专利名称：一个耐旱基因SpUSP的克隆及其在抗逆方面的应用的制作方法
技术领域：
本专利属于植物基因工程领域。具体涉及植物抗逆生物技术领域中，一个新鉴定 的植物USP基因，该USP基因在提高植物抗旱、抗寒、耐盐和抗氧化逆境等方面有显著的作用。
背景技术：
干旱的最直接危害是造成农作物减产，使农业歉收，严重时形成大饥荒。在严重干 旱时，人们饮水发生困难，生命受到威胁。中国每年都有不同程度的旱灾发生。常年农作物 受旱面积约3亿至4亿亩，每年损失粮食近158亿公斤，占各种自然灾害损失总量的60%。 通过引流及节水灌溉等措施，可以暂缓干旱对农作物的威胁，但不能彻底改变植物对干旱 的抗性。应对干旱，需要转换新思路，变被动抗旱为主动抗旱，由单一抗旱转向全面抗旱。通 过基因工程的途径为我们提供了一条主动的抗旱途径(Carlos et al. 2005)。植物的生长发育和对逆境的适应涉及到复杂的基因表达调控网络，尤其是对于 干旱、低温和高盐等胁迫的抗逆反应是多基因参与的协同防御反应。在长期的进化过程 中植物形成了逆境应答的基因表达模式来适应不同的环境胁迫(Bray，1997 ；Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki, 1997)。转录因子调控的基因表达是植物逆境应答反应的关键环节。目前发现的与植物 逆境反应相关的转录因子主要分为如下几类bZIP家族转录因子，WRKY家族转录因子， AP2/EREBP家族转录因子，MYB家族转录因子，NAC家族转录因子。这些转录因子有些受 ABA诱导，如bZIP可被干旱、高盐等逆境因子和ABA激活表达，与ABA响应元件ABRE(ABA responsiveelement)结合后，也可促进下游基因表达(Choi et al.，2000)。MYB受干旱、高 盐、低温等多种逆境和ABA诱导表达，与下游调控因子结合位点为TAACTG，MYB必须与靶位 点结合后，受调控基因才响应逆境表达(Abe et al.，1997)。逆境胁迫下，另有部分基因表 达与ABA含量变化无关，表明逆境响应基因中存在不依赖ABA的调控方式，如脱水响应元件 (DRE/CRT)和锌指蛋白同源结构域基因(ZFHDR)等。本发明的SpUSP基因是以抗旱的番茄IL系(渗入系)为材料，通过基因芯片差异 杂交技术，筛选到一些与抗旱相关的候选基因，对部分候选基因进行转基因验证后，发现了 一个能显著增强植株抗旱性的新基因，在GenBank检索与其同源性最高的仅为58%，其保 守域为存在一类似USP (Universal stress protein)的转录因子，该基因克隆自潘那利番 茄(Solanumpermelli)，因此我们将其命名为SpUSP。USP转录因子在细菌中有少量功能的 研究，在植物关于有功能的USP转录因子的报道非常少，在番茄中还未见相关报道。SpUSP 包含一个USP保守结构域，它是一个小的细胞质细菌蛋白，当细胞处在外界压力的条件下 时，它的表达会增强，从而增强细胞的存活能力，提供了一种对外界压力的普遍抗性。USP结 构域可能和Na7/H+反向转运体结构域，Cl_电压通道，氨基酸透酶，蛋白质激酶等发生作用 (Kristian et al. 2003)。在大肠杆菌中有6个编码USP的蛋白家族，其中4个形成一类蛋 白，其作用为保护细胞，减少DNA损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一个新鉴定植物耐旱基因即SPUSP基因，通过在植物中超 量表达该SPUSP基因，能提高植物的抗旱和耐盐等特性，可以增强作物在逆境下(干旱、低 温、盐碱等)的适应性，使植物在逆境环境中能正常生长和发育。经基因改良后的植物，特 别适用于在田间和设施环境下栽培和种植，从而有利于增强作物生产力、稳定处理和品质、 降低农业生产风险和成本。本发明是这样实现的本发明利用芯片差异筛选技术，从植物中克隆得到一个新的USP基因，它的核苷酸序列与目前已经鉴定的基因序列相似程度很低，最高仅为58%，属于一个新的基因。其 cDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示，序列全长为572bp，其0RF序列从92_526bp。该基 因的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，编码145氨基酸，将该基因在植物中超量表达，可以 提高植物的抗旱、抗寒和耐盐等逆境适应性。本发明所述的植物包括单子叶植物、双子叶植物。本发明克隆的基因被命名为SpUSP，包括该基因的DNA序列、cDNA序列，与该序列 具有90%以上同源性的序列及编码相同功能蛋白质的DNA序列，均属于本发明的保护范围。本发明所述基因包括完整的或部分的(20个及以上)核苷酸和(6个及以上)氨
