专利名称：菌血症检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于临床微生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定血液样本病原菌的 试剂盒及检测方法。
背景技术：
世界范围内成人和儿童菌血症都是高发病率和死亡率疾病。每年世界范围内菌血 症病例有2千万，即使在发达国家医疗实践中，菌血症仍然具有很大的挑战，特别是新生儿 监护病房、移植病房，住院病人、免疫抑制和术后病人、血液病患者等因病原体不能鉴定而 应用广谱抗生素或不适当抗生素治疗导致治疗延误的死亡率极高，欧洲每年有135000例 死亡，美国有215000例。为达到较好的治疗效果，针对性的抗生素应在症状发生6小时内 使用。细菌早期鉴定对免疫抑制病人尤为重要，他们较一般患者感染细菌的范围更广，更难 以预知，这样的选择主要取决于治病因素一细菌的鉴定，药敏试验确证。当鉴定结果是阴 性，提示临床医生可能是非常见条件致病菌存在。对非培养快速检测技术颇有微词的是不 能提供药敏结果，虽然耐药基因研究已有很大进展，并且能提供更符合体内耐药情况的结 论，但仍有很多机制不明，特别是泛耐药情况还难以通过基因手段进行完全解决。然而，每 一地区流行菌原菌的药敏情况大多可以通过过去的经验预知，特别是在一些教学医院，每 月的院感报告可以提供流行病原菌的药敏信息，这些信息通常为菌血症患者提供指导治疗 方案。因此，快速鉴定病原菌从而尽早开始针对性治疗，可以大大改善临床治疗效果。菌血症病原体诊断的金标准是血培养，获得阳性结果需要1-3天，此外，阳性标本 还需要1-2天的细菌鉴定和药敏试验，需要特殊培养基的细菌要获得阳性结果则需要更长 时间。因血量不足，血液中抗生素的存在及需要特殊营养等条件的限制而导致的敏感性低 也是传统培养的一个限制因素。此外，传统的鉴定方法在获得阳性结果后还要进行革兰氏 染色，生化反应鉴定等，而这其中有很多潜在的问题①低特异性病原体需要加做试验；② 往往要多个生化试验同时进行；③生化鉴定前要分离纯化，至少需要1-3天；④表型试验不 能重复。因此迫切需要新的更快更精确的细菌鉴定方法。基因芯片技术虽然能够同时进 行多种细菌的同时鉴定，但涵盖菌种仍然十分有限，对非常见菌、突变或新菌种更是无能为 力，就目前技术而言其成本太高也是重要制约因素，杂交方式固有的局限性必然也影响其 特异性。近年来，质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定，但质谱鉴定必须是培养 后分纯的单克隆菌落，加之设备昂贵，技术操作难度高等限制了其应用。应用PCR技术直接 从临床样本中检测致病菌，与培养相比有很多优点，然而，即使PCR扩增技术早已经被广泛 应用于病毒检测，但由于成本，设备、不同DNA抽提效率差异，潜在的产物污染等问题，PCR 技术进行血液细菌鉴定仅限于研究，特别是当检测多种病原体时更是一个巨大的挑战。在实际工作中，很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要。 由于16SrRNA在所有的细菌中都以多拷贝形式存在，并且包含高度保守和可变区域，能够 同时满足扩增和进行比较的要求，因此以16SrRNA序列分析为基础，采取毒力和毒素基因鉴定方法，能够直接使用临床标本，在最短的时间内鉴定未知或不可培养的细菌，对细菌性 新发传染病做出准确判定。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行 电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反 应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模 板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可 最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入 的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于 构建标准化操作流程，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴 定及耐药检测。Monstein等(2001)用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因16S rDNA的Vl和V3区序列，将胃镜活检标本中得到的23个幽门螺杆菌标本依据其Vl区的核 苷酸序列差异，鉴定出8种不同的等位基因类型，除11个样本与幽门螺杆菌26695株序列 一致、1个样本与199株的序列一致外，根据Vl区的改变表现为有1个或2个核苷酸的突 变或单个核苷酸的插入而分为4个等位基因类型。另有2个标本的V3区出现C至T转换， 证明此技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型。Urmer stad等 (2001)利用焦磷 酸测序技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，根据inIB基因第 1575位和1578位核苷酸的变化，将血清型l/2a和l/2c分为一组，l/2b和3b分为一组，而 血清型4b又可分为2个组。该技术还被应用于百日咳杆菌(Bordetella pert ussis)与 副百日咳杆菌(Parapert ussis)等细菌的快速鉴定及分型(Ronaghi等，1999)。Martin等 (2006)运用此技术对百日咳杆菌毒力相关ptxSl基因进行了分型鉴定，并与定量PCR作了 方法学的比较，结果显示两种方法具有很好的一致性，焦磷酸测序技术适合百日咳杆菌的 大规模筛选。此外，Alistair等(2003)用焦磷酸测序技术检测肠球菌的23s rRNA上的抗 利奈唑胺位点，并与PCR-RFLP方法比较，结果显示了 100%的一致性。Marjo等(2005)用焦 磷酸测序技术检测鸟分支杆菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，空肠弯曲杆菌，流感(嗜血)杆菌 等多种病原体的23S rRNA基因2058位多态性，以获得病原体的大环内脂抗药性信息。赵 锦荣等(2005)建立了基于焦磷酸测序技术的高通量检测耐利福平结核分支杆菌的方法， 并用传统的测序方法进行验证，结果显示了 100%—致性，他们认为这种方法具有自动化程 度高和结果准确等特点，相比传统的测序，具有更快速，简便等特点，适用于耐利福平结核 分支杆菌的快速高通量的检测。本研究通过设计软件对常见临床细菌测序引物随后25bp的序列进行了排列组 合，产生了多重不同细菌感染的焦磷酸测序虚拟模式数据库，血培养阳性样品经DNA抽提、 通用引物扩增，然后用通用引物作为测序引物，测序结果与焦磷酸测序虚拟模式数据库比 对判断型别。该方法能一次测序区分常见临床细菌及不同细菌的混合感染，可用于细菌感 染的临床诊断及耐药监测。采用的空白对照可以在型别判断中有效扣除可能发生的污染， 解决了高的灵敏度必然带来难以控制的污染难题。快速可靠鉴定血液中细菌种属的重要意 义在于①合理应用抗生素，避免无效用药；②改善预后；③减缓获得耐药；④减少医疗费 用。不合适抗生素应用常常导致治疗失败，而使住院期延长，并发症，耐药以及检验费用增 加等后果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速可靠的菌血症检测试剂盒。