鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的制作方法

专利名称：鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡致病性外源性禽白血病病毒核酸探针交叉斑点杂交检测试剂 盒，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
禽白血病及禽白血病病毒禽白血病毒(ALV)是一种基因组为单股RNA的反转录病毒，类似于人的艾滋病毒， 但不感染人。不同的鸟类可能感染不同的ALV，根据病毒与宿主细胞特异性相关的囊膜蛋白 的抗原性，ALV可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十个亚群。但自然感染鸡群的还只有A， B，C，D，E和J六个亚群。有致病性的分属于A、B、C、D和J亚群，其中的J亚群对鸡的致病 性和传染性最强。而E亚群是非致病性的或者致病性很弱，但也有个别外源性ALV的致病 性也很弱。由致病性ALV引发的鸡白血病可表现为多种不同脏器不同细胞类型的肿瘤，在严 重感染的鸡群其死淘率可高达20 %。此外，ALV感染还能弓I起生长迟缓、免疫抑制和产蛋下 降等病理表现，对养鸡业的危害很大。1.禽白血病病毒外源性病毒和内源性病毒ALV与其他病毒不同的一个最大特点 是，鸡的ALV还可分为外源性ALV和内源性ALV 二大类。鸡的外源性ALV是指不会通过宿 主细胞染色体传递的ALV，包括A，B, C，D和J亚群，致病性强的鸡ALV都属于外源性病毒。 它们既可以象其他病毒一样在细胞与细胞间以完整的病毒粒子形式在个体与群体间通过 直接接触或污染物发生横向传染，也能以完整的病毒粒子形式通过鸡胚从种鸡垂直传染给 后代。内源性ALV是指前病毒cDNA可整合进宿主细胞染色体基因组、并能稳定遗传，因而 可通过染色体垂直传播的ALV0它可能只是基因组的不完全片断，不会产生传染性病毒，一 般也与致病性无关。但也可能是全基因组因而能产生传染性病毒，不过这类病毒通常致病 性很弱或没有致病性。目前发现的能产生传染性病毒的内源性ALV都属于E亚群。鸡细胞 基因组某个特定位点含有(稳定地整合)能复制可传染性病毒粒子的E亚群ALV的全基因 组，如性染色体Z上与决定快慢羽相关基因K紧密连锁的ev21位点。从这个ev21可产生 传染性病毒EV21。(Bacon et al. 1988, Poultry Science)。E亚群内源性ALV通常没有致 病性，但会干扰对白血病的鉴别诊断。种鸡群净化ALV，在现阶段主要是净化外源性病毒。 我们了解鸡群有无ALV感染，在现阶段也仅是指外源性病毒感染，特别是那些有致病性的 外源性ALV感染。2.养鸡业对鉴别外源性病毒和内源性病毒的需求。近几年来，鸡白血病在我国不 同地区的流行呈漫延趋势。为了有效地预防控制鸡群中ALV的流行，必须要解决二个问题 (1)鸡的肿瘤病的病原学鉴别诊断；(2)种鸡的净化。虽然目前已有商品化的ALV的p27抗 原检测试剂合用于病料或其它样品中ALV的检测，但由于p27是各个亚群共同的抗原，因此 对P27抗原的检测不能区别致病性的外源性ALV和无致病性的内源性ALV，不能直接用于病料或其它样品中有无致病性外源性ALV的鉴别性检测。而常规鸡群中，许多个体都携带内 源性E亚群ALV或其它亚群ALV的基因组片段，因此，不论是为了现场病例的鉴别诊断还是 为净化ALV对原祖代鸡群的定期检测都有赖于对外源性ALV的鉴别性检测，特别是那些有 致病性的外源性ALV。目前用于外源性ALV鉴别性检测的方法有二种将肿瘤病料或其它待检样品(如 血浆、蛋清等)接种于对内源性E亚群ALV有抵抗力的Dfl细胞上，培养14天后，再用商品 化的ALV p27抗原ELISA检测试剂盒检测培养上清液或细胞裂介液中的p27。如果检测出 P27抗原，表明检测出外源性ALV。或用相应的ALV特异性抗体做简接荧光抗体反应(IFA) 来观察有无ALV感染。这一方法也可适用于大量样品的检测(如大于100份)，但细胞培 养分离病毒这种试验一般需要在能熟练实施细胞培养技术的专业化试验室内完成。这一方 法，一般需要10 15天才能完成。而且检测水平受细胞培养的状态影响很大，对实验室技 术和经验的要求非常高。另一个方法是从病料或样品中直接用PCR扩增ALV的env基因和 LTR，将选择到的PCR产物克隆送商业化公司做核酸测序，根据完整的env基因和LTR的序 列比较，以确定是否存在有致病性的外源性ALV。应用这一技术一般需要1-3周的时间(决 定于操作人员技术和商业公司服务的即时服务效率，这是不可控的)，且这一方法不适合于 需检测大量样品的种鸡群净化的检测。