Nucleic Acids Res. 1988，16(20) 9677-9686 ；Schutte BC, Ranade K，Pruessner J，Dracopoli N. Optimizedconditions for cloning PCR products into an XcmI T-vector. BioTechnique. 1997,22(1) :40-42; Ichihara Y，Kurosawa Y. Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993，130 (1) :153-154.)。因此，幵发出一种3、末端带一突出“Τ”的特殊载体——T载体，用于克隆Taq酶 扩增的PCR产物，以克服传统克隆技术载体容易自连，克隆效率低，筛选阳性克隆难度大， 实验费用高等缺点。根据构建策略的不同，T载体制备方法有3种方法一是利用产生平 末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷 酸(ddTTP)添加到线状载体的 3、末端(Holton TA，Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR productsusing ddT—tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991,19(5) :1156.)。方法二是利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性，在不 存在脱氧腺嘌呤核苷酸(dATP)的情况下有相对良好的;T末端加“T”的能力，将单个脱氧 胸腺核苷酸(dTTP)添加到线状载体的3、端(Marchuk D，Drumm M，Saulino A，Collins FS.Construction ofT-vectors, a rapid and general system for direct cloning ofunmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991，19 (5) :1154.) 方法三是在质粒 载体的多克隆位点引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生;T具有单个T突出的 线性T载体。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括Xcm I、Ahd I /Eaml 105 I / EclHK I /AspE I NruG I /BspOVKBfi I /Bmr I、Hph I /AsuHP I、Mbo II /Ncu I、 Bfu I /Bci VI、HpyA V /Hin4 II等。其中)(cm I和Ahd I及其同裂酶在制备T载体中广 泛应用。其它内切酶不是因为太昂贵，就是因为在普通克隆载体上有太多的识别位点，因而 在制备T载体的应用中受到限制。目前常用的T载体大多为商品化的载体，这些T载体基本上可以满足PCR产物克 隆的要求，但要进行蛋白表达、纯化以及对蛋白突变体进行筛选还需要寻找更有利的载体。
在大肠杆菌系统中，异源蛋白重组表达最大瓶颈之一是过量表达的目标蛋白由 于低的水溶性或不正确的折叠，导致形成没有任何生物学活性的包涵体。蛋白定向进化 是克服这一难题使目标蛋白以水溶态形式表达的有力而有效的工具(Wigley WC, et al, Proteinsolubility and folding monitored in vivo by structuralcomplementation of a genetic marker protein. Nat Biotechno1. 2001，19(2) 131-136 ；Yang JK， Park MS，Waldo GS, Suh SW. Directedevolution approach to a structural genomics project :Rv2002from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003， 100(2) :455-460 ；Pedelacq JD, Piltch E， Liong EC， BerendzenJ, Kim CY， Rho BS， Park MS，Terwilliger TC, Waldo GS. Engineering soluble proteins for structural genomics. NatBiotechnol. 2002, 20(9) :927-932 ；Esteban 0，Zhao H. Directedevolution of soluble single-chain human class II MHC molecules. J Mol Biol. 2004,340 (1) 81-95.)。定向进化技术早已应用在改善酶的专一性、热稳定性和结合其它蛋白的亲和 性。近年来，此技术在结构生物中的应用日益受到重视。许多成功的例子表明该技术可 以用于改善蛋白的水溶性，效果显著，其中一些蛋白的晶体结构还得到解(Kaur J，et al, Directed evolution :an approach to engineerenzymes. Crit Rev Biotechnol. 