专利名称：一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明 涉及一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒。
背景技术：
流感病毒感染一直是人类难以攻克的公共卫生隐患。2009年3月由墨西哥传出的 新型猪流感病毒swine HlNl在世界范围内广泛传播，呈爆发性流行，给人类带来了极大的 损失。流感病毒主要以甲型和乙型感染人类，其中的甲型流感病毒以H1N1，H3N2, H5N1 为常见的致病亚型。最近几年发现的高致病性禽流感病毒，它可以跨越种群障碍对人类造 成感染。不同亚型的流感病毒具有不同的毒力与传播特性，给感染性疾病的诊断与治疗带 来了很大的困难。对于病毒亚型的快速诊断是提高病人疗效和控制病毒扩散的关键，需要 寻找快速的行之有效的鉴别方法。现有技术中有用微型芯片、流式细胞术方法进行检测的， 但是大多程序复杂，成本昂贵。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种弓I物组合物。本发明所提供的引物组合物，为如下1)或2)所示1)由如下引物对a)、b)、c)和d)组成；2)由如下引物对a)、b)、c)和d)中的至少一种组成；a) 一条引物序列如序列表中序列1所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示； (即鉴别是否是甲型流感病毒新甲型Hmi亚型的引物对)；b) 一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示 (即鉴别是否是甲型流感病毒甲型Hmi亚型的引物对)；C) 一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示 (即鉴别是否是甲型流感病毒甲型H5m亚型的引物对)；d) 一条引物序列如序列表中序列7所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示 (即鉴别是否是甲型流感病毒甲型H3N2亚型的引物对)。本发明的另一个目的是提供一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒。本发明所提供的用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒，为上述引物组合物；所述甲型流感病毒亚型为新甲型Hmi亚型、甲型Hmi亚型、甲型H5m亚型或甲 型H3N2亚型。本发明的另一个目的是提供一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的PCR试剂。本发明所提供的用于鉴别甲型流感病毒亚型的PCR试剂由上述任一所述引物组 合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶组成。上述PCR试剂中，所述a)所示引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的浓度均为 0. 2mM;所述b)所示引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. ImM ；所述c)所示引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. ImM;所述d)所示引物对中的两条 引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 2mM。上述PCR试剂中，所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等摩尔比混合物，所述 dATP、dTTP、dGTP或dCTP在所述PCR试剂中的浓度均为0. 8mM。上述任一所述引物组合物在制备用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒中的应用 也属于本发明的保护范围。上述任一所述引物组合物在制备用于鉴别甲型流感病毒亚型的PCR试剂中的应 用也属于本发明的保护范围。本发明的最后一个目的是提供一种鉴别甲型流感病毒亚型的方法。本发明所提供的种鉴别甲型流感病毒亚型的方法，包括如下步骤用上述任一所 述PCR试剂对待测样品的cDNA进行PCR扩增，检测PCR产物的大小，确定所述待测样品中 甲型流感病毒亚型；所述确定所述待测样品中甲型流感病毒亚型的方法为下述1)或2)所示1)检测所述PCR产物的序列，若所述PCR产物中含有序列大小为495bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含 有甲型流感病毒新甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为363bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含 有甲型流感病毒甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为113bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含 