对大量不同亚群ALV分离株(包括大约15个国际参考株及约20个我们自行分 离鉴定的我国分离株)的序列比较证明，有致病性的外源性ALV在其的基因组3'末端 的U3独特区片段的同源性均在80%以上，而与无致病性的内源性E亚群ALV的U3片段 间的同源性均在40%以下。(见附表1，2，3和4)。近几年来在美国和中国均报道了一些 具有内源性ALV的U3区的重组A亚群外源性ALV(Zavala and Cheng. 2006. Detection and characterization of avian leukosis virusin Marek' s disease vaccines. Avain Dis, 50 :209-215. ；Zavala G, Cheng S, Jackwood MW. Molecularepidemiology of avian leukosis virus subgroup J and evolutionary history of its 3' untranslated region. Avian Dis, 2007, 51 (4) :942_53.；张青婵，赵冬敏，郭慧君，崔治中.Isolation and Identification of a Subgroup A Avian Leukosis Virus fromlmported Meat-type Grand-parent Chickens. Virologica Sinica. 2010, 25(2) : 130-136),这给 U3区核酸特异性的意义提出了疑问。但不论是带有内源性ALV的U3的美国重组病毒 PDRC-1339、PDRC-1346 和 PDRC-1349 (Zavala G, Cheng S. Experimental infection with avianleukosis virus isolated from Marek' s disease vaccines. Avian Dis,2006b, 50(2) -.232-237. ；Barbosa et al. ,Molecular characterization of three recombinant isolates of avianleukosis virus obtained from contaminated Marek' s disease vaccines. Avian Dis. 2008,52 -.245-252.)，还是本发明人分离鉴定的重组病毒SDAU09E1 株，它们的致病性及在体内体外细胞培养上的复制能力均较常规的有致病性的外源性ALV 低得多。这些毒株虽然属外源性，但由于致病性弱或在细胞上的复制能力很弱，显著不同于 危害养鸡业的致病性外源性ALV。本

发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时鉴别性地检测大量样品中的有致病性的外源 性ALV的特异性狄可辛核酸探针试剂盒。通过对样品DNA提取物或样品DNA的PCR产物做交叉斑点分子杂交，鉴别性地检测样品中致病性外源性ALV。本发明所涉及的试剂盒是分别利用致病性外源性和低致病性的或内源性的ALV 的4个代表株的U3片段为模板，用特定引物通过PCR合成了经狄高辛(DigoxiaenimDIG) 标记的特异性核酸探针。通过交叉斑点分子杂交，这些探针将可用于检测病料样品中致病 性外源性ALV病毒特异性核酸的存在，用于判定有无外源性致病性ALV病毒感染。利用这 一方法，在1张8 X 8cm大小的硝酸纤维膜或尼龙膜上可同时检测约80份病料的核酸样品。 将病料组织样品核酸提取物直接加样或将其PCR产物加样后，如将同一批样品的核酸提取 物分别点在4张膜上，分别用4个不同特异性U3片段的核酸探针作交叉斑点分子杂交，可 在24 36小时内完成检测并报告结果。本申请专利“交叉斑点分子杂交法”的原理是在自然状态下和在一定的温度和离 子强度范围内，DNA分子的二条链是以双螺旋的形式以非共价键结合在一起的。但随着温 度的升高和离子强度的下降，二条链分离的比例(趋势)逐渐增大，最终完全分离呈游离单 链状态。而且这一过程是可逆的。例如，自然DNA分子的二条链，在68°C下离子强度0. OlM 和PH7. 6的条件下，有50%的分子二条链呈分离状态。当在温度超过95°C，所有DNA分子 全部分离变成单链分子。但在温度下降时，特别是降低到68°C以下或更低时，二条链又会 重新结合起来。分子杂交是利用双链DNA的变性和复性是可逆性这一特点。