专