有甲型流感病毒甲型H3N2亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为188bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含 有甲型流感病毒甲型H5m亚型病毒；2)用琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR产物，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示480_510bp的条带，则所述待测样品中候选 含有甲型流感病毒新甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示350_370bp的条带，则所述待测样品中候选 含有甲型流感病毒甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示100_130bp的条带，则所述待测样品中候选 含有甲型流感病毒甲型H3N2亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示170_200bp的条带，则所述待测样品中候选 含有甲型流感病毒甲型H5m亚型病毒；所述鉴别甲型流感病毒亚型的方法不包括疾病的治疗和诊断方法。上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为54°C。上述检测病毒的方法不仅用于临床感染病原体的确定，还可以用于实验室的病原 体检测研究。本发明建立了可以同时检测人类甲型流感病毒H1N1，H3N2, H5N1亚型的多重 RT-PCR方法，该方法首先进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳便可直观的观测到结果。本发明对多重PCR的反应条件进行了优化探索，首先，对混合反应中的引物浓度 进行优化，通过对两倍稀释的引物(浓度0. 4mM-0. 05mM)进行检测找到最佳引物浓度，结果显示当H3N2、新甲型Hmi引物浓度为0. 2mM，H5Nl、季节性流感Hmi引物浓度为0. ImM时， 实验的敏感性最好，当B型流感病毒引物浓度为0. ImM, A型流感病毒引物浓度为0. 05mM 时，实验的敏感性最好。其次，通过对多重PCR的退火温度52°C到58°C的测试来优化反应 条件，最终发现每个反应的退火温度为54°C时，PCR效果最好。实验证明，本发明方法检测结果可靠，灵敏度高(最低可检测到103拷贝数的新甲 型Hi基因)，特异性好；尤其是本发明方法还能区分开新甲型Hmi亚型流感病毒和普通季 节性流感病毒Hmi亚型，这是现有技术不曾实现的；另外，本发明方法无需昂贵的设备，操 作简单、快速，可实现多种病原体的同时快速检测。本发明试剂盒和PCR试剂灵敏度高、特 异性好、来源广泛、成本低廉。本发明为人类流感病毒感染的早期诊断提供了简单易行，行 之有效的方法。
图1为对病毒的PCR检测结果。图2为方法的特异性检测结果。图3为方法的灵敏性检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、甲型流感病毒的不同亚型鉴定此实验使用的具体病毒株如下甲型流感病毒新甲型Hmi亚型的病毒株为A/Beijing/501/2009(H1N1)(猪流感 病毒株)在文献(Liu, B. , Qin, C. , Jiang, T. , Hu, Y. , Li, X. , Zhang, X. , Kang, X. , Deng, Y. , Zhang, Y. , Li, Y. , Liu, H. , Jia, N. , Chang, G, Zhao, H. , Tong, Y. , Qin, E. , Zhu, Q. and Cao, W. Direct Submission Submitted(30-MAY-2009)Department of Virology, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,20DongdaStreet, Beijing, Beijing 100071, Chin)中公开过；(由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提 供)；甲型流感病毒甲型Hmi亚型(即季节性Hmi亚型)的病毒株为A/PR/8/34(HlNl) (季节性流感病毒)在文献(Ryan Vander Veen, Kurt Kamrud, Mark Mogler, Alan T. Loynachan,Jerry McVicker,Peter Berglund,Gary Owens,Sarah Timberlake,Whitney Lewis, Jonathan Smith, and DL Hank Harris, Rapid Development of an Efficacious Swine Vaccine forNovel H1N1 PLoS Curr Influenza. 