2006， 26(3) 165-199 ；Hart DJ, Tarendeau F.Combinatorial library approaches for improvingsoluble protein expression in Escherichia coli.ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.2006,62(1) :19-26 ；RoodveldtC，et al, Directed evolution of proteins for heterologousexpression and stability. Curr Opin Struct Biol.2005, 15(1) :50-56.)。蛋白定向进化包括两个关键性的步骤首先，突变体文库的构建，保证 有足够的突变体以供筛选；其次，有高通量的、灵敏的筛选方法，即筛选方法方便，容易 实施，即使目标蛋白溶解度微小的变化都能检测到。C端融合α-肽是筛选突变体的一 种方法，已有一些成功的例子(Jiang SM, Li CH, Zhang WW, Cai YH, Yang YL, Yang S， Jiang WH. Directed evolution and structural analysisof N-carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase provide insightsinto recombinant protein solubility in Escherichia coli. Biochem. J. 2007,402 (3):似9_437·)，但其对比度不高。已报道的报 告蛋白还有绿色荧光蛋白GFP、珊瑚绿色荧光蛋白^Greeru氯霉素乙酰转移酶和二氢叶 酸还原酶(Waldo GS. Improving proteinfolding efficiency by directed evolution using the GFP foldingreporter. Methods Mol Biol. 2003,230 :343-359 ；Heddle C， etal， Development of a screening platform for directed evolutionusing the reef coral fluorescent protein ZsGreen as asolubility reporter.Protein Eng Des Sel.2007，20(7) :327-337 ；Maxwell KL et al, A simple in vivo assay for increased proteinsolubility.Protein Sci. 1999,8(9) :1908-1911 ；Liu JW, BoucherY, Stokes HW, Ollis DL. Improving protein solubility :the useof the Escherichia coli dihydrofolate reductase gene as afusion reporter. Protein Expr Purif. 2006, 47(1) :258-263.)。但是这些报告蛋白都存在一些不足首先，胞内荧光显示强度不高、荧 光对比度小、产生荧光迟滞，如GFP在4 后菌落才产生明显的荧光；其次，胞外检测试剂的 最佳浓度难以确定，其与上游靶蛋白分子量、水溶性及表达量有关。所以需要寻找一种可以 进行高通量筛选的、对比度高的报告蛋白。
尿口卜啉原甲基化酶(Uroporphyrinogen methyltransferase, UPMT)编码基 因为cobA，是微生物合成西罗血红素、血红素dl、F430因子和维生素B12等卟吩烷 类化合物的重要调控酶，植物中尿卟啉原甲基化酶(UMPT)负责西罗血红素生物合成 的调控。已证明UPMT存在于大部分细菌、真菌包括酵母和高等植物中(Blanche F， Debussche L,Thibaut D,Crouzet J and Cameron B. Purification andcharacterization of S-adenosy1-L-methionine :uroporphyrinogenlII methyltransferase from Pseudomonasdenitrificans. J. bacterial. 1989,171 (8) :4222-4231. ；Raux EiMcveigh T， Peters SE，et al· The role of Saccharomycescerevisiae Metlp and Met8p in siroheme and cobalaminbiosynthesis. Biochem J，1999，338 :701-708.)。