但在分子杂 交时，这种结合不一定要分子的原有二条单链的结合。类似的不同分子来源的二条链也可 随机结合，即所谓的分子杂交。这取决于二条互补单链所来源的DNA分子的核酸序列同源 性程度和分子杂交条件的严格性程度(Stringency)。同源性高的不同DNA分子的单链间， 在严格的杂交条件下，也会发生结合(即所谓杂交)。但在较宽松的条件下，即使同源性在 80%左右的不同DNA分子的单链间也能发生结合。但是，在核酸序列同源性低而差别很大 的DNA分子(如同源性低于50%或更低)的单链间，则不会发生结合，或结合程度很弱。我们对不同亚群的大量国内ALV毒株的比较发现，致病性外源性ALV的不同毒株 的U3区的核酸序列同源性均在80%以上。另一方面，非致病性的E亚群内源性ALV或低致 病性的天然重组A亚群ALV的U3区相互间同源性也在80%以上。但与致病性外源性ALV 的U3的同源性均在40%以下。在本申请专利的交叉斑点分子杂交中，所有待检的核酸样品 均分别按序在四张硝酸纤维膜(或尼龙膜)上加样。在四张膜上，还同时滴加了未经标记 的四株ALV的U3片段核酸作为特异性对照。在用4个不同毒株的U3区的特异性探针分别 对四张膜各自实施分子杂交反应后，将待检各样品在与不同探针的杂交反应中的显色程度 特别是与对照样品交叉显色程度的对比，即可对待检样品中是否存在致病性外源性ALV核 酸作出判断。发明的详细描述一、致病性外源性ALV的U3片段和无致病性内源性ALV-U3片段核酸探针及其非 标记对照DNA的制备(一 )致病性外源性J亚群ALV-NXO101株U3片段(序列1)PCR法制备地高辛标 记探针1. NX0101株U3_138bp片段的扩增(用作非标记的对照DNA)引物F TTATAAGGAAAGAAAAGGCACTGT (序列 5)R CTGTAATGCGGAACTAAGGAGC (序列 6)
模板NX0101株病毒3，-LTR克隆质粒pNX0101_LTR(本发明人制备和测序并保 存)，PCR体系如下表1。表1NX0101株U3_138bp片段常规PCR扩增的反应体系(25 μ 1)

注10XBuffer(Mg2+free)成分100mmol/LTris. Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明胶。将上述成分加入灭菌的PCR管中，混和均勻后，离心后置于PCR扩增仪。按照以下 扩增程序进行反应。PCR扩增程序为首先95°C，4min预变性其次95°C，40sec,55°C，40sec, 72°C，lmin,进行 30 个循环；最后72°C，延伸5min ；置4°C保存。NX0101株U3-138bp片段PCR产物DNA电泳图谱见图5a。2. NX0101株U3片段PCR法制备地高辛标记探针以表1中的pNXO 101-LTR质粒DNA为模板进行PCR扩增，反应体系见表2。表2NX0101株U3片段PCR法制备地高辛标记探针的反应体系 PCR 反应条件为95°C 预变性 4min，95°C 变性 40sec，55 °C 退火 40sec，72 °C 延伸 lmin,共30个循环，最后72°C延伸7min。PCR产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果 见图5b。( 二)致病性外源性B亚群ALV的SDAU09C2株(赵冬敏，张青婵，崔治中.芦花 鸡中B亚群禽白血病病毒的分离与鉴定.病毒学报.2010，26(1) :74-78)U3片段(序列2) PCR法制备地高辛标记探针1. SDAU09C2株U3_198bp片段的扩增(用作非标记的对照DNA)模板质粒DNA :p-SDAU09C2_LTR(本发明人克隆鉴定和保存)引物F :ACCCTTATGTAACGATGAC (序列 7)R :AGCTAGCTACTTAAATACAACA (序列 8)PCR反应体系见表3。表3SDAU09C2株U3_198bp片段的常规PCR扩增反应体系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分lOOmmol/LTris.Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明胶。将上述成分加入灭菌的PCR管中，混和均勻后，离心后置于PCR扩增仪。按照以下扩增程序进行反应。PCR扩增程序为首先95°C，5min预变性其次95°C，40sec,53°C，40sec, 72°C，50sec，进行 30 个循环；最后72°C，延伸5min ；置4°C 保存。ALV-B-U3-198bp片段电泳图谱见图6a。