一种调控过敏性细胞死亡基因在调控植物抗性中的应用的制作方法

专利名称：一种调控过敏性细胞死亡基因在调控植物抗性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及调控过敏性细胞死亡基因在调控植物抗性中的用途，具体涉及 NbALY916基因增强植物抗性的用途，以及通过NbALY916基因沉默构建植物感病模型的方法。
背景技术：
植物病原菌产生的激发子是一类重要的信号分子，能模仿非亲和互作中植物与病原菌进行信号交流，启动不同的级联信号途径，诱发植物的防卫反应(Lamb&Dixon，1997 ； Ali et al.，2007)。与此同时，植物细胞识别激发子后，能引起胞质Ca2+浓度增加、氧进发、NO积累、激活蛋白激酶MAPK及CDI3K (Garcia-Brugger et al.，2006)，经过一系列的信号传递，最终导致过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)和气孔关闭 (Allan&Fluhr, 1997 ；Lee et al. ,1999 ；Nurnberger et al. ,2004 ；Dong et al.，2005;张正光等，2007)，以抵抗病原菌的入侵。ALY是一类核定位蛋白家族，广泛存在于植物、酵母、线虫、果蝇及哺乳类动物等各种生物体中，具有高度的保守性(Bruhn et al. , 1997 ；Storozhenko et al. ,2001 ；Uhrig et al. ,2004 ；Canto et al.，2006)。在动物细胞中，常含有1个或2个ALY基因，如人类中只有1个，小鼠和果蝇中各有2个。它是一种转录共激活剂，可以作为分子伴侣来提高DNA结合蛋白之间的相互作用；与此同时，它还与基因的转录、mRNA的剪切和输出有关(Bruhnet al.，1997 ；Zhou et al.，2000 ；Uhrig et al.，2004 ；Canto et al. ,2006) 在植物细胞中， 含有更多的ALY基因拟南芥中有4个；本氏烟中也有4个，分别为NbALY916、NbALY615、 NbALY617和NbALY1693，而本研究中从本氏烟(Nicotiana benthamiana) cDNA文库筛选出的14-4基因片段经测序发现为NbALY916基因序列中的一部分，同源性100%。有研究报道，ALY蛋白可以与番茄丛矮病毒(Tomato Bushy Stunt Virus, TBSV)编码的P19蛋白互作，将其运输至细胞核内，从而威胁其抑制转录后基因沉默的作用机制，但它们在植物体中的功能却不得而知(Scholthof et al.，1995 ；Lakatos et al.，2004 ；Uhrig et al.，2004 ； Cantoet al.，2006)。因此，克隆NbALY916基因，进一步研究清楚其在调控烟草过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)方面的作用机制，对揭示植物ALY蛋白家族的功能具有重要价值。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase, MAPK)级联途径作为真核细胞中非常保守的信号传导途径之一，将来自上游胞外的信号通过级联放大传递给下游，一般通过MAPKKK、MAPKK、MAH(三个保守的激酶磷酸化进行信号传递 (MAPK Group,2002 ；Schwartz&Madhani,2004 ；Nakagami et al. ,2005 ；Bardwell,2005 ； Ikner&Shiozaki, 2005 ；Mishra et al. ,2006) 经本研究室证明，MAPKKK α、MEK2、WIPK 和 WRKY2四个基因沉默后均可抑制激发子^pl诱导的HCD ；MAI3KKK α -MEK2-WIPK-WRKY2介导激发子N印1诱导的HCD，而不参与激发子harpin和boehmerin诱导的HCD (结果未发表)。 该结果证明了 MAPK级联途径在激发子信号传导途径中具有重要作用。