在高等植物中，它由核 基因编码，翻译后的蛋白前体运输到叶绿体或质体中(LeustekT，Smith M，Murillo M，et al·Siroheme biosynthesis in higherplants. Analysis of an S-adenosy1-L-methioni ne-dependenturoporphyrinogen III methyltransferase from Arabidopsisthatiana. J Biol Chem，1997，272(5) :2744-2752.)。大肠杆菌的CysGA、费氏丙酸杆菌薛氏亚种UPMT， 拟南芥UPMT在大肠杆菌重组表达时，菌落在长紫外光下显示强烈红色荧光，体外检测主要 成分是前咕啉-2 和三甲基咕啉(Warren MJ，Stolowich NJ，Santander PJ，Roessner CA， Sowa ΒΑ, Scott Al. Enzymatic synthesis ofdihydrosirohydrochlorin (precorrin-2) and of a novelpyrrocorphin by uroporphyrinogen III methylase. FEBSLett. 1990， 261 (1)76-80. ；Sattler I，Roessner CA.，StolowichNJ, Hardin SH, Harris-Haller LW, Yokubaitis NT. Cloning，sequence and expression of the uroporphyrinogen IIImethyltransferase cobA gene of Propionibacteriumfreudenreichii(shermanii). J. Bacteriol. 177(1995) 1564-1569)。大肠杆菌的cysGA、费氏丙酸杆菌薛氏亚种cobA可作 为红色焚光 艮告基因(Charles A. Roessner. Use of cobA and cysGAas Red Fluorescent Indicators. Methods in MolecularBiology. 2002. vol. 183)，用于重组质粒的筛选 (Roessner CA andScott Al. Fluorescence-based method for selection ofrecombinant plasmids. Biotechniques. 1995，19 (5) :760-764)，还可在大肠杆菌、酵母和动物中作为 转录才艮告基因(WiIdt, S. andDeuschle, U. cobA, a red fluorescent transcriptional reporterfor Escherichia coli，yeast and mammalian cells. Nat. Biotech. 1999,17 1175-1178)ο玉米UPMT的功能基因片段已经确定，其功能基因片段在大肠杆菌重组表达 会在细胞中积累西罗叶绿三酸和过甲基化产物三甲基咕啉，它们在紫外光下产生强烈 红色荧光，这种性质可用于重组质粒的筛选(Fm J, Wang DQ，Liang Z，et al. Maize uroporphyrinogen III methyltransferase :overexpression of the functional genefragments in Escherichia coli and one-step purification. Proteins Expr Purif. 2006，46(1) :40-46. ；Pan HYiCheng YiZhu SWand Fan J. Improved the solubility of Maize Uroporphyrinogen III methyltransferase as the red fluorescent indicator bysite-directed mutagenesis. Chinese Journal of Biotechnology，2007，23 (2) 206-210.)。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种含有红色荧光蛋白UPMT的T载体以 及其构建方法以及其在基本克隆方面的应用，本发明所提供的荧光T载体具有对比度高、 灵敏度高以及重组效率高的特点。本发明是通过以下技术方案实现的本发明的第一目的是提供一种荧光T载体，即在出发载体pMDIS-T Simple Vector 中引入增强子序列和编码红色荧光蛋白UPMT的cobA基因序列。其中红色荧光蛋白UPMT 为尿卟啉原甲基化酶，其编码基因为cobA。cobA基因的近5、端的Sam I酶切位点通过同 义突变而消除，自cobA基因远5、端的Sam I酶切位点为酶的唯一保守位点。该荧光T载 体灵敏度高，在唯一保守位点插入一个碱基就可导致红色荧光蛋白(UPMT)荧光的丧失，从 而克服了常规T载体通过蓝白斑对小片段插入重组子筛选时假阳性偏高的现象。同时，该 T载体克隆PCR产物通过有无荧光对重组子进行筛选，不需要添加额外的底物和诱导剂如 X-gal and IPTG，成本低，操作步骤少，灵敏度又高。本发明的第二目的是提供一种荧光T载体的构建方法，所述方法包括(1)用上游弓丨物 1 :5:GAACTGCGGAGGCTCCTGGAC-3~，下游弓丨物 2: -TTAAGATGACTCAACCCAGAAG-3~，克隆大小807bp的cobA基因，进行1. 5%琼脂糖凝胶电