基酸系列。本发明可以通过农杆菌介导的遗传转化方法或其他转基因方法把SpUSP基因转 入植物中，通过筛选鉴定并纯化，获得纯合的转基因植株或株系均属于本发明的保护范围。本发明通过在植物体内超量表达该基因可以提高植物的抗旱性，抗寒性，耐盐性 和抗氧化胁迫，其在抗逆方面的应用均属于本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的SpUSP基因的cDNA序列。序列表SEQ ID NO 2是本发明克隆的SpUSP基因编码的氨基酸序列。图1 是SpUSP基因正义(超量)表达载体构建过程。图2 是图1中PMD18-T载体的示意图。图3 是图1中PMV载体示意图。图4 :SpUSP基因在番茄不同组织和器官中特异性表达分析。图中1 幼叶，2 中等 叶，3 老叶，4 幼茎，5 花，6 果实，7 根。图5 不同逆境下番茄SpUSP基因的表达分析。图中1 :CK，2 :3iiMABA处理2h， 3 :3iiMABA处理12h，4 :4°C冷处理8小时，5 :40°C热处理7小时，6 :10mM H202处理，7 200mMNaCl 处理 6h，8 :200mMNaCl 处理 12h，9 :2mM SA 处理。图6 干旱处理对SpUSP转基因番茄植株的影响。图6A是干旱处理下的植株；图 6B是正常浇水下生长的植株。图7 SpUSP转基因番茄植株和对照叶片失水情况。图8 SpUSP转基因番茄植株在控制浇水条件下植株鲜重与干重的差异。图8A是鲜重，图8B是干重。图9 :SpUSP转基因番茄植株在限制浇水条件下叶绿素含量差异。图10 :SpUSP转基因番茄植株经PEG处理后脯氨酸含量差异。图11 低温处理后转基因株系和对照的生长情况。图中图左为对照中蔬6号，图 右为存活的为转基因株系E44，死亡的为E69株系。图12 :NaCl和甘露醇处理后番茄SpUSP转基因种子的发芽情况。图中A，B，C为 对照未处理的番茄种子发芽情况；D，E，F为NaCl和甘露醇处理后番茄种子的发芽情况；A， D是转基因株系E69 ；B, E是转基因株系E44 ；C, F是对照中蔬6号。图13 盐处理对番茄SpUSP转基因叶片叶绿素含量的影响。图14 百草枯处理后番茄SpUSP转基因种子的发芽抗性情况。上排清水对照，下 排添加0. 2M百草枯。图15 百草枯处理后，番茄SpUSP转基因植株生长的差异。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况 下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。1本发明的SpUSP基因的克隆与分析本发明中的基因是根据番茄耐旱基因芯片杂交结果，对大量候选基因进行转基因 功能验证的基础上，发现番茄SpUSP基因能显著增强植株对逆境的抵抗能力。基因芯片杂交结果表明，SpUSP基因在耐旱与干旱敏感的材料中表达量存 在明显差异，根据基因芯片注释的基因信息(Http //solgenomics, net/tomato/)， 设计扩增SpUSP基因的引物，正向引物为5，-CACGCGGCAAGAGAGAATACATGGA-3，，反向 引物为5，-ATAATGTAATGAATGTGTTGGGCGA-3，，通过PCR的方法，从野生番茄种潘那利 (S.pennellii)引自美国番茄遗传资源中心(TGRC)中扩增出全长SpUSP基因cDNA序列。 扩增方法是先提取番茄RNA，然后利用反转录试剂盒(购自T0Y0B0公司，日本)，按照试剂 盒说明书反转录合成SpUSP基因的cDNA，利用上述设计SpUSP基因的引物，通过PCR扩增 得到SpUSP全长基因，经1 %琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒(购自北京普博欣公司，具体 程序见说明书)回收目的片段，克隆至PMD18-T载体(购自TAKARA公司)，取5 y L连接 产物热击法(参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南，第三版，科学出版 社，2002版)转化大肠杆菌DH5 a，涂布于含有氨苄青霉素/异丙基-卩-D-硫代半乳糖苷 /5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37°C培养过 夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 50mg/L的液体LB培养基中，37°C 200r/min振荡培 养过夜，用小量法提取质粒(试剂盒购自北京普博欣公司，具体程序见说明书)。