2009 October 29 :RRN1123)中公 开过，(由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供)；甲型流感病毒甲型H3N2亚型的病毒株为A/Wisconsin/67/2005(H3N2)在文献 (Deyde, V. M. , Xu, X. , Bright, R. A. , Shaw, M. , Smith, C. B. , Zhang, Y. , Shu, Y. , Gubareva, L.V., Cox, N. J. andKlimov, A. I. Surveillance of resistance to adamantanes among influenza A(H3N2)and A(H1N1)virusesisolated worldwide, J. Infect. Dis. 196 (2), 249-257(2007))中公开过，(由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供)；甲型流感病毒甲型H5m亚型的病毒株为A/Beijing/01/2003(H5m)(禽流感病毒)在文献(4Zhu, Q. Y.，Qin, E. D.，Wang, W.，Yu, J.，Liu, B. H.，Hu, Y.，Hu, J. F. and Cao, W. C Fatalinfection with influenza A(H5N1)virus in China. N. Engl. J. Med. 354(25), 2731-2732(2006))中公开过，(由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供)。病毒 Den4 在文献(Dengue virus 4 strain 341750)Kelly, Ε. P.，Puri, B.， Sun, W. and Falgout, B.Identification of mutations in a candidate dengue 4 vaccinestrain 341750 PDK20 and construction of a full-length cDNA clone of the PDK20vaccine candidatej. Vaccine 28 (17)，3030-3037 (2010)中公开过，(由中国人民解 放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供)。MDCK 细胞购自 ATCC，编号为 ATCC No. CRL-2935。QIAamp Viral RNA试剂盒购自Qiagen公司，产品目录号为52904。随机六聚体引物购自Promega公司。dNTP 购自 Promega 公司。EXtaq __ 自 TaKaLa Bio InC, Dalian, China。一、待测样品为病毒1、病毒培养用MDCK细胞分别培养上述各亚型的病毒株，分别得到各亚型病毒株 的细胞培养上清液。2、病毒上清提取RNA:使用QIAamp Viral RNA试剂盒分别对各亚型病毒株的细胞 培养上清液进行RNA提取，提取步骤按照产品使用手册进行，得到各亚型病毒株的RNA。3、RNA的反转录反转录体系分别取上述H3N2亚型、H5m亚型、季节性Hmi亚型、新甲型Hmi亚 型的病毒株RNA 5ul、随机六聚体引物0. 5ul、Iul dNTP (IOmM)、反转录酶Iul，加ddH20补充 体积至20ul。反转录反应条件42°C反应60min。将RNA反转录为cDNA。各亚型病毒株的RNA分别进行反转录。4、cDNA 的 PCR用于鉴别甲型流感病毒亚型的引物均在甲型流感病毒的每一个亚型的HA基因上 进行设计。具体引物序列及各引物的理论扩增长度如表1所示。在表1中引物序列引导下，新甲型Hmi亚型的扩增序列如Genebank accessionnumber GQ223408中自5'末端起第408-902位核苷酸所示，甲型Hmi亚型 的扩增序列如Genebank accession number EF467821中自5'末端起第265-627位核 苷酸所示，甲型H3N2亚型的扩增序列如Genebank accession numberEU103823中自5' 末端起第902-1014位核苷酸所示，甲型H5m亚型的扩增序列如Genebank accession numberEF587277中自5'末端起第914-1101位核苷酸所示。各组的PCR反应体系如下混合组(混合引物)模板为四个亚型病毒的cDNA混合物(四个亚型病毒的cDNA 均为3 μ 1)，引物为表2中四对引物的混合物(四种引物对中两条引物在反应体系中的浓度为新甲型 Hmi 0. 2mM，甲型 Hmi 0. ImM，甲型 H3N2 0. 2mM，甲型 H5m 0. ImM), 5 u 1 10XPCR buffer, 0. 8mM dNTP(即 dATPO. 8mM、dTTPO. 8mM、dGTPO. 8mM、dCTPO. 8mM)，EX taq 酶2. 5U，最后加入DEPC水补充体积至50ul体系。以下为单独的特异性引物新甲型Hmi组新甲型Hmi cDNA 5iU，新甲型Hmi引物lmM，5iil 10XPCRbuffer,0. 8mM dNTP(即 dATPO. 8mM、dTTPO. 8mM、dGTPO. 8mM、dCTPO. 8mM), EX taq 酶 2. 5U，最后加入DEPC水补充体积至50ul体系。甲型 H1N1 组甲型 H1N1 cDNA 5 ii 1，甲型 H1N1 弓丨物 ImM，5 ii 1 10XPCR buffer, 0. 8mM dNTP (即 dATPO. 8mM、dTTPO. 8mM、dGTPO. 8mM、dCTPO. 8mM)，EX taq 酶 2. 5U,最后加入 DEPC水补充体积至50ul体系。