泳，切胶回收；(2)在出发载体pMD18-T Simple Vector上装入编码去除导肽的红色荧光蛋白 UPMT的基因序列(cobA基因)，制备前T载体，命名为pUC18-cobA ；(3)用突变引物1和突变引物2以pUC18-cobA质粒为模板，PCR扩增，纯化产物的 端磷酸化后连接，转化大肠杆菌DH5ci，获得突变体质粒pUC18-EcobA。该突变体质粒具
有增强子序列和在cobA基因端装入的编码起始密码子ATG三核苷酸，从而在增强表达 的同时缩短了起始密码子与cobA基因的距离；(4)同义突变自cobA基因的近5、端的Sam I酶切位点，保留远5、端的Sam I 酶切位点，获得只有唯一 Sam I酶切位点的突变质粒pUC18-EcobAl。保留的唯一 Sam I 酶切位点为红色荧光蛋白UMPT的保守区域。构建方法为用突变引物3 和突变引物4以 PUClS-EcobA质粒为模板，PCR扩增，DpnI消化过夜，纯化产物转化大肠杆菌DH5 α，紫外灯 下挑选红色菌斑，摇菌提质粒，经测序获得序列无误的突变体质粒pUC18-EcobAl ；(5)pUC18-EcobAl 分别转化 DH5a、J1109、XLBlue-U TGl 菌株，涂平板过夜培养(12 小 时左右)，紫外灯下，菌斑呈现均一的红色荧光。表明UPMT产生的红色荧光无菌株差异，由 pUC18-EcobAl 制备的 T 载体(pUC18-EcobA_T)在 DH5a、J1109、XLBlue-1、TGl 菌株中均可使用；(6) Sam I酶切pUC18-EcobAl质粒，纯化产物利用Taq酶，在只添加脱氧胸腺核苷 酸(dTTP)的条件下PCR扩增，72°C温育2小时。纯化PCR产物，即获得含有红色荧光蛋白 UPMT的成熟T载体，命名为pUC18-EcobA-T。本发明的第三个目的是荧光T载体在DH5a、JM109、XLBlue-I、TGl菌株中的应用。(l)pUC18-EcobAl 分别转化 DH5a、JM109、XLBlue_l、TGl 菌株，涂平板过夜培养(12 小时左右)，紫外灯下，菌斑呈现均一的红色荧光，表明UPMT产生的红色荧光无菌株差异， 由 pUC18-EcobAl 制备的 T 载体(pUC18-EcobA_T)在 DH5a、JM109、XLBlue-1、TGl 菌株中均 可使用；
(2)用突变引物5和突变引物6以pUC18-EcobAl为模板，PCR扩增，DpnI消化过夜， 纯化产物转化大肠杆菌DH5 α，获得突变体质粒pTCA。该质粒唯一的Sam I酶切位点处插 入TCA三个碱基，编码一个丝氨酸(kr)且三个碱基的插入可以防止cobA基因移码突变。 该一个氨基酸残基插入的突变体导致红色荧光蛋白UPMT荧光的丧失。说明cobA基因保留 的唯一 Sam I酶切位点为红色荧光蛋白UPMT的保守区域。同时，可以认为TCA三个碱基
端T碱基相当于T载体;T端突出的T末端，3、端A碱基相当于在PCR扩增过程中Taq酶 添加在PCR产物的3、端的A碱基，即pTCA突变质粒可以认为是pUC18-EcobA-T载体只有单 个胞嘧啶脱氧核苷酸(C)插入而导致红色荧光蛋白UPMT荧光的丧失，表明pUC18-EcobA-T 载体灵敏度高。小片段插入重组子可以很好的检测；(3)pUC18-EcobA-T 分别克隆 250bp，370bp，420bp，IOOObp, 1800bp 大小的 PCR纯化 产物，转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜培养(12小时左右)，紫外灯下重组斑为白色菌斑， 非重组斑为红色菌斑(或M小时左右培养，可见光下重组斑为白色菌斑，非重组斑为淡红 色菌斑)挑选白色菌斑摇菌，提质粒酶切验证，凝胶电泳检测，均有目的条带。(4)pUC18-EcobA-T克隆500bp大小的PCR产物，转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜 培养，紫外灯下挑选100个白色菌斑摇菌提质粒，凝胶电泳检测，有92%的阳性克隆。本发明的有益效果为本发明所构建的含有红色荧光UPMT的T载体，除具有常 规τ载体的特点之外，而且不用添加任何底物及诱导剂(如IPTG/X-Gal)，过夜培养12小 时后，紫外灯下重组斑为白色，非重组斑为红色；24小时后，可见光下重组斑为白色，非重 组斑为淡红色；对比度高，红色其它一些荧光蛋白更容易观察；灵敏度高，一个碱基的插入 就导致红色荧光的丧失，对小片段装入的重组子有很好的检测；重组效率高，实验检验达到 90%以上。