2. SDAU09C2株U3片段狄高辛标记探针的制备模板质粒DNA :p-SDAU09C2-LTR (同上)，PCR扩增反应体系见表4。表4SDAU09C2株U3片段狄高辛标记探针制备使用的反应体系 PCR反应条件为95 V预变性4min，95 °C变性40sec，53 °C退火50sec，72 V延伸 lmin,共30个循环，最后72°C延伸7min。PCR产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果 见图6b。(三)低致病性重株病毒SDAU09E1株(朱美真，吴玉宝，崔治中等。地方品系鸡中 一株A亚群鸡白血病病毒的分离和鉴定。中国动物传染病学报，2009，17 (4) 31-35)内源 性特异性U3片段(序列3)狄高辛标记探针的制备1. SDAU09El-U3-134bp片段的扩增(用作非标记的对照DNA)模板质粒DNA :p-SDAU09El_LTR(本发明人克隆测序保存)引物F CCAAATAAGGAAAGCCAGAAG (序列 9)
R TTCGTCTACGCCCATCAGG (序列 10)PCR反应体系如表5。表5SDAU09E1-U3_134bp片段扩增的反应体系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分IOOmmo1/L Tris. Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl明胶。将上述成分加入灭菌的PCR管中，混和均勻后，离心后置于PCR扩增仪。按照以下 扩增程序进行反应。PCR扩增程序为首先95°C，4min预变性其次95°C，40sec,55°C，40sec, 72°C，lmin,进行 30 个循环；最后72°C，延伸5min ；置4°C 保存。SDAU09El-U3-134bp片段的扩增电泳图谱见图7a。2. SDAU09E1株内源性ALV特异性U3片段地高辛标记探针的制备模板质粒DNA :p-SDAU09El_LTR(本发明人克隆测序保存)PCR反应体系见表6。表6SDAU09E1株内源性ALV特异性U3片段地高辛标记探针的制备使用反应体系 PCR 反应条件为95°C 预变性 4min，95°C 变性 40sec，55 °C 退火 40sec，72 °C 延伸 lmin,共30个循环，最后72°C延伸7min。PCR产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果 见图7b电泳图谱。(四)经典E亚群内源性病毒BJlOCl株内源性特异性U3片段(序列4)狄高辛标 记探针的制备1.内源性BJlOCl株ALV-E(内源)_U3_172bp片段的扩增(用作非标记的对照 DNA)引物F :AATAGAGCCAGAGGCAACTTG (序列 11)R :ATGGCGTTTATTTGATGG (序列 I2)模板p-BJ10Cl-LTR质粒大小约为808bp左右(本发明人克隆鉴定测序)，PCR反 应体系见表7。表7BJIOCl株ALV-E (内源)_U3_172bp片段的扩增的反应体系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分100mmol/LTris. Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明胶。2. BJlOCl株ALV-E (内源)_U3_172bp (片段地高辛标记探针的制备
模板p-BJIOCI-LTR质粒DNA进行PCR扩增，反应体系为见表8。表8BJ10C1株ALV_E(内源)_U3片段地高辛标记探针的制备使用的反应体系 PCR 反应条件为95°C 预变性 4min，95°C 变性 40sec，55 °C 退火 40sec，72 °C 延伸 50sec，共32个循环，最后72°C延伸5min。PCR产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳进行分析，结 果见图8。二、试剂盒的组成1.特异性核酸探针试剂管#1 (探针DNA#1)狄高辛标记的外源性J亚群NX0101株U3片段(序列1) 特异性核酸探针，1 μ g/Ι μ 1，10 μ 1 50 μ 1/瓶;试剂管#2 (探针DNA#2)狄高辛标记的外源性B亚群SDAU09C2株U3片段(序列 2)核酸探针，1 μ g/Ι μ 1，10 μ 1 50 μ 1/ 瓶；试剂管#3 (探针DNA#3)狄高辛标记的低致病性A+E重组SDAU09E1株U3片段(序 列3)核酸探针，1 μ g/Ι μ 1，10 μ 1 50 μ 1/瓶;试剂管#4(探针DNA#4)狄高辛标记的经典内源性E亚群ALV U3株U3片段(序 列4)核酸探针，1μ g/ μ 1，10μ 1 50 μ 1/瓶。2.未标记的不同株U3片段对照DNA试剂管#5(对照DNA#1)外源性J亚群NX0101株U3片段(序列1)PCR扩增的DNA， IOpg/μ 1，50 μ 1/瓶；