一氧化氣(nitric oxide, NO)禾口活性氧(active oxygen species, AOS)参与植物多种的生理过程，如对生物及非生物胁迫的抗性，及对植物激素信号的应答和生长发育等(Doke，1983 ；Kwak et al.，2003 ；Bright et al.，2006 ；Grun et al.，2006 ；Takeda et al.，2008)。它们是植物主动防卫反应中较早的一种标记性反应，可作为信号分子启动防卫反应，也可限制病原菌的侵染(PitzSChke&Hirt，2006)。AOS的种类及其与NO的比例调 KiiSllilif^^fMtB^^iΙ^ ζ (pathogen-or microbe-associated molecular patterns, PAMPs/MAMPs)诱发的 HCD 和气孔关闭(Delledonne et al. ,2001 ；Zeier et al. ,2004 ； Frank&Dat,2006 ；Torres et al. , 2006 ；Melotto et al. ,2008 ；Srivastava et al., 2009)。本发明人采用病毒诱导基因沉默技术(virus-induced gene silencing，VIGS)分别沉默N. benthamiana的NbALY916基因，首次研究了该基因在^pl激发子诱导的植物防卫反应和气孔关闭中的作用。。

发明内容
本发明采用VIGS技术首次研究了 NbALY916在N印1、harp in和INFl等3种激发子诱导的过敏性细胞死亡中的功能。通过HCD表型和AOS进发等结果，证明NbALY916介导 Nepl和harpin诱导的HCD及H2O2积累，而不参与INFl诱导的HCD ；通过调节NO积累从而调控激发子^pl和harpin诱导的气孔关闭；并通过抑制^pl诱导的冊基因表达来影响植物的抗病性。NbALY916是本氏烟中的ALY基因之一。本发明中，NbALY916沉默抑制了 ^pl诱导的HCD，同时也减缓了 harpin诱导的HCD，但是对INFl诱导的HCD无影响。进一步转录分析结果证明NbALY916单基因沉默并没有显著影响本氏烟中其它3个ALY基因的转录水平。由此可见，不同的ALY基因在植物体中的功能各不相同，NbALY916在调控激发子诱导的过敏性细胞死亡方面具有特异性。激发子可诱导H2O2 积累导致气孔关闭(McAinsh et al.，1996 ；Lee et al.，1999 ； 张正光等，2007)，而H2O2受到抑制后影响了 ABA诱导的气孔关闭(Shintaro et al. ,2007), AOS和NO同时介导ABA诱导的气孔关闭(Desikan et al.，2004)。同时有研究报道，拟南芥 NADPH氧化酶(rbohD/F)突变导致ABA诱导的NO产生和气孔关闭均降低，认为NADPH氧化酶介导产生内源的H2O2是NO合成所必需的(Bright et al.，2006)。本发明发现NbALY916 沉默导致激发子诱导的H2O2积累减少；同时激发子诱导的气孔关闭和保卫细胞内NO的积累均受到抑制，表明NO和H2O2两者可能共同参与激发子诱导的气孔运动，这与上述研究结果一致。本发明发现I3Rla和ra2b等防卫基因在NbALY916沉默植株中的转录表达量明显降低，表明NbALY916参与了激发子诱导的I3R基因的转录积累。而NbALY916沉默也抑制了 N印1诱导的过敏性细胞死亡，提示过敏性细胞死亡和防卫基因的转录可能相伴发生。菌丝块接种烟草疫霉病菌的试验结果表明，当NbALY916基因发生沉默之后，本氏烟对烟草疫霉病菌的抗病性明显降低(图2-8B)，可能是因为植物体内ra基因的表达受到抑制造成的。 上述结果证明了 NbALY916调控的信号途径可能参与了 ^pl这类PAMP诱导的植物抗性。经本研究证明MAPK级联途径在激发子信号传导途径中具有重要作用，MAPKKK α -MEK2-WIPK-WRKY2级联途径介导激发子^pl诱导的HCD及H2O2积累，而不参与 harpin和boehmerin 2种激发子诱导的细胞死亡。