专利名称：一种秸秆厌氧微生物糖化能力的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种秸秆糖化能力的检测方法。
背景技术：
目前，秸秆微生物糖化过程中，主要通过测定发酵体系内纤维素物质被降解所产 生还原糖量的多少，来检测微生物糖化能力。但由于葡萄糖效应和提取发酵液并贮存过程 中还原糖会被持续利用等原因，只提取发酵液并测定其中残留还原糖量，并不能真实的、实 时的反应微生物糖化能力，导致微生物糖化能力的检测缺乏连续性与实效性。
发明内容
本发明目的是为了解决现有秸秆微生物糖化能力的检测，不能真实的、实时的反 应微生物糖化能力，导致检测缺乏连续性与实效性的问题，而提供一种秸秆厌氧微生物糖 化能力的检测方法。秸秆厌氧微生物糖化能力的检测方法按以下步骤实现
一、向容积为30ml的厌氧聚碳酸酯单室反应器中添加21.6ml无碳源培养液和0. 12g 葡萄糖作为发酵液，然后接种2. 4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3的菌液，在30°C下培 养32h，期间每隔4h收集氢气，氢气利用高效气相色谱进行含量测定，同时利用高效液相色 谱测定发酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量对氢气产生量拟合回归方程为Y = -O. 0000 7x2+0. 0064X+0. 0013 (R2=O. 9996)；
二、向容积为60ml的厌氧聚碳酸酯的双室反应器中添加43.2ml无碳源培养液，向反应 器A室中添加秸秆段并接种2. 4ml厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株的菌液，同 时向反应器B室中接种2. 4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3的菌液，然后在30°C下培 养，每隔4h收集反应器B室氢气，并利用高效气相色谱进行氢气含量测定；
三、将反应器B室中产生氢气量，代入拟合回归方程Y= -0. 00007x2+0. 0064X+0. 0013 (R 2=0. 9996)，通过计算得到反应器A室中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株降解秸 秆所产生的还原糖的量，即完成秸秆厌氧微生物糖化能力的检测；
其中步骤一中无碳源培养基由1. Og的NH4Cl,3. 5g的K2HPO4U. 5g的KH2P04、0. 5g的 MgCl2U. Og的NaCUO. 2g的KCl、0. 5g的半胱氨酸、2. Og的蛋白胨、2. Og的酵母粉、5ml的维 生素液和Iml的微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中组成，所述的维生素液溶液由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的烟酸、5. Omg的盐酸硫胺素、50. Omg的对氨基苯甲酸、 20. Omg的叶酸、50. Omg的泛酸钙、1. Omg的维生素B12和100. Omg的盐酸吡哆醇溶于IOOOml 的蒸馏水中组成，PH值为6. 8 7. 0，所述的微量元素溶液由1. 5g的氯化亚铁、70mg的氯 化锌、6mg的硼酸、0. Ig的四水氯化锰、2mg的二水氯化铜、0. 19g的六水氯化钴、24mg的六水 氯化镍、36mg的一水钼酸钠、15mg的钨酸钠和15mg的五水硒酸钠溶于IOOOmL的蒸馏水中 组成；步骤一中Y为单室反应器中的葡萄糖消耗量，单位为克，χ为氢气体积，单位为毫升； 步骤三中Y为反应器B室中的葡萄糖消耗量，即为反应器A室中产生的还原糖的量，单位为克，X为氢气体积，单位为毫升。本发明将厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株与利用还原糖高效产氢菌 株YUAN-3进行分室同步糖化发酵，根据利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3在适宜条件下氢 气产生量，与其消耗的葡萄糖形式的还原糖量呈一定的比例关系，通过测定YUAN-3即时氢 气产量，计算产生单位体积H2时的还原糖消耗量，从而对分室同步培养条件下厌氧秸秆糖 化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株解秸秆产糖的能力进行检测。本发明与直接测定厌氧秸秆 发酵体系中还原糖残留量相比，更能真实反应厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株 的秸秆糖化能力及糖化潜力，高效产氢菌株与糖化发酵体系相连通，能通过时实测定其氢 气产量，及时的检测秸秆糖化菌的糖化能力，反应秸秆转化为还原糖的效果，该检测方法具 备了很好的连续性和实效性，能实时的量化糖化效果，方法操作简便，准确性高，同步性好。