本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。为解决上述技 术问题，本发明采用的技术方案如下一种菌血症检测试剂盒，它包括(1)扩增细菌16S rRNA的Vl可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 和SEQ ID NO 2所示引物对；(2)测序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；(3)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO :1在其5，端标记生物素；在一次检测中共同使用。上述菌血症检测试剂盒，具体包括如下试剂(I)DNA 提取试剂核酸纯化柱，Buffer Li, Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, Buffer TE ；(2)反应液PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO :1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具体为0. 1 % (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02 % (ν/ν)明胶，0.06% g/mL BSA,0. 1% (ν/ν) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9Tricine。(3)单链纯化试剂75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH，IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate 溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；其中，结合缓冲液具体为10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火缓冲液具体为20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸镁。(4)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物 APS，荧光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一种菌血症检测试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是 包括(1)扩增细菌16S rRNA的Vl可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3 和SEQ ID NO 4所示引物对；(2)测序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；(3)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO 3在其5，端标记生物素；在一次检测中共同使用。上述菌血症检测试剂盒，具体包括如下试剂(I)DNA 提取试剂核酸纯化柱，Buffer Li, Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, Buffer TE ；(2)反应液PCR Buffer，通用引物 SEQ ID NO :3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具体为:0· 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02% (ν/ν)明胶，0· 06% (w/v) g/mL BSA，0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06M ρΗ8· 9Tricine。(3)单链纯化试剂75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2M NaOH, IOmM pH 7. 6Tris-Acetate 溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；其中，结合缓冲液具体为10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火缓冲液具体为20mM pH 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸镁。
(4)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物 APS，荧光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。本发明所检测的菌为狭义的细菌，包括假单胞菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、链球 菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、不动杆菌属。上述菌血症检测试剂盒的检测方法包括如下步骤(1)提取细菌 DNA ；(2)以步骤⑴所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的Vl可变区的 PCR扩增；(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；(5)测序结果与数据库比对判断细菌种属。步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :10· 3μ L， SEQ ID NO :20. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加 无菌水至 50 μ L ;PCR 扩增条件为94°C 3min ;28 个循环(94°C 25s, 42 °C 30s, 72 °C 20s)； 72°C 3min。或者将SEQ ID NO 3替换上述SEQ ID NO :1，同时将SEQ IDNO 4替换上述SEQ IDNO :2，其它PCR扩增体系和条件相同。有益效果本发明的试剂盒利用焦磷酸测序技术测定的Vl正向区段的序列和数 据库比对判断细菌种属。应用此试剂盒能一次测序鉴定血液样本细菌种属。可用于菌血症 及败血症的临床诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方 便，特异性强的优点。本发明方法可以使血液样本细菌种属鉴定时间大大缩短，成本为传统 鉴定法的三分之一(本发明方法检测时间约4 5小时)，另外，通过序列比对鉴定细菌是 菌种鉴定的终极方法，特别是对一些难鉴定菌，序列比对鉴定更具优势。