与此同时，本研究发现NbALY916同样能够介导激发子^pl诱导的HCD及H2O2积累；并且经qRT-PCR证实，NbALY916在MAPKKK α、 ΜΕΚ2和WIPK分别单基因沉默的植株中的表达受抑制，而在WRKY2基因沉默植株中表达却不受影响；反之，在NbALY916基因沉默的植株中分别检测MAPKKK α、MEK2、WIPK和WRKY2基因的表达量时发现ΜΑΡΚΚΚ α、ΜΕΚ2和WIPK未受到显著影响，而转录因子WRKY2却受到抑制表达。进一步的试验结果证明，NbALY916沉默能抑制激酶MAPKKK α过表达所诱导的过敏性细胞死亡，这和del Pozo等(2004)报道的MEK2、SIPK或MEK1、NTF6沉默均能抑制MAPKKK α 过表达所诱导的过敏性细胞死亡结果一致。提示NbALY916可能作用于MAPK级联途径的下游和转录因子WRKY2的上游来介导激发子N印1诱导的过敏性细胞死亡(图2-11)，而双分子荧光互补实验的结果进一步证明了 WIPK与WRKY2有直接相互作用；NbALY916与WIPK、 NbALY916与WRKY2之间却没有，提示在它们之间可能还存在其它基因参与信号传导。经本研究发现，harpin可能通过G蛋白信号途径来进行信号传递；而INFl信号传导途径未见报道。由于NbALY916沉默不能抑制激发子harpin和INFl诱导的过敏性细胞死亡，提示它们可能通过激活其它不同的MAPK途径或是非MAPK级联途径来进行信号传递。基于上述发现，本发明人认为NbALY916基因在植物抗病中具有重要作用，在转化植物中增强其表达可以提高转化植物的抗病性。相反，如果抑制该基本的表达，尤其是使该基因沉默，则能降低植物的抗病性，因而可以构建感病模型植物。对此，本发明主题包括下述方面本发明提供一种调控过敏性细胞死亡基因NbALY916基因在提高植物抗病性中的用途。尤其是利用NbALY916基因转化植物，以提高转化植物的抗病性，尤其是对疫霉病的抗性。本发明还提供一种构建植物感病模型的方法，其特征在包括下述步骤(1)构建包含NbALY916基因反义序列的转化载体；(2)将上述转化载体转化植物，以诱导NbALY916基因的沉默。其中，所述反义序列是通过下述方法获得从N.benthamiana中克隆基因 NbALY916的3，端450bp的cDNA片段反向插入转化载体中。此外，所述植物是本氏烟(N. benthamiana)，所述植物感病模型是植物疫霉病的感病模型。


图1显示3种激发子诱导NbALY916基因沉默植株过敏性细胞死亡结果。图2显示3种激发子诱发NbALY916基因沉默植株叶片积累H202。图3显示NbALY916沉默抑制激发子^pl和harpin诱导的气孔关闭。图4显示过表达MAPKKKa诱发NbALY916基因沉默的烟草过敏性细胞死亡结果。图5显示NbALY916沉默消弱激发子诱发的I3R基因表达和抗病性。图6显示NbALY916及MAPK级联途径相关基因转录分析。
具体实施方式
下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。1材料和方法1. 1 材料1. 1. 1植物材料、激发子的制备及激发子处理植物参照Li等人的方法在温室(16h光照、25 V ；8小时黑暗、20 °C )中种植 N. benthamiana植株；参照Gan等人采用原核表达外源基因的方法准备^pl激发子，其中 N印1 来自 Magnaporthe oryzae,由 η印 1 (GenBank Accession No. XM_362983)基因编码。激发子储藏浓度为500nM。参照Zhang等人[29]方法利用原核表达产物注射处理烟草叶片，注射量约为25 μ 1。1. 1. 2重组的马铃薯X病毒载体pgR107马铃薯X病毒载体pgR107是一个双元载体，它来源于pgReenOOOO，含有多克隆位点Call-Smal-Sall，载体的大小约为10kb，选择性标记是卡那霉素。1. 2 方法1. 2. 1载体构建及农杆菌侵染烟草参照Sharma等(2003)和Gan等(2009)的方法，采用VIGS技术沉默 N. benthamiana 的 NbALY916 基因。