质粒用限 制性内切酶(Xhol和BamHI)酶切，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定，测序工作 由上海英骏生物技术有限公司完成。利用GENESCAN对该基因序列分析，结果表明，该基因序列全长为572bp，编码145 个氨基酸(见序列表SEQ ID NO. 1所示)。该基因含有2个内含子，具有USP基因的保守结 构域。利用BLAST软件(程序)在NCBLMicroTom和TIGR数据库上进行搜索，发现本发明克隆的基因序列与目前公布的基因序列的同源性均很低，最高的仅为58%，属于一个新的 与植物耐旱性状相关的候选基因，申请人将其命名为SpUSP。2载体构建在扩增SpUSP基因的引物两侧分别加上Sal I和Kpn I酶切位点，随后以潘那 利cDNA为模板，进行PCR扩增，将扩增的产物克隆到PMD18-T载体，具体步骤见本发明的 SpUSP基因的克隆与分析部分。随后，以Sal I和Kpnl双酶切带有目的基因全长片段的 PMD18-T载体，同时以Xho I和Kpnl双酶切pMV载体，1. 0%琼脂糖胶检测，回收目的基因片 段及PMV的载体大片段，将回收的目的基因片段与pMV的载体大片段以1 1的比例混合， 加入T4DNA连接酶2U，1 X反应缓冲液，无菌水补充体积至20 u L。22°C连接lh，取5 y L连 接产物转化大肠杆菌DH5ci，Km抗性平板筛选阳性克隆，酶切检测。pMV载体和PMD18-T载 体的示意图及其构建流程见图1，图2和图3。对获得的重组克隆利用电转化仪在1800V的电压下转化农杆菌C58，用含利福平 (Rif) 100mg/L,卡那霉素(Km) 50mg/L的LB固体平板筛选，挑选阳性克隆，28°C、150r/min振 荡培养过夜，收集20 u L菌液，ddH20重悬，95°C变性lOmin, 10000r/min离心lmin,取2 y L 上清液作为模板，以上述SpUSP基因的引物进行重组质粒的PCR阳性检测，确认为阳性的保 存后用于进一步的遗传转化。3遗传转化将中蔬6号番茄种子(购自中国农科院蔬菜花卉研究所)经次氯酸钠消毒15min， 播种于1/2MS培养基上(pH = 5. 8)，于25士2°C，黑暗条件下培养直至种子发芽，转入光照 强度为18001x，16h光/8h暗的光周期条件下进行培养。切取7-8d苗龄无菌苗子叶预培养 2d (培养基为MS，pH = 5. 8)。MS。重悬至0D6QQ 0. 5的农杆菌液浸染3-5min，用灭菌滤纸 吸干多余菌液，重新置回预培养基上，黑暗条件下共培养2d，转入到筛选培养基1. 0ZR+头 孢霉素(Cef)400mg/L+卡拉霉素(Km) 100mg/L)上进行抗性筛选，每两周继代一次，抗性芽 出现后将外植体转入0. 2ZR+Cef (头孢霉素)200mg/L+Km(卡拉霉素)100mg/L的培养基中。 于20 30d后切下抗性芽，转移至生根培养基(编号为RM)中诱导生根，根系发达的植株 移栽花钵。上述培养基的具体配方见表1所示。 表1番茄遗传转化培养基配方0
权利要求
一种克隆的植物抗旱基因，它的核苷酸如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一种克隆的植物抗旱基因，它的蛋白质序列如SEQ ID N0:2所示。
3.权利要求1所述的基因在番茄抗逆境中的应用。
4.权利要求2所述的基因在番茄抗逆境中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其属于番茄转基因技术领域。克隆得到一种与植物抗旱相关的基因SpUSP，该基因的核苷酸如序列表SEQ ID NO1所示，它的蛋白质序列如SEQ ID NO2所示。生物学功能验证和遗传转化表明，该基因可在番茄抗逆育种和遗传改良中应用，为番茄类植物提供了一种新的基因资源。
文档编号C12N15/29GK101988068SQ20101023524
公开日2011年3月23日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者卢永恩, 叶志彪, 张余洋, 张俊红, 李汉霞, 王涛涛, 理查德 申请人:华中农业大学