甲型 H3N2 组甲型 H3N2 cDNA 5ii 1，甲型 H3N2 引物 lmM，5ii 1 10XPCR buffer, 0. 8mM dNTP (即 dATPO. 8mM、dTTPO. 8mM、dGTPO. 8mM、dCTPO. 8mM)，EX taq 酶 2. 5U,最后加入 DEPC水补充体积至50ul体系。甲型 H5N1 组甲型 H5N1 cDNA 5 ii 1，甲型 H5N1 弓丨物 ImM, 5 ii 1 10XPCR buffer, 0. 8mM dNTP (即 dATPO. 8mM、dTTPO. 8mM、dGTPO. 8mM、dCTPO. 8mM)，EX taq 酶 2. 5U,最后加入 DEPC水补充体积至50ul体系。阴性对照组模板为无关病毒Den4 cDNA (模板体积5ul) ,5u 1 10XPCR buffer, 0. 8mM dNTP, EX taq酶2. 5U，最后加入DEPC水补充体积至50ul体系。引物与上述混合组一致。上述各组的PCR反应条件为95°C预变性5分钟，94°C变性30秒，54°C退火30秒， 72°C延伸1分钟，30个循环，最后一个循环72°C延伸10分钟。表2、用于鉴别甲型流感病毒亚型的引物对 5、PCR产物的检测(1)将上述各组PCR产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳分析；将PCR产物与 0. 5 u g/ml溴化乙锭水溶液混合进行电泳。使用的marker的条带分别为100bp、250bp、 500bp、750bp、1000bp、2000bp。结果如图1所示。图中，HI表示甲型Hmi组，H3表示甲型H3N2组，H5表示甲型H5N1组，sHl表示新甲型Hmi组，Mix表示混合组，N表示阴性对照组。甲型Hmi组，PCR扩增条带的大小在凝胶上显示为350-370bp ；甲型H3N2组，PCR扩增条带的大小在凝胶上显示为100_130bp ；甲型H5m组，PCR扩增条带的大小在凝胶上显示为170_200bp ；新甲型Hmi组，PCR扩增条带的大小在凝胶上显示为480_510bp ；Mix表示混合组，PCR扩增条带在凝胶上显示为如下大小的4条条带350_370bp、 100-130bp、170-200bp、480-510bp ；阴性对照组，未有任何扩增条带。 凝胶结果显示，各亚型单独实验组、混合组均检测出目的条带，目的条带大小与理 论条带接近且在凝胶电泳的误差范围内，而阴性对照组未扩增得到任何条带；各组PCR条 带清晰，无非特异背景。(2)将上述各组PCR产物分别测序结果混合组测得363bp、113bp、188bp和495bp的四个片段，大小与理论扩增大小一
致，且碱基序列正确；甲型Hmi组测得363bp的片段，大小与理论扩增大小一致，且碱基序列正确；甲型H3N2组测得113bp的片段，大小与理论扩增大小一致，且碱基序列正确；甲型H5W组测得188bp的片段，大小与理论扩增大小一致，且碱基序列正确；新甲型Hmi组测得495bp的片段，大小与理论扩增大小一致，且碱基序列正确；综上结果表明，在上述体系和反应条件下，引物扩增的目的片段正确。本发明的引 物及扩增体系和反应程序的特异性好，可以准确的检测出甲型流感病毒的四个亚型。二、待测样品为临床咽式子标本临床咽式子标本取自39份疑似新甲型Hmi病人，均经过患者的同意，分别采自不 同的传染病医院。1、提取咽式子标本的RNA方法将咽拭子标本置于3mlDMED培养液中，使标本中的 病原体进入培养液中，然后取200ulDMED培养液，利用QIAamp Viral RNA试剂盒对咽拭子 标本进行RNA提取，提取步骤按照产品使用手册进行。2、RNA反转录成cDNA的方法与实验一中所述一致。3、cDNA 的 PCR每份咽式子标本的PCR反应体系如下咽式子标本的cDNA 3iU，引物为表2中四对引物的混合物(四种引物对中的两条 引物在反应体系中的浓度为新甲型Hmi 0. 2mM，甲型Hmi 0. ImM，甲型H3N2 0. 2mM，甲型 H5N1 0. ImM), 5 u 1 10 X PCR buffer, 0. 8mM dNTP(即 dATPO. 8mM、dTTPO. 8mM、dGTPO. 8mM、 dCTPO. 8mM)，EX Taq酶2. 5U，最后加入DEPC水补充体积至50ul体系。PCR反应条件为95°C预变性5分钟，94°C变性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸1 分钟，30个循环，最后一个循环72°C延伸10分钟。4、根据PCR产物判断待测咽式子标本中含有哪种亚型的甲型流感病毒，判断方法 如下述⑴或⑵所示(1)将上述各PCR产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳分析；将PCR产物与0. 5 y g/ml溴化乙锭水溶液混合进行电泳。使用的marker的条带分别为100bp、250bp、500bp、 750bp、1000bp、2000bp。若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示480_510bp的条带，则所述待测样品中含有 甲型流感病毒新甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示350_370bp的条带，则所述待测样品中含有 甲型流感病毒甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示100_130bp的条带，则所述待测样品中含有 甲型流感病毒甲型H3N2亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示170_200bp的条带，则所述待测样品中含有 甲型流感病毒甲型H5m亚型病毒。