试剂管#6 (对照DNA#2) DNA，10pg/y 1，50μ 1/瓶；试剂管#7 (对照DNA#3) 增的 DNA，10pg/y 1，50μ 1/瓶；试剂管#8 (对照DNA#4) lOpg/μ 1，50μ 1/瓶。3. PCR 引物试剂管9 J亚群特异性正向引物，5 ‘-AAGGCTTGACTGAGGGGACC(序列13)；试剂管10 J亚群特异性反向引物，5 ‘-TGTGGTGGGAGGTAAAATGGC(序列14)；试剂管11 :A、B、C、D和E亚群共同性正向引物，5，-TCCTGCAGAACCGAGCG (序列15)；外源性B亚群SDAU09C2株U3片段(序列2) PCR扩增的 低致病性A+E重组SDAU09E1株U3片段(序列3) PCR扩 经典内源性E亚群ALV U3片段(序列4) PCR扩增DNA,
试剂管12 :A、B、C、D和E亚群共同性反向向引物，5 ‘-ATGGTGGGAGGTAAAATGGC(序 列 16)。4.硝酸纤维膜8 X 8cm，20 100片。5.其他试剂试剂管#13:封闭试剂(购自Roche公司，Catlog No. 1096176) Ig/瓶，9瓶试剂管#14 碱基磷酸本科标记的抗Digoxiaenin抗体(购自Roche公司，10 μ 1/ 瓶；anti-digoxigenin-AP conjugate, Cat. No 1093274)。试剂#15 5-溴-4 氯-3 吲哚-磷酸溶液(5-bromo-4-chloro-3-inolyl-phospha te，B CPI)5ml, (250mg)试齐[J#16 氮蓝四唑(4-Ntro blue terazolium chloride,NBT)溶液5ml，(500mg)6.自备试剂和消耗品20 X SSC溶液(3M NaCl，0. 3M枸橼酸三钠，调整pH至7. 0)，可塑封塑料袋，尖头一 次性滴头。7需配备设备水浴锅，压膜机，5 μ 1、100 μ 1移液器。三、试剂盒的操作方法1核酸样品的制备1. 1样品核酸直接斑点分子杂交检测的样品即怀疑有病毒感染的动物的不同组 织或细胞，按常规的方法(J.萨姆布鲁克、Ε. F.弗里奇、Τ.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫 等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取其基因组DNA，即作为检测的样
品 O1. 2样品核酸的PCR产物的斑点分子杂交将以上1. 1项中提取的样品核酸，分别 用试剂管#9和#10 (序列#13和#14)及试剂管#11和#12 (序列#15和#16)中2对特异 性不同的引物，PCR反应体系见表9。表9样品DNA的PCR反应体系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分100mmol/L Tris. ClpH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明胶。将上述成分加入灭菌的PCR管中，混和均勻后，离心后置于PCR扩增仪。按照以下 扩增程序进行反应。PCR扩增程序为95°C，4min 预变性；95°C，40sec，55°C，40sec，72°C，lmin，进行 30 个循环；72°C，延 伸5min;置4°C保存。2.斑点分子杂交检测步骤(1) 一张适当大小的NC膜或尼龙膜，划好格子，长和宽各8mm，做好标记；(2)分别在A1-A4点添加试剂管#5、#6、#7和#8的4个毒株U3片段的未经标记 的 DNA 各 1 μ 1 ； (3)吸取1. 0 μ 1待检核酸样品(约1 μ g待检样品或Iul待检样品DNA的PCR产 物，所有PCR产物不必先作电泳，只需直接点样)点于膜上各个格子的中央；(4)将NC膜或尼龙膜(点样面朝上)放于已用变性液(0. 5mol/LNa0H 1. 5mol/ LNaCl)饱和的双层滤纸上变性lOmin，再放于已用中和液(O. 5mol/LTris_Cl ；3. Omol/ LNaCl pH 7. 4)饱和的双层滤纸上中和5min ；(5)NC膜室温干燥30min，然后在80°C干烤2h固定DNA。