采用 RT-PCR 技术从 N. benthamiana 中克隆基因 NbALY916 (GenBankAccession No. AM167906)的 3，端 450bp 的 cDNA 片段反向插入 pgR107 载体的Call和SalI位点，获得重组的马铃薯X病毒载体PVX. NbALY916。将经过测序验证正确的重组载体转化农杆菌GV3101，挑取重组的农杆菌单菌落， 置于5ml卡那霉素浓度为50μ g/ml的LB培养液中(1% tryptone ；0. 5% yeast extract ； 0. 5%NaCl，121°C灭菌20min)，30°C、转速为225rpm的摇床中振荡培养2d，4000g离心收集菌体，IOmM的MgCl2洗涤上述菌体3次，然后用适量的MgCl2溶液悬浮菌体，使菌体悬浮液 0D600值达到1. 0-1. 5。用Iml的去针头的注射器将该细菌悬浮液从下表皮注射接种生长期大约为20d左右的烟草叶片，4周后取叶片提取RNA，采用Real Time PCR评价基因沉默效果及沉默特异性，选取沉默效果好的植株供研究用。1.2.2 DAB ( 二甲基联苯胺)染色采用Thordal-Christensen 等(1997)的方法检测激发子处理的 N. benthamiana 叶片H2O2积累。在过氧化物酶的作用下，DAB(diamin0 benzidine)与H2O2接触，迅速形成红褐色聚集物沉淀。剪取叶片浸泡在含有DAB的磷酸缓冲液[pH 7. 4,0. 5% (w/v)]中，25°C、 光照10h，取出浸泡过的叶片置于96%乙醇中煮沸IOmin脱色，然后将叶片在新鲜的乙醇中泡4h(25°C )，观察结果。1. 2. 3 烟草总 RNA 的提取、定量 RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase polymerasechain reaction, qRT-PCR)采用Trizol 提取法(Invitrogen，Carlsbad, CA)提取烟草 RNA，提取的 RNA 经 RNAse-free DNAse I 在 37°C (TaKaRa, Dalian, China)处理 30min，然后 65°C下 5min 灭活DNAse I。采用反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA，RT-PCR参照Zhang等(2004)每个PCR循环包括94°C预变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s ；qRT-PCR分析以EFla为内标，20 μ 1 PCR反应体系包含2μ1 00嫩模板，0.2 4 11基因特异性上下游引物，0.44 1 ROXReference Dye (50 X)，10 μ 1 SYBR Premix Ex Taq (2 X )。参照 7300/7500 RealTime PCR
System设置运行程序95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火延伸31s。 本实验所用的引物浓度为20 μ M (RT-PCR)或10 μ M(qRT_PCR)，PCR所用引物见表
1。PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶中电泳，Bio-Rad凝胶成像系统拍照。试验重复3次。 表1 RT-PCR及qRT-PCR的基因特异性引物