结果，新甲型H1N1阳性4份(10. 2%)，季节性流感Hmi亚型阳性2份(5. 1% ), 季节性流感H3N2亚型阳性12份(30. 7% )0(2)检测所述PCR产物的序列，根据测序结果判定，判定方法如下若所述PCR产物中含有序列大小为495bp的DNA片段，则所述待测样品中含有甲 型流感病毒新甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为363bp的DNA片段，则所述待测样品中含有甲 型流感病毒甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为113bp的DNA片段，则所述待测样品中含有甲 型流感病毒甲型H3N2亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为188bp的DNA片段，则所述待测样品中含有；甲 型流感病毒甲型H5m亚型病毒；结果，新甲型H1N1阳性4份(10. 2%)，季节性流感Hmi亚型阳性2份(5. 1% ), 季节性流感H3N2亚型阳性12份(30. 7% )0再用WHO推荐使用的real-time PCR方法分别检测上述39份咽式子标本，检测 方法如 World Health Organization. CDC protocol of real-time RT-PCR for swine influenza A(H1N1).http://www. who. int/csr/resources/publications/swineflu/ realtimeptpcr/en/index. html (Accessed June 12,2009).所述。结果与用上述本发明方 法检测结果相同。证明上述本发明方法准确可靠。三、方法的灵敏性检测1、人工合成新甲型Hmi亚型病毒株A/California/04/2009的HI基因。(合成的 序列如Genebank accession number FJ966082中自5'末端起第408-902位核苷酸所示)。 新甲型Hmi 亚型病毒株A/California/04/2009在文献(Ryan Vander Veen,Kurt Kamrud, Mark Mogler, Alan T. Loynachan, Jerry McVicker, Peter Berglund, Gary Owens, Sarah Timberlake, Whitney Lewis, Jonathan Smith, and DL Hank Harris, Rapid Development ofan Efficacious Swine Vaccine for Novel H1N1 PLoS Curr Influenza. 2009 October 29 :RRN1123.)中公开过。2、将人工合成的HI基因与pGEM T_Easy质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌，抗 性筛选，挑取单克隆；液体培养单克隆，提取质粒，进行测序验证，结果表明构建的重组质粒 的结构正确。
3、体外转录操作方法按照Promega公司的Riboprobe system-T7试剂盒操作说 明书，产品目录:2710556。4、通过NanoDroplOOO仪器测0D260检测和计算体外转录产物中RNA的表达量。5、用蒸馏水倍比稀释体外转录产物，得到不同RNA拷贝数的溶液，溶液中病毒RNA 浓度为 lxlO8 copies/u 1-lcopies/u 1。6、RNA的反转录及PCR 反转录体系分别取病毒RNA 5ul、随机六聚体引物0. 5ul、lul dNTP(lOmM)、反转 录酶lul，加ddH20补充体积至20ul。反转录反应条件42°C反应60min。将RNA反转录为cDNA。PCR体系引物为表2中四对引物的混合物(四种引物对中各条引物在反应体系 中的浓度为新甲型Hmi 0. 2mM，甲型Hmi 0. ImM，甲型H3N2 0. 2mM，甲型H5m 0. ImM), 5u 1 10 X PCR buffer, 0. 8mM dNTP, EX taq 酶 2. 5U，最后加入 DEPC 水补充体积至 50ul 体系。PCR反应条件为95°C预变性5分钟，94°C变性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸1 分钟，30个循环，最后一个循环72°C延伸10分钟。将上述各PCR产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图3所示。结果显示本发明方法的灵敏度为RNA拷贝数为103COpieS/Ul。 “N”为阴性对照组，即不加模板cDNA组。四、方法的特异性检测用呼吸道病毒检测本发明方法的特异性。使用的病毒株如下人类呼吸道合胞病毒A 型病毒株 RSB5857 [Human respiratory syncytial virus A (strainrsb5857).]