(6)将 NC 膜放于预杂交液(5X SSC, 0. 2% SDS，2%封闭试剂 Blocking Reagent, 0. 1% (ff/V) N-Lauroy 1 sarcosine)于 65°C 68°C反应 2h，期间经常摇动 NC 膜容器；(7)取适量各个标记的探针(试剂管1、2、3和4管)置于含ΙΟΟμΙ蒸馏水的离心 管内于沸水中变性lOmin，取出后立即置于预先在-80°C保存的无水乙醇中速冻5min，防止 探针变性后复性；(8)将各个变性(后)的探针分别加入10 20ml预杂交液中，充分混勻即成杂 交液，并在恒定保持在65°C左右，使NC膜在其中杂交6h以上，最好过夜(杂交后回收杂交 流，可用三次)；(9)将NC膜放于洗液I(2XSSC，0. 1% SDS)中于室温洗涤15min，2次；(10)将 NC 膜放于洗液 11(0. 5 X SSC，0. SDS)中于 65°C洗涤 15min，2 次；(11)置 NC 膜于缓冲液 1(0. lmol/L Tris-Cl, 0. 15mol/L NaCl，pH7.5)中洗 Imin ；(12)置NC膜于缓冲液II(缓冲液1+2%封闭试剂Blocking Reagent)中反应 30min，再用缓冲液I洗Imin ；(13)在20ml缓冲液II中加入4 μ 1抗狄高辛抗体的碱性磷酸酶标记物(用之前 离心5min，1000r/min)，置于适当大小(略大于NC膜，为了有效利用试剂)的容器中，将膜 放于其中于37°C浸泡30min(不要超过这一时间，免得影响酶活性)；(14)缓冲液 I 洗涤5minX5 次；(15)置NC膜于缓冲液 111(0. lmol/L Tris-Cl,0. lmol/L NaCl，0. 05mol/L MgCl2, pH 9. 5)中反应浸泡2min ；(16)在适当大小(为了有效利用试剂)的容器中加入IOml缓冲液III和 100 μ 1 (NBT和BCIP混合物)，将NC膜放入其中在25°C下显色一定时间(2 18h)；(避光， 不要摇动)(17)加入TE缓冲液(pH 8. 0)终止显色反应。
3结果的判定3. 1四个探针特异性的确定当杂交杂交温度为68 70°C时，各探针之间彼此显出很强的特异性。见附图 9 (9a, 9b, 9c和9d)由图9 (9a, 9b, 9c和9d)表明，在该温度下，各探针只和自身的DNA有斑 点反应。但在68 70°C条件下做斑点分子杂交时，灵敏度会显著下降。为此可适当降低斑 点杂交温度，以提高灵敏度。当通常在60V 65°C做点杂交反应时，灵敏度将提高，但不同探针间有时会表现 不同程度的交叉反应，见图10 (10a，10b，IOc和IOd)。这决定于探针与相应样品DNA相互之 间核酸序列同源性程度，见图11。在这温度条件下，足以将鸡致病性外源性禽白血病病毒与 内源性白血病毒区别开来了。3. 2.交叉分子杂交有效性的确定当滴加了相同样品的四张模分别用四个不同的U3探针作分子杂交后，首先观察 各个添加有四个不同U3对照DNA的加样点的呈色反应。如果每一个探针对照DNA显色深 度的相互关系如下表10，则反应成立；如果有一项明显不符合，则反应不成立，需重做。表10判断交叉分子杂交是否有效的结果对照表对照DNA#1对照DNA#2对照DNA#3对照 DNA#4所#1+++-#+-+++“-，，或 “ +” ‘‘-，，或
用#2+-++++++-#“-，，或 “ +” ‘‘-，，或
探#3‘‘-，，或 ‘‘ +，，‘‘-，，或 ‘‘ +，，+++-#+-+++
针#4‘‘-，，或 ‘‘ +，，‘‘-，，或 ‘‘ +，，+-++++++-#
3. 2.样品特异性的判定如果在用探针#1或探针#2做杂交反应的膜上，任一样品点的呈色反应的程度接 近或达到甚至高于对照DNA#1或#2，或至少显著高于对照DNA#3和#4，即可判定为检测出 有致病性的外源性ALV的U3片段，即该样品核酸来源的细胞呈致病性的外源性ALV感染阳 性。如果不显颜色反应或只相当于对照DNA#3和#4的呈色反应，则判为没有检测出致病性 外源性ALV的U3片段，即致病性外源性ALV感染阴性。如果显色反应仅略高于对照DNA#3 和#4，则判定为可疑。如果在用探针#3或探针#4做杂交反应的膜上，任一样品点的呈色反应的程度接 近或达到甚至高于对照DNA#3或#4，即可判定为检测出内源性ALV的U3片段或低致病性的 重组外源性ALV的U3片段核酸。但不能做出有或无能呈致病性的外源性ALV感染的判定。如果某一加样点，对四个核酸探针都能呈现不同程度的显色反应，表明待检样品 中即有内源性ALV的U3片段或低致病性的重组外源性ALV的U3片段核酸，又确实存在着 有致病性的外源性ALV核酸。对四个探针均为阴性，表明样品中既无内源性ALV也无外源性ALV核酸检出。本发明的积极意义本发明，分别以狄可辛标记致病性外源性及和低致病性(包括内源性和少数外源 性)ALV代表株的U3片段核酸，以此做为特异性核酸探针。根据交叉斑点分子杂交中相对 显色的结果，用以鉴别性地检测临床病料或其它样品中是否存在有致病性的外源性ALV。