图1为具体实施方式
一的步骤二中所用厌氧聚碳酸酯的双室反应器的装置示意 图；图2为具体实施方式
三中利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3产氢量对葡萄糖消耗量拟合 曲线图；图3为具体实施方式
三中反应器B室中产氢气变化动态曲线图；图4为具体实施方 式三中反应器产生及残留还原糖量的曲线图。
具体实施例方式具体实施方式
一结合图1说明本实施方式，本实施方式秸秆厌氧微生物糖化能 力的检测方法按以下步骤实现
一、向容积为30ml的厌氧聚碳酸酯单室反应器中添加21.6ml无碳源培养液和0. 12g 葡萄糖作为发酵液，然后接种2. 4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3的菌液，在30°C下培 养32h，期间每隔4h收集氢气，氢气利用高效气相色谱进行含量测定，同时利用高效液相色 谱测定发酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量对氢气产生量拟合回归方程为Y = -O. 0000 7x2+0. 0064X+0. 0013 (R2=O. 9996)；
二、向容积为60ml的厌氧聚碳酸酯的双室反应器1中添加43.2ml无碳源培养液，向反 应器A室1-1中添加秸秆段并接种2. 4ml厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株的菌 液，同时向反应器B室1-2中接种2. 4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3的菌液，然后在 30°C下培养，每隔4h收集反应器B室1-2氢气，并利用高效气相色谱进行氢气含量测定；
三、将反应器B室1-2中产生氢气量，代入拟合回归方程Y= -0. 00007x2+0. 0064X+0. 00 13 (R2=O. 9996)，通过计算得到反应器A室1_1中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌 株降解秸秆所产生的还原糖的量，即完成秸秆厌氧微生物糖化能力的检测；
其中步骤一中无碳源培养基由1. Og的NH4Cl,3. 5g的K2HPO4U. 5g的KH2P04、0. 5g的 MgCl2U. Og的NaCUO. 2g的KCl、0. 5g的半胱氨酸、2. Og的蛋白胨、2. Og的酵母粉、5ml的维 生素液和Iml的微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中组成，所述的维生素液溶液由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的烟酸、5. Omg的盐酸硫胺素、50. Omg的对氨基苯甲酸、 20. Omg的叶酸、50. Omg的泛酸钙、1. Omg的维生素B12和100. Omg的盐酸吡哆醇溶于IOOOml 的蒸馏水中组成，PH值为6. 8 7. 0，所述的微量元素溶液由1. 5g的氯化亚铁、70mg的氯 化锌、6mg的硼酸、0. Ig的四水氯化锰、2mg的二水氯化铜、0. 19g的六水氯化钴、24mg的六水氯化镍、36mg的一水钼酸钠、15mg的钨酸钠和15mg的五水硒酸钠溶于IOOOmL的蒸馏水中 组成；步骤一中Y为单室反应器中的葡萄糖消耗量，单位为克，χ为氢气体积，单位为毫升； 步骤三中Y为反应器B室1-2中的葡萄糖消耗量，即为反应器A室1-1中产生的还原糖的 量，单位为克，χ为氢气体积，单位为毫升。本实施方式步骤一中单室反应器中葡萄糖作为唯一碳源。本实施方式步骤一中利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3 (Bthanoligenens harbinense)为哈尔滨产乙醇杆菌，是高效产氢菌，为购买得到。本实施方式步骤一中R表示拟合度。本实施方式步骤二中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株为购买得到。