引物标号上下游引物序列Primer NO.RT-PCR and qRT-PCR primersNbALY916-F5-GCCATCTGCCACCAGAATTGCC-3'NbALY916-R5-CTTCCACGAGCTGAGCCAGGCAT-3'NbALY916-Fl5- TTCTGCGTCTGCTGCTAATC -3'NbALY916-Rl5'- CTGACTTCTCAACGCCATTC -3'1. 2. 4气孔开度测量参照Chen等(2004)方法测量气孔的开度。取温室内生长良好的、经qRT_PCR证明基因已经沉默的烟草植株叶片，蒸馏水洗净，撕取下表皮，置于表皮条缓冲液中(5mM KCl, 50mM CaCl2和IOmM MES-Tris, pH 6. 15)。光照至少3h使气孔充分张开，测量气孔孔径；然后将表皮条置于含有激发子溶液中，充分光照(200 μ mol m_2 s-1)处理3h，测量气孔开度。 气孔孔径的测定在10X40倍显微镜下进行，随机选取5个视野，每个视野内测量10个气孔。以携带空载体PGR107的农杆菌处理的植株叶片作为对照。每个处理重复3次，试验重复3次。采用DPS软件对气孔开度进行统计分析，以揭示ALY基因沉默后对激发子诱发的气孔关闭的影响。1. 2. 5保卫细胞中NO和AOS测量参照Ali等(2007)的方法测定保卫细胞中NO积累。将对照叶片和基因沉默叶片的下表皮条置于缓冲液(5mM KCl,50mM CaCl2和IOmM MES-Tris, pH 6. 15)中25°C、光照 3h(200ymol m_2 s—1)至气孔完全张开；再分别用激发子溶液处理上述表皮条3h (25°C、光照)；然后取出下表皮条置于终浓度为20 μ M DAF-2DA(4，5 二氨基乙酰乙酸荧光素)荧光染料中，25°C黑暗温育Ih后，以表皮条缓冲液充分冲洗表皮条3次，去除其表面吸附的染料； 随后在Leica荧光显微镜(Leica Microsystems, ffetzlar, Germany)下观测保卫细胞中的 NO荧光，并拍照(激发波长为470nm，发射波长为515nm)。保卫细胞中AOS测量方法与上述NO测量方法基本相同，不同的是采用的荧光染料为 Dihydrorhodamine 123 (DHR, Merck, Whitehouse Station, NJ)，且荧光染料温育的条件为37 °C黑暗温育2h。2结果和分析2. 1 NbALY916沉默效率验证采用VIGS技术研究ALY是否参与激发子诱导的过敏性细胞死亡。以携带PVX. NbALY916载体的农杆菌GV3101注射处理生长20d的烟苗叶片3-4周后，取系统侵染明显的叶片提取RNA进行qRT-PCR，对ALY的沉默效率进行验证。与携带pGR107载体的农杆菌侵染的植株检测到的NbALY916的转录量相比，PVX. NbALY916别侵染的植株的转录量明显下降，表明上述烟草植株发生了基因沉默；而NbALY916基因沉默并没有影响其它ALY基因的表达水平。这些基因沉默植株和PVX对照烟草在生长势上无明显差异。因此这4种基因沉默植株可用于研究ALY在激发子诱发的信号途径中的功能。2. 2 NbALY916沉默抑制^pl诱导的HCD，减缓harpin诱导的HCD以50nM的N印1、harpin和INFl 3种激发子分别注射处理3-4周、且经qRT-PCR 证明已沉默的烟草植株叶片，注射后24h、48h或72h观察过敏性细胞死亡的情况，结果如图 1所示，对照植株产生典型的过敏性细胞死亡；而NbALY916沉默的烟草植株却抑制了 ^pl 诱导的HCD，同时也减缓了 harpin诱导的HCD，但是对INFl注射处理后产生的HCD无显著影响。上述结果表明，NbALY916参与N印1、harpin诱导的过敏性细胞死亡，而不参与INFl 诱导的HCD，并且在调控激发子诱导的过敏性细胞死亡过程中具有特异性。2. 3 NbALY916沉默植株削弱激发子诱导的H2O2积累激发子诱导的H2O2进发是防卫反应中的早期事件，且介导植物的防卫反应 (Garcia-Brugger et al.，2006 ；Pitzschke&Hirt，2006)。本文采用 DAB 染色研究激发子诱导的H2O2进发是否依赖于NbALY916。经^pl激发子处理6h时，没有发生基因沉默的对照烟草叶片散布有许多红褐色沉淀斑点，而稀释激发子的缓冲液PBS处理的叶片几乎无红褐色沉淀。激发子INFl处理NbALY916沉默的烟草叶片和对照植株一样有相似的红褐色沉淀斑点；而经N印1和harpin处理产生的褐色沉淀斑点颜色却比对照显著浅(图2)。上述结果表明，NbALY916参与^pl和harpin诱导的H2O2积累，不参与INFl诱导的H2O2积累。