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本方法可以与目前国际上普遍采用的Dfl细胞培养法一样，可适于大批量样品 (如大于100份)的检测(样品的核酸提取阶段可用相应仪器批量处理)，且在2 3天内 报告结果，比细胞培养法提前7 10天。利用本发明所涉及的试剂盒，提取病料组织样品的核酸后，分别用四种不同特异 性的U3核酸探针作交叉分子杂交反应，斑点分子杂交可在24 36小时内完成检测并报告 结果。当病料或细胞被外源性ALV显著感染时，利用这一方法可直接检测出病毒核酸。如 将同一样品的核酸提取物分别点在4张膜上，通过与不同特异性的对照U3片段DNA的比较 即可鉴别性地检测出样品中的致病性的外源性ALV。在1张8X8cm大小的硝酸纤维膜或尼 龙膜上可同时检测约80份病料的核酸样品。如果进一步用待检样品DNA的PCR产物做交叉分子杂交反应，则可在不影响特异 性的条件下把检测的灵敏度提高100倍以上。一些PCR产物，即使在电泳中看不到条带，也 能在分子杂交反应中显示出来。另一方面，交叉斑点分子杂交反应保证了结果的特异性。


图1不同亚群的ALV的23个代表株U3区核苷酸序列同源性比较。图中每个毒株 第一个大写字母代表亚群；小写“r”代表致病性很低的具有A亚群gp85基因和内源性U3 区的重组病毒(编号为22和23的毒株)。图2六个内源性E亚群ALV与17个不同亚群ALV中国分离株的U3区核苷酸序列 同源性比较。图中每个毒株第一个大写字母代表亚群，小写“r”代表致病性很低的具有A 亚群gp85基因和内源性U3区的重组病毒。图323个不同亚群致病性外源性ALV的U3区核苷酸序列同源性比较。图中每个 毒株第一个大写字母代表亚群。图47个内源性E亚群和4个致病性很低的具有A亚群gp85基因和内源性U3区的 重组病毒U3区核苷酸序列同源性比较。图中每个毒株第一个大写字母代表亚群，小写“r” 代表致病性很低的具有A亚群gp85基因和内源性U3区的重组病毒。图 5a NX0101 株 U3_138bp 片段 PCR 产物 DNA 电泳图谱 M :DL2000 ；泳道 1 NX0101-U3-138bp 扩增片段。图5b NX0101株U3片段PCR法制备地高辛标记探针电泳图1 未标记的 NX0101-U3-134bp 片段 PCR 产物(2 μ 1) ；2 地高辛标记 NX0101_U3_134bp 片段 PCR 产物 (4 μ 1) ；3 =PCR反应体系中不加模板DNA的阴性对照；M :DL2000核酸片段大小标志物。图 中在槽2中，被地高辛标记NX0101-U3-134bp片段在电泳中比不经标记的134bp片段分子 量增大，因此移动滞后，落在相当于大约200bp的位置。根据与已知浓度的核酸条带的亮度 比较，推算出该标记的核酸探针样品中的核酸探针的浓度大约为15ng/y 1图 6a ALV-B-U3-198bp 片段电泳图谱 ALV_B-U3_198bp 片段电泳图谱 M :DL2000 ； 泳道 1 :SDAU09C2-U3-198bp 扩增片段。图6b SDAU09C2株U3片段狄高辛标记探针电泳图谱1 未标记的 SDAU09C2-U3-198bp 片段 PCR 产物(2 μ 1) ；2 地高辛标记 SDAU09C2_U3_198bp 片段 PCR 产 物(2 μ 1) ；3 =PCR反应体系中不加模板DNA的阴性对照；M :DL2000核酸片段大小标志物。在槽2中，被地高辛标记SDAU09C2-U3_198bp片段在电泳中比不经标记的198bp片段分子量增大，因此移动滞后，落在相当于大约280bp的位置。根据与已知浓度的核酸条 带的亮度比较，推算出该标记的核酸探针样品中的核酸探针的浓度大约为25ng/y 1。图7a SDAU09El-U3-134bp片段的扩增电泳图谱M :DL2000 ；泳道1 SDAU09El-U3-134bp 扩增片段。图7b SDAU09E1株内源性ALV特异性U3片段地高辛标记探针电泳图谱1 未标记 的 SDAU09El-U3-134bp 片段 PCR 产物(2 μ 1) ；2 地高辛标记 SDAU09El_U3_134bp 片段 PCR 产物(2 μ 1) ；3 :PCR反应体系中不加模板DNA的阴性对照；M :DL2000核酸片段大小标志物。 