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中所述双室反应 器(1)由两个同样大小厌氧聚碳酸酯单室反应器组合而成，反应器A室(1-1)和反应器B 室(1-2)之间以0.45 μ m细菌滤膜分隔，反应器B室(1_2)中不添加碳源，而利用反应器A 室(1-1)中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株降解秸秆所产生的还原糖，进行发 酵并产生氢气。其中步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三结合图1、2和3说明本实施方式，本实施方式本实施方式秸秆厌 氧微生物糖化能力的检测方法按以下步骤实现
一、向容积为30ml的厌氧聚碳酸酯单室反应器中添加21.6ml无碳源培养液和0. 12g 葡萄糖作为发酵液，然后接种2. 4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3的菌液，在30°C下培 养32h，期间每隔4h收集氢气，氢气利用高效气相色谱进行含量测定，同时利用高效液相色 谱测定发酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量对氢气产生量拟合回归方程为Y = -O. 0000 7x2+0. 0064X+0. 0013 (R2=O. 9996)；
二、向容积为60ml的厌氧聚碳酸酯的双室反应器1中添加43.2ml无碳源培养液，向反 应器A室1-1中添加秸秆段并接种2. 4ml厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株的菌 液，同时向反应器B室1-2中接种2. 4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN-3的菌液，然后在 30°C下培养，每隔4h收集反应器B室1-2氢气，并利用高效气相色谱进行氢气含量测定；
三、将反应器B室1-2中产生氢气量，代入拟合回归方程Y= -0. 00007x2+0. 0064X+0. 00 13 (R2=O. 9996)，通过计算得到反应器A室1_1中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌 株降解秸秆所产生的还原糖的量，即完成秸秆厌氧微生物糖化能力的检测；
其中步骤一中无碳源培养基由1. Og的NH4Cl,3. 5g的K2HPO4U. 5g的KH2P04、0. 5g的 MgCl2U. Og的NaCUO. 2g的KCl、0. 5g的半胱氨酸、2. Og的蛋白胨、2. Og的酵母粉、5ml的维 生素液和Iml的微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中组成，所述的维生素液溶液由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的烟酸、5. Omg的盐酸硫胺素、50. Omg的对氨基苯甲酸、 20. Omg的叶酸、50. Omg的泛酸钙、1. Omg的维生素B12和100. Omg的盐酸吡哆醇溶于IOOOml 的蒸馏水中组成，PH值为7. 0，所述的微量元素溶液由1. 5g的氯化亚铁、70mg的氯化锌、6mg 的硼酸、0. Ig的四水氯化锰、2mg的二水氯化铜、0. 19g的六水氯化钴、24mg的六水氯化镍、 36mg的一水钼酸钠、15mg的钨酸钠和15mg的五水硒酸钠溶于IOOOmL的蒸馏水中组成；步 骤一中Y为单室反应器中的葡萄糖消耗量，单位为克，χ为氢气体积，单位为毫升；步骤三 中Y为反应器B室1-2中的葡萄糖消耗量，即为反应器A室1-1中产生的还原糖的量，单位 为克，χ为氢气体积，单位为毫升。
本实施方式中所用秸秆段为水稻秸秆段；
本实施方式步骤一中以葡萄糖消耗量对氢气产生量拟合回归方程Y = -0. 00007x2+0. 0 064x+0. 0013 (R2=O. 9996)，按图2所示YUAN-3产氢量对葡萄糖消耗量拟合曲线，按图3所示 将YUAN-3产氢量代入回归方程所得厌氧秸秆糖化复合菌系JY(在文中简称为JY)产还原 糖量如图4所示，YUAN-3在发酵过程中所消耗的还原糖量在不断升高，且呈现动态变化趋 势，终点最大值164. 80mg,计算得到JY降解秸秆产生还原糖量为0. 5150g/g秸秆，秸秆降解 率达到61. 06% ；而反应器内残留还原糖含量均较低，最高值也分别只有3. 31mg,且未呈现 变化趋势；同时，利用DNS法测定了反应体系中的残留的还原糖量，反应器内JY和YUAN-3 还原糖含量均较低，最高值也分别只有3. 310mg和3. 005mg，且动态变化并不规律；结果表 明，在秸秆降解的过程中，可能还原糖在产生后便被及时利用，很难在反应体系发现糖的残 留；由此可见，以产生一定体积氢气所消耗的葡萄糖量，来表述JY降解秸秆产生的还原糖 量是可行和有效的。