在文献(Timsit E, Maingourd C, Le Drean E, Belloc C, Seegers H, DouartA, AssieS. Evaluation of a commercial real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction kit for the diagnosis of Bovine respiratory syncytialvirus infection. J Vet Diagn Invest,2010 Mar ；22 (2) 238-41) 中公开过，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供。人类呼吸道合胞病毒 B 型病毒株 18537[Human respiratory syncytial virus B (strain 18537)]在文献[Lim CS, Kumarasinghe G, Chow VT. Sequence and phylogenetic analysis ofSH, G, and F genes and proteins of Human respiratory syncytial virus isolatesfrom Singapore, j Acta Virol. 2003 ；47 (2) :97_104]中公开过，由中国人民解放 军军事医学科学院微生物流行病研究所提供。人类鼻病毒3 型病毒株 QCE [Human rhinovirus C strain QCE]在文献[Arden KE, Faux CE, 0’ Neill NT, McErlean P, Nitsche A, Lambert SB, Nissen MD, Sloots TP, MackaylM. b Molecular characterization and distinguishing features of a novelhuman rhinovirus (HRV)C, HRVC-QCE, detected in children with fever, cough andwheeze during 2003. J Clin Virol. 2010 Mar ；47 (3) :219_23. Epub 2010 Jan 27.]中 公开过，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供。A SO ^ ^！ # 1 M ^！ # tt Washington/1964 [Human parainfluenza virus lstrain Washington/1964]在文献[Newman JT, Surman SR, Riggs JM, Hansen CT, Collins
11PL，Murphy BR, Skiadopoulos MH. Sequence analysis of theWashington/1964 strain of human parainfluenza virus type 1 (HPIV1)and recoveryand characterization of wild-type recombinant HPIV1 produced by reversegenetics. J Virus Genes. 2002 ； 24(1) =77-92.]中公开过，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供。将各呼吸道病毒毒株分别进行如下检测实验。病毒培养、病毒上清提取RNA、RNA的反转录均与实验一中所述一致。cDNA的PCR反应体系模板为各呼吸道病毒的cDNA 3u 1,引物为表2中四对引 物的混合物(四种引物对中的两条引物在反应体系中的浓度为新甲型Hmi 0. 2mM,甲型 H1N1 0. ImM，甲型 H3N2 0. 2mM，甲型 H5N1 0. ImM), 5 u 1 10 X PCR buffer, 0. 8mMdNTP, EX taq酶2. 5U，最后加入DEPC水补充体积至50ul体系。cDNA的PCR反应程序与实验一中所述一致。结果如图2所示(RSA表示人类呼吸道合胞病毒A型，RSB表示人类呼吸道合胞病 毒B型，RHV表示人类鼻病毒3型，PAIF表示人类副流感病毒1型)。显示以各呼吸道病 毒的cDNA为模板时，均未扩增出任何条带，表明本发明方法的特异性好。
权利要求
一种引物组合物，为如下1)或2)所示1)由如下引物对a)、b)、c)和d)组成；2)由如下引物对a)、b)、c)和d)中的至少一种组成；a)一条引物序列如序列表中序列1所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示；b)一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示；c)一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示；d)一条引物序列如序列表中序列7所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。
2.一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒，为权利要求1中所述引物组合物； 所述甲型流感病毒亚型为新甲型Hmi亚型、甲型Hmi亚型、甲型H5m亚型或甲型H3N2亚型。