在槽2中，被地高辛标记SDAU09El-U3-134bp片段在电泳中比不经标记的134bp片段分子 量增大，因此移动滞后，落在相当于大约200bp的位置。根据与已知浓度的核酸条带的亮度 比较，推算出该标记的核酸探针样品中的核酸探针的浓度大约为20ng/y 1。图8经典E亚群内源性病毒BJlOCl株_U3_172bp片段的扩增电泳图谱1 以 BJlOCl株)-U3-172bp片段为模板的PCR结果(2 μ 1) ；2 地高辛标记PCR结果(4 μ 1) ;3 阴性对照；M:DL2000 ；根据与标准分子量DNA条带的亮度比较，可估计标记探针的浓度为 15ng/μ I。图9不同毒株U3-DNA样品与各个U3探针在68°C下的交叉斑点杂交反应1 双蒸水；2 SPF 组织；3 :NX0101-U3-DNA ；4 :SDAU09E1-U3_DNA ；5 :SDAU09C2-U3_DNA ；6 BJ01C1-U3-DNA ；其中图 9a 用 ALV-NXO101-U3-探针做点杂交；图 9b 用 SDAU09E1-U3-探 针做点杂交；图9c用SDAU09C2-U3-探针做点杂交；图9d用BJ01C1-U3-探针做点杂交。图10不同毒株U3-DNA样品与各个U3探针在61°C下的交叉斑点杂交反应，各探针 之间会出现相互之间的杂交反应。各点加样为1 :NX0101-U3-DNA ；2 :SDAU09C2_U3_DNA ；3 SDAU09E1-U3-DNA ；4 :BJ10C2-U3_DNA。A 每点 10_15pg DNA ；B 每点 l_5pgDNA 图 IOa 用 NX0101-U3-探针；图 IOb 用 SDAU09C2-U3-探针；图 IOc 用 SDAU09E1-U3-探针；图 IOd 用 BJ10C1-U3-探针。图11四个不同ALV毒株U3区探针核酸序列同源性比较。
权利要求
一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(1)分别经狄高辛标记的如序列1、序列2、序列3和序列4所述的核酸序列；(2)未经标记的作为对照用如序列1、序列2、序列3和序列4所述的核酸序列；(3)序列13、序列14是用于样品DNA扩增的J亚群特异性的一对引物；序列15和序列16是用于样品DNA扩增的A、B、C、D和E亚群共同性的一对引物；(4)硝酸纤维膜、封闭试剂、碱基磷酸酶标记的抗狄高辛抗体、NCPI溶液、NBT溶液和20×SSC溶液。
2.一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒制备 方法，其特征在于分别利用各自对应的特定引物通过PCR合成了经狄高辛标记的特异性核 酸探针，通过交叉斑点分子杂交，这些探针将可用于检测病料样品中某种病毒特异性核酸 的存在。
3.如权利要求1、2所述的一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑 点杂交检测试剂盒制备方法，其特征在于用PCR合成经狄高辛标记的外源性和内源性禽白 血病核酸探针，分别使用的引物含有序列5、6，序列7、8，序列9、10和序列11、12。
4.一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒的应用，其 特征在于是该试剂盒利用外源性和内源性ALV的U3区同源性量的差异，作交叉斑点分子杂 交，根据对显色的相对深浅，测定样品中的ALV病毒是内源性非致病性的还是有外源性致 病性的。
全文摘要
本发明涉及一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒，是用特定引物通过PCR合成了经狄高辛标记的鸡致病性外源性及内源性禽白血病病毒特异性核酸探针，通过交叉斑点分子杂交，这些探针将可用于检测病料样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用本发明所涉及的试剂盒，对从病料组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交，可在24～36h内完成检测并报告结果。显示检测样品中是否存在致病性外源性禽白血病病毒。
文档编号C12R1/93GK101886141SQ20101023029
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者孙淑红, 崔治中, 王鑫, 赵鹏 申请人:山东农业大学