权利要求
一种秸秆厌氧微生物糖化能力的检测方法，其特征在于秸秆厌氧微生物糖化能力的检测方法按以下步骤实现一、向容积为30ml的厌氧聚碳酸酯单室反应器中添加21.6ml无碳源培养液和0.12g葡萄糖作为发酵液，然后接种2.4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN 3的菌液，在30℃下培养32h，期间每隔4h收集氢气，氢气利用高效气相色谱进行含量测定，同时利用高效液相色谱测定发酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量对氢气产生量拟合回归方程为Y＝ 0.00007x2+0.0064x+0.0013；二、向容积为60ml的厌氧聚碳酸酯的双室反应器(1)中添加43.2ml无碳源培养液，向反应器A室(1 1)中添加秸秆段并接种2.4ml厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株的菌液，同时向反应器B室(1 2)中接种2.4ml利用还原糖高效产氢菌株YUAN 3的菌液，然后在30℃下培养，每隔4h收集反应器B室(1 2)氢气，并利用高效气相色谱进行氢气含量测定；三、将反应器B室(1 2)中产生氢气量，代入拟合回归方程Y＝ 0.00007x2+0.0064x+0.0013，通过计算得到反应器A室(1 1)中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株降解秸秆所产生的还原糖的量，即完成秸秆厌氧微生物糖化能力的检测； 其中步骤一中无碳源培养基由1.0g的NH4Cl、3.5g的K2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.5g的MgCl2、1.0g的NaCl、0.2g的KCl、0.5g的半胱氨酸、2.0g的蛋白胨、2.0g的酵母粉、5ml的维生素液和1ml的微量元素溶液溶于1000mL的蒸馏水中组成，所述的维生素液溶液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、1.0mg的维生素B12和100.0mg的盐酸吡哆醇溶于1000ml的蒸馏水中组成，pH值为6.8～7.0，所述的微量元素溶液由1.5g的氯化亚铁、70mg的氯化锌、6mg的硼酸、0.1g的四水氯化锰、2mg的二水氯化铜、0.19g的六水氯化钴、24mg的六水氯化镍、36mg的一水钼酸钠、15mg的钨酸钠和15mg的五水硒酸钠溶于1000mL的蒸馏水中组成；步骤一中Y为单室反应器中的葡萄糖消耗量，单位为克，x 为氢气体积，单位为毫升；步骤三中Y为反应器B室(1 2)中的葡萄糖消耗量，即为反应器A室(1 1)中产生的还原糖的量，单位为克，x 为氢气体积，单位为毫升。
2.根据权利要求1所述的一种秸秆厌氧微生物糖化能力的检测方法，其特征在于步骤 二中所述双室反应器(1)由两个同样大小厌氧聚碳酸酯单室反应器组合而成，反应器A室 (1-1)和反应器B室(1-2)之间以0.45 μ m细菌滤膜分隔，反应器B室(1_2)中不添加碳 源，而利用反应器A室(1-1)中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株降解秸秆所产 生的还原糖，进行发酵并产生氢气。
全文摘要
一种秸秆厌氧微生物糖化能力的检测方法，涉及一种秸秆糖化能力的检测方法。它解决了现有秸秆微生物糖化能力的检测，不能真实的、实时的反应微生物糖化能力，导致检测不准确的问题。方法一、拟合回归方程；二、向双室反应器中加无碳源培养液，向反应器A室中加秸秆段并接种厌氧秸秆糖化复合菌系或菌株的菌液，同时向反应器B室中接种YUAN-3的菌液，培养收集反应器B室氢气，并利用高效气相色谱进行氢气含量测定；三、反应器B室中产生氢气量代入回归方程，计算得到反应器A室中厌氧秸秆糖化复合菌系或厌氧秸秆糖化菌株降解秸秆所产生的还原糖的量，即完成。本发明能真实反应糖化能力，具备了很好的连续性和实效性，能实时的量化糖化效果。
文档编号C12Q1/02GK101906458SQ20101023513
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者任南琪, 刘冰, 徐诚蛟, 王爱杰 申请人:哈尔滨工业大学