3.一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的PCR试剂，由权利要求1中所述引物组合物、PCR 缓冲液、dNTPs和ExTaq酶组成。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于所述a)所示引物对中的两条引物在 所述PCR试剂中的浓度均为0. 2mM ；所述b)所示引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的 浓度均为0. ImM ；所述c)所示引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. ImM ；所 述d)所示引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 2mM。
5.根据权利要求3或4所述的PCR试剂，其特征在于所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP 和dCTP的等摩尔比混合物，所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP在所述PCR试剂中的浓度均为 0. 8mM。
6.权利要求1中所述引物组合物在制备用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒中的应用。
7.权利要求1中所述引物组合物在制备用于鉴别甲型流感病毒亚型的PCR试剂中的应用。
8.一种鉴别甲型流感病毒亚型的方法，包括如下步骤用权利要求3-5中任一所述PCR 试剂对待测样品的cDNA进行PCR扩增，检测PCR产物的大小，确定所述待测样品中甲型流感病毒亚型；所述确定所述待测样品中甲型流感病毒亚型的方法为下述1)或2)所示1)检测所述PCR产物的序列，若所述PCR产物中含有序列大小为495bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含有甲 型流感病毒新甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为363bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含有甲 型流感病毒甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为113bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含有甲 型流感病毒甲型H3N2亚型病毒；若所述PCR产物中含有序列大小为188bp的DNA片段，则所述待测样品中候选含有甲 型流感病毒甲型H5m亚型病毒；2)用琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR产物，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示480-510bp的条带，则所述待测样品中候选含有 甲型流感病毒新甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示350-370bp的条带，则所述待测样品中候选含有 甲型流感病毒甲型Hmi亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示100-130bp的条带，则所述待测样品中候选含有 甲型流感病毒甲型H3N2亚型病毒；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶上显示170-200bp的条带，则所述待测样品中候选含有 甲型流感病毒甲型H5m亚型病毒；所述鉴别甲型流感病毒亚型的方法不包括疾病的治疗和诊断方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的退火温度为54°C。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴别甲型流感病毒亚型的试剂盒。试剂盒包括如下引物对一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示；所述甲型流感病毒亚型为新甲型H1N1亚型、甲型H1N1亚型、甲型H5N1亚型或甲型H3N2亚型。实验证明，本发明方法检测结果可靠，灵敏度高(最低可检测到新甲型H1基因的103拷贝数)，特异性好；尤其是本发明方法还能区分开新甲型H1N1亚型流感病毒和普通季节性流感病毒H1N1亚型，这是现有技术不曾实现的；另外，本发明方法无需昂贵的设备，操作简单、快速，可实现高通量快速检测。本发明试剂盒和PCR试剂灵敏度高、特异性好、来源广泛、成本低廉。本发明为人类流感病毒感染的早期诊断提供了简单易行，行之有效的方法。
文档编号C12Q1/70GK101875933SQ20101021583
公开日2010年11月3日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者刘洪 , 孙婷婷, 常国辉, 康晓平, 李永强, 李裕昌, 杨银辉, 林方, 熊伟, 祝庆余, 蔡绪禹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所