2.4 NbALY916沉默抑制激发子诱导的气孔关闭气孔是植物叶表皮上的小孔，由两个保卫细胞组成，是植物与外界环境进行气体交换的门户，影响着植物的光合作用、呼吸作用及蒸腾作用。而病原菌产生的激发子可诱导气孔关闭，如 Phytophthora boehmeriae PB90 (Zhang et al.，2004)，本研究测定了 NbALY916沉默是否影响激发子诱导的气孔关闭。分别以50nM的N印l、harpin和INFl等3 种激发子处理NbALY916基因沉默植株叶片的下表皮，气孔观察及开度测量发现，NbALY916 基因沉默显著抑制了 ^pl和harpin激发子诱导的气孔关闭，对INFl诱导的气孔关闭无影响；而携带PVX空载体的农杆菌注射处理的对照植株经3种激发子诱导处理后气孔正常关闭，稀释激发子的缓冲液PBS对照对所有烟草植株的气孔关闭均无显著影响(图3)，上述结果表明NbALY916参与激发子诱导的气孔关闭。2. 5 NO参与激发子诱导的气孔关闭NO是植物细胞内普遍存在的一种信号分子，调节植物的生长发育和防卫反应，参与 ABA 诱导的气孔关闭(Dangl, 1998 ；Ali et al. ,2007 ；Neill et al. ,2002) 为了研究 NbALY916沉默是否影响NO积累，采用荧光染料对NO进行染色比较，观察N印1、harpin和 INFl处理3h后，PVX对照植株及NbALY916沉默植株中保卫细胞内NO的积累。3种激发子处理的对照植株叶片保卫细胞内有明显的绿色荧光，而^pl和harpin处理的NbALY916沉默植株叶片保卫细胞内荧光强度明显减弱，INFl处理的却与对照有相似的荧光强度；PBS 处理的对照和沉默植株叶片保卫细胞内均无绿色荧光。表明NbALY916沉默显著抑制了激发子^pl和harpin诱导的NO积累，提示NO参与激发子诱导的气孔关闭。2. 6 NbALY916沉默不影响激发子诱导的保卫细胞内AOS积累
本研究证明NbALY916沉默削弱了激发子^pl和harpin诱发的保卫细胞内NO积累，抑制了它们诱导的气孔关闭。为了研究NbALY916沉默是否影响保卫细胞中其它的AOS 积累，本文采用DHR染色分析了保卫细胞内其它过氧化物和过氧亚硝酸含量的变化。DHR是 AOS的荧光染料，可分析过氧化物和过氧亚硝酸，一旦有AOS积累会迅速生成荧光性的罗丹明123(rhodamine 123，Schulz et al.，1996)。AOS染色观察到3种激发子处理的对照、 NbALY916沉默植株叶片表皮保卫细胞内都呈现相似的荧光强度；而PBS处理无荧光，表明 NbALY916沉默几乎不影响保卫细胞内除H2O2和NO外的AOS积累。2. 7 NbALY916沉默抑制激酶MAPKKK α过表达诱导的过敏性细胞死亡在本氏烟里，MAPKKK α位于ΜΕΚ2和SIPK上游，MAPKKK α沉默能抑制AvrPto/Pto 诱导的过敏性反应，而MEK2、SIPK或MEK1、NTF6沉默均能抑制MAPKKK α过表达所诱发的过敏性细胞死亡(del Pozo et al.，2004)。为了研究清楚NbALY916沉默是否像上述基因沉默能抑制MAPKKK α过表达所诱导的HCD —样，本研究采用农杆菌注射的方法，用构建好的MAPKKK α过表达载体来处理PVX对照植株及NbALY916沉默植株。如图4所示，处理IOd 后，对照植株产生了明显的HCD，而NbALY916沉默植株却没有。该结果说明NbALY916沉默能像上述基因一样抑制激酶MAPKKK α过表达所诱导的过敏性细胞死亡。2. 8 NbALY916沉默抑制激发子诱发的I3R基因表达和植物抗病反应非亲和互作能引起过敏性细胞死亡，同时伴随有局部或系统的水杨酸积累以及病程相关基因(pathogenesis-related，PR)的表达，诱发植物的系统获得抗性(systemic acquiredresistance, SAR) (Grant&Lamb, 2006)。