图1为1例血培养阴性标本致病菌检测结果图，测序结果为阴性。图2为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为 GAATCCAGGAGCAAGCTCCC TTCATCCG，与数据库比对判定为铜绿假单胞菌。图3为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为 AACGTCAGAGGAGCAAGCTC CTCG,与数据库比对判定为表皮葡萄球菌。图4为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为 AACAGACGAGGAGCTTGCTC CTTTG,与数据库比对判定为人葡萄球菌。图5为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为 GTAACAGGAAGAAGCTTGCT TC,与数据库比对判定为大肠埃希菌。图6为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为CCCGTCCCATTTTTCCCCCGGATGGGAAGGACGAACGAACGTCCCGGTTCGG，与数据库比对判定为屎肠球菌和嗜麦芽窄食单胞 菌混合感染。图7为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为 CCTCTTTTCCGGTGGAGCAA GCTCCGGTGG,与数据库比对判定为屎肠球菌。图8为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为 CGTCACCCAAGGAGCAAGCT CCTC,与数据库比对判定为弗氏柠檬酸杆菌。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 试剂盒的制备方法。
(I)DNA 提取试剂核酸纯化柱，购于杭州新捷生物科技有限公司，Buffer Li, Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, Buffer TE，购于杭州新捷生物科 技有限公司。(2)反应液PCR Buffer 0. 1% (v/v)NP_40 (购于美国 Sigma 公司),0. 02% (ν/ν)明胶(购 于美国 Sigma 公司)，0.06% g/mL BSA (购于美国 Sigma 公司)，0· (v/v) Tween-20 (购 于美国Sigma公司)，0. 06M pH8. 9Tricine (购于德国Merck公司)，通用引物SEQ ID NO :1 2或SEQ ID NO 3 4，由上海英俊生物科技有限公司 合成。MgCl2 购于美国Sigma公司，0. 2mM dNTPs 购于上海鼎国生物技术有限公司，2U/ μ LTaq DNA 聚合酶购自美国 Fermentas 公司。(3)单链纯化试剂75% (ν/ν)乙醇溶液购于杭州长征化学试剂有限公司，0. 2Μ NaOH:购于上海试四赫维化工有限公司，IOmM Tris-Acetate (ρΗ 7.6) :Tris_base 购于美国 Sigma 公司，无水乙酸购于杭 州化学试剂有限公司，结合缓冲液由IOmM Tris-HCl (Tris_base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化 学试剂有限公司)，2M NaCl (购于上海试四赫维化工有限公司)，ImM EDTA(购于杭州化学 试剂有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (购于美国Sigma公司)组成，退火缓冲液由20mM Tris-Acetate (ρΗ 7. 6) (Tris-base 购于美国 Sigma 公司， 无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组 成。亲和素标记的磁珠(购于 GE healthcare Bioscience AB)。(4)测序试剂DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶购于QIAGEN公司，底物APS和荧光素购于QIAGEN公司，
四种 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)购于 QIAGEN 公司。实施例2 检测方法。仪器Bio-RadS1000PCR 仪，Beckman Microfuge 22R 台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。(1)提取细菌DNA，具体包括如下步骤(Ia)力口 300uL Buffer Ll 到 1. 5mL 离心管中。(Ib)加入400uL全血，盖上管盖，漩涡震荡30秒。(Ic)加入300uL Buffer L2，剧烈摇晃离心管3_5次，再漩涡震荡30秒混勻。(Id) 13000rpm 离心 2 分钟。(Ie)将步骤(Id)中的上清液倒入到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。(If)弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，在核酸纯化柱中 加入500uL Buffer WA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。(Ig)弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回2mL离心管中，在核酸纯化柱中加 入 600uL Buffer WB,盖上管盖，12000rpm 离心 30 秒。(Ih)弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，14000rpm离心 1分钟。(Ii)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1. 5mL离心管中，在纯化柱中加 入IOOuL 56°C温育的Buffer TE,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。(Ij)弃纯化柱，洗脱的DNA作为PCR模板。(2)以步骤⑴所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的Vl可变区的 PCR扩增；其中，所述的PCR 扩增体系为10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ IDNO :20. 3 μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加无菌水 至 50 μ L ；PCR扩增条件为-MV 3min ；28 个循环(94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s) ；72°C 3min ； 或者将SEQ ID NO :3替换上述SEQ ID NO :1，同时将SEQ ID NO :4替换上述SEQ ID NO 2, 其它PCR扩增体系和条件相同。