图 lpUC18-EcobA_T 构建图；图2突变体质粒pTCA转化图(紫外灯下)；图3重组斑白斑非重组斑红斑(12小时紫外灯下)；图4重组斑白斑非重组斑淡红斑( 小时可见光下)。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步详细说明。1、克隆编码红色蛋白UPMT的cobA基因用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，克隆大小807bp的cobA基因，引物设计时不加 限制性内切酶位点和保护碱基。其中，PCR扩增引物为上游引物1 :5:GAACTGCGGAGGCTCCTGGAC-3~ ；下游引物2 5 ~ -TTAAGATGACTCAACCCAGAAG-3 ~ ；PCR 扩增反应体系为:50μ 1 反应体系 5U Taq, 0. 2mmol/LdNTPs, 1 X Taq buffer, 引物各1(^11101/1，模板51^左右；PCR扩增的循环程序94°C预变性5min，(94°C，30s ； 55°C, 30s ；72°C,45s) X30，72°C最后延伸5min。进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。2、构建前T载体
(1)将纯化cobA基因装入pMD18-T Simple Vector (TaKaRa生产)，连接反应体 系pMD18-T Simple Vector 1 μ 1
cobA基因片段Solution ITotal volume
1.5μ 1
2.5μ 1 5 μ 116°C反应30min，转化大肠杆菌DH5a，涂平板过夜培养，紫外下挑取红色菌斑提 取质粒，该重组质粒命名为pUC18-cobA。(2)利用定点突变方法对pUC18-cobA质粒上游控制cobA基因表达的基因序列进 行优化以增强荧光的产生(以TaKaRa公司提供的TaKaRa MutanBEST Kit做定点突变)。构 建方法如下在PCR引物(突变引物1和突变引物幻中引入增强子序列和编码起始密码子 的ATG三核苷酸，以pUC18-cobA质粒为模板，用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，纯化3600bp 左右的PCR产物，对其5、端磷酸化后连接，转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜培养，紫外灯下 挑选最红的菌斑，摇菌提质粒，经测序(上海英骏生物公司)检测获得序列无误的突变体质 粒 pUC18-EcobA。(3)利用定点突变方法同义突变自cobA基因近5、端的Sam I酶切位点，保留远 端的Sam I酶切位点，获得只有唯一 Sam I酶切位点的突变质粒pUC18-EcobAl。构建
方法如下一条PCR引物(突变引物；3)引入突变碱基，另一条引物(突变引物4)设计成 其互补引物，以pUC18-EcobA质粒为模板，用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增产 物直接加DpnI消化过夜，纯化产物转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜培养，紫外灯下挑选 红色的菌斑，摇菌提质粒，经测序(上海英骏生物公司)检测获得序列无误的突变体质粒 pUC18-EcobAl。其中，cobA基因保留唯一 Sam I酶切位点为酶的保守区域，在该位点插入一个氨 基酸残基就会导致红色荧光蛋白UPMT荧光的丧失。3、前T载体菌珠试验用pUC18_EcobAl 分别转化 DH5a、JM109、XLBlue_l、TGl 菌株，涂平板过夜培养(12 小时左右)，紫外灯下，菌斑呈现均一的红色荧光。表明UPMT产生的红色荧光无菌株差异， 由pUC18-EcobAl制备的T载体在DH5a、JM109、XLBlue-I、TGl菌株中均可使用。4、构建成熟的T载体利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性，在不存在脱氧腺嘌呤核苷酸 (dATP)的情况下有相对良好的;T末端加“T”的能力，将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加 到线状载体的3、端的原理制得成熟的T载体。构建步骤如下(I)Sam I酶切pUC18-EcobAl质粒，产生线状的平端载体。酶切体系为pUC18-EcobAl15 μ 1IOXT buffer2μ 10. 1 % BSA2μ 1Sam I1 μ 1Total volume20 μ 130°C酶切反应过夜，用 Sangon EZ-10 Spin Colume PCR ProductPurificationKit纯化。 (2)线状的平端载体加dT尾。纯化的Sam I酶切产物利用Taq酶，在只添加脱氧 胸腺核苷酸(dTTP)的条件下进行PCR扩增。反应体系及PCR扩增的循环程序如下ddH2010. 25 μ 1IOXTaq buffer2. 5 μ 1dTTP(25mmol/L)2μ 1平端载体10 μ 1Taq 酶0. 25 μ 1Total volume25 μ 1PCR 程序72 °C2h4 °C2h(3)用 Sangon EZ-IO Spin Colume PCR Product PurificationKit 纯化 PCR 产 物，即即获得成熟的含有红色荧光蛋白UPMT的T载体，命名为pUC18-EcobA-T。5、pUC18-EcobA-T克隆不同大小PCR产物的测试(1) 一个碱基装入pUC18-EcobA-T载体测试。用定点突变的方法在pUC18-EcobAl 质粒cobA基因唯一 Sam I酶切位点处插入TCA三个碱基，编码一个丝氨酸(kr)且三个碱 基的装入可以防止cobA基因移码突变。