为了研究 NbALY916 沉默是否影响 PR 基因的表达及对病原菌的抗病性，本文分别采用qRT-PCR、菌丝块离体接种实验来分析激发子 Nepl处理后，NbALY916基因沉默植株中I3Rla和ra2b转录水平的变化以及植物对烟草疫霉病菌(phytophthora nicotianae)的抗病性。如图5A显示，PBS处理的对照植株及沉默植株，PRla和ra2b的转录均无明显差异；而在^pl处理4h后，PRla和ra2b均被不同程度的诱导表达，与N基因-TMV相互作用中PRla、PRlb和I3Rlc均被诱导表达相似(Seoet al.， 2000 ；Hatsugai et al.，2004)，但在NbALY916沉默的植株中的表达量明显低于对照植株， 表明NbALY916可能参与激发子^pl诱导的I3R基因转录。与此同时，在对照和沉默植株上接种烟草疫霉病菌的实验结果也佐证了上述结论=PBS处理的对照植株及沉默植株，烟草疫霉病菌的致病性均无明显差异；但将植株用激发子N印1处理4h后接种烟草疫霉病菌，结果却发生了显著变化，其在沉默植株上的致病性明显强于对照植株(图5B)，说明NbALY916 沉默影响了植物对病原菌的抗性。2.9 NbALY916及MAPK级联途径相关基因转录分析MAPK 级联途径 MEK2-WIPK/SIPK 和 NPKl-MEK1-NTF6 参与植物抗病途径(Jin etal.，2002 ；Ekengren et al.，2003 ；Liu et al.，2004)，在植物的免疫反应中起着非常重要的作用。经本研究室证明，MAPKKK α -MEK2-WIPK-WRKY2级联途径介导激发子N印1诱导的 HCD及H2O2积累(结果未发表)。该结果证明了 MAPK级联途径在激发子信号传导途径中具有重要作用。为了分析NbALY916是否也在MAPK级联途径中起作用，本研究采用qRT-PCR分析了 MAPKKK α、MEK2、WIPK和WRKY2沉默是否影响NbALY916基因的转录积累；NbALY916基因沉默是否影响上述MAPK级联途径相关基因的转录。如图6所示，^^1^916在獻 1 1((1、 MEK2和WIPK基因沉默植株中表达受抑制，在WRKY2基因沉默植株中转录却不受影响(图6A);反之，^^1^916基因沉默不影响1^^1(1(0、MEK2和WIPK基因的转录，却抑制了转录因子WRKY2的表达(图6B)。上述结果表明NbALY916可能位于MAPK级联途径的下游来调控激发子^Pl诱导的过敏性细胞死亡。
权利要求
1.一种调控过敏性细胞死亡基因在提高植物抗病性中的用途，所述基因NbALY916基因。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于利用NbALY916基因转化植物，以提高转化植物的抗病性。
3.根据权利要求1或者2所述的用途，其特征在于提高植物对疫霉病的抗性。
4.一种构建植物感病模型的方法，其特征在包括下述步骤(1)构建包含NbALY916基因反义序列的转化载体；(2)将上述转化载体转化植物，以诱导NbALY916基因的沉默。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述反义序列是通过下述方法获得 从本氏烟中克隆基因NbALY916的3，端450bp的cDNA片段反向插入转化载体中。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述植物是本氏烟。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于所述植物感病模型是植物疫霉病的感病模型。
全文摘要
本发明提供调控过敏性细胞死亡基因NbALY916在提高植物抗病性中的用途。本发明还提供调控过敏性细胞死亡基因在调控植物抗性中的用途，其利用调控过敏性细胞死亡基因NbALY916转化植物，获得抗病性降低的转化植物模型，这种降低了抗性的转化植物可用于相关病原的鉴定。
文档编号C12N15/83GK102296076SQ20101021077
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者张正光, 王源超, 郑小波 申请人:南京农业大学