(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化 在使用前，保证所有溶液都达到室温； 在 PSQ 96 板中加入 45 μ 1 annealing buffer，然后每孔加入 SEQ ID NO :2 测 序引物(IOuM)O. 5uL ； 使用Vertex混勻S印harose beads，将需要使用的s印haroe beads总量(每样 本3yL)转移至Ij 一个Eppendorf■管中，在s印harose bead中力口入binding buffer，使得平 均每个样品约有50 μ L的体积，将混合物混勻； 将以上混合物加入PCR产物(50 μ L反应体积)中，每样本50 μ L，将PCR产物在 常温下混勻10分钟，使得beads与生物素结合； 在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70%乙 酉享、washing buffer 禾口 120ml Denaturation buffer ； 打开 vacuum prep workstation 的泵，将 vacuum prep tool 在高纯水中清洗 30vacuum prep tool PCR , MM sepharose beads, vacuum prep tool 放入70%乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washing buffer中 清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放s印harose beads ； 使用高纯水清洗 vacuum pi^p tool。将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温后 放入测序仪中。(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；(5)测序结果与美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库比对判断细菌种属。将本发明方法用于8例临床血培养阳性标本的鉴定，测序图如图1-8所示 。本发 明方法鉴定结果与经微生物培养、致病菌分纯后用法国生物梅里埃的微生物鉴定系统做比 对，结果一致。
权利要求
一种菌血症检测试剂盒，其特征在于它包括(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物对；(2)测序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；(3)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ IDNO1在其5’端标记生物素；在一次检测中共同使用。
2.根据权利要求1所述的菌血症检测试剂盒，其特征在于它包括如下试剂(1)DNA提取试剂核酸纯化柱，Buffer Li，Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, BufferTE ；(2)反应液PCRBuffer，通用引物 SEQ ID N0:1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaqDNA聚合酶；(3)单链纯化试剂75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate溶液， 结合缓冲液，退火缓冲液；(4)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧 光素和dNTP。
3.—种菌血症检测试剂盒，其特征在于它包括权利要求1所述的所有核苷酸序列的碱 基互补序列，也就是包括(1)扩增细菌16S rRNA的Vl可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示引物对；(4)测序引物其核苷酸序列如SEQID NO :4所示；(5)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO :3在其5，端标记生物素； 在一次检测中共同使用。
4.根据权利要求3所述的血液样本细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂(1)DNA提取试剂核酸纯化柱，Buffer Li，Buffer L2, Buffer WA, Buffer WB, BufferTE ；(2)反应液PCRBuffer，通用引物 SEQ ID N0:3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaqDNA聚合酶；(3)单链纯化试剂75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate溶液， 结合缓冲液，退火缓冲液；(4)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧 光素和dNTP。
5.一种菌血症检测试剂盒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤(1)提取血液中细菌DNA;(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16SrRNA的Vl可变区的PCR 扩增；(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；(5)测序结果与数据库比对判断细菌种属。
6.根据权利要求5所述的菌血症检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所 述的 PCR 扩增体系为10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ ID NO 20. 3μ L, Template DNA 3μ L,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加无菌水至 50 μ L ;PCR 扩增条件为:94°C 3min ；28 个循环，94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s ；72°C 3min。
7.根据权利要求5所述的菌血症检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所 述的 PCR扩增体系为10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 30. 3μ L, SEQ ID NO 40. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加无菌水至 50 μ L ;PCR 扩增条件为:94°C 3min ；28 个循环，94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s ；72°C 3min。
全文摘要
本发明涉及临床微生物鉴定领域，提供了一种快速鉴定血液样本中细菌的试剂盒及方法。该试剂盒包括2条通用引物扩增细菌16S rRNA的V1可变区，1条测序引物测定V1正向区段的序列，亲和素标记的磁珠，测序结果与数据库比对判断种属。应用此试剂盒能一次测序区分血液样本中的细菌，可用于菌血症以及败血症的临床诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。
文档编号C12Q1/68GK101864490SQ20101022099
公开日2010年10月20日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者任绪义, 吕江峰, 虞闰六 申请人:杭州迪安医学检验中心有限公司