这样的设计可以认为TCA三个碱基5、端T碱基相 当于T载体;T端突出的T末端，3、端A碱基相当于在PCR扩增过程中Taq酶添加在PCR产 物的;T端的A碱基，即获得的突变体质粒pTCA可以认为是pUC18-EcobA-T载体只有单个胞 嘧啶脱氧核苷酸(C)的装入。构建方法如下一条PCR引物(突变引物5)引入突变碱基， 另一条引物(突变引物6)设计成其互补引物，以pUC18-EcobAl质粒为模板，用Pfu DNA聚 合酶进行PCR扩增。PCR扩增产物直接加DpnI消化过夜，纯化产物转化大肠杆菌DH5 α，涂 平板过夜培养，紫外灯下均为白色菌斑，摇菌提质粒，经测序(上海英骏生物公司)检测获 得序列无误的突变体质粒pTCA。pTCA突变质粒无荧光产生，说明自cobA基因5、端第102 位(即Sam I酶切位点)一个氨基酸残基的插入就可导致红色荧光蛋白UPMT荧光的丧失。 同时，pTCA突变质粒无荧光产生可以认为是pUC18-EcobA-T载体只有单个胞嘧啶脱氧核苷 酸(C)插入而导致红色荧光蛋白UPMT荧光的丧失，表明pUC18-EcobA-T载体灵敏度高。小 片段插入重组子可以得到很好的检测。Q)pUC18-EcobA-T 分别克隆 250bp，370bp，420bp，IOOObp, 1800bp 大小的 PCR纯化 产物。转接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜培养(12小时左右)，紫外灯下重组斑为 白色菌斑，非重组斑为红色菌斑(或M小时左右培养，可见光下重组斑为白色菌斑，非重组 斑为淡红色菌斑)挑选白色菌斑摇菌，提质粒酶切验证，凝胶电泳检测，均有目的条带。6、pUC18-EcobA_T的克隆效率测试pUC18-EcobA-T 克隆 500bp 大小的 PCR 产物。载体 pUC18-EcobA_T 和 PCR 产物按 摩尔比1 2-1 3的量加入连接反应体系，以TaKaRa公司提供的T4DNA连接酶做连接， 4°C过夜反应。连接反应体系如下pUC18-EcobA-T1. 5μ 1PCR 产物2μ110XT4DNA buffer 0. 5 μ 1
T4DNA Ligase1 μ 1Total volume5μ 1连接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜培养，紫外灯下挑选100个白色菌斑摇 菌提质粒，凝胶电泳检测，有92%的阳性克隆。
权利要求
1.一种荧光T载体，其特征在于在出发载体PMD18-T SimpleVector中引入增强子序列 和编码红色荧光蛋白UPMT的cobA基因序列，所述cobA基因序列远5、端的Sam I酶切位 点为酶的保守位点。
2.根据权利要求1所述的荧光T载体，其特征在于所述红色荧光蛋白UPMT为尿卟啉原 甲基化酶，其编码基因为cobA。
3.一种荧光T载体的构建方法，其特征在于所述方法包括(1)用上游弓丨物1 :5~-GAACTGCGGAGGCTCCTGGAC-3~，下游弓丨物 2: -TTAAGATGACTCAACCCAGAAG-3~，克隆大小807bp的cobA基因，进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收；(2)在出发载体pMD18-TSimple Vector上装入编码去除导肽的红色荧光蛋白UPMT的 基因序列(cobA基因)，制备前T载体，命名为pUC18-cobA ；(3)用突变引物1和突变引物2以pUC18-cobA质粒为模板，PCR扩增，纯化产物的5、 端磷酸化后连接，转化大肠杆菌DH5 α，获得突变体质粒pUC18-EcobA ；(4)用突变引物3和突变引物4以pUC18-EcobA质粒为模板，PCR扩增，DpnI消化过 夜，纯化产物转化大肠杆菌DH5 α，紫外灯下挑选红色菌斑，摇菌提质粒，经测序获得序列无 误的突变体质粒pUC18-EcobAl ；(5)Sam I酶切pUC18-EcobAl质粒，纯化产物利用Taq酶，在只添加脱氧胸腺核苷酸 (dTTP)的条件下PCR扩增，72°C温育2小时；纯化PCR产物，即获得含有红色荧光蛋白UPMT 的成熟T载体，命名为pUC18-EcobA-T。
4.权利要求1或2中所述的荧光T载体在DH5a、JM109、XLBlue-l、TGl菌株中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种荧光T载体以及其的构建方法，还涉及该荧光T载体在基因克隆中的应用，其中荧光T载体为在出发载体pMD18-TSimple Vector中引入增强子序列和编码红色荧光蛋白UPMT的cobA基因序列。该荧光T载体灵敏度高，在唯一保守位点插入一个碱基就可导致红色荧光蛋白(UPMT)荧光的丧失，从而克服了常规T载体通过蓝白斑对小片段插入重组子筛选时假阳性偏高的现象。同时，该T载体克隆PCR产物通过有无荧光对重组子进行筛选，不需要添加额外的底物和诱导剂如X-gal and IPTG，成本低，操作步骤少，灵敏度又高。
文档编号C12N15/66GK102080094SQ20101020469
公开日2011年6月1日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者张宽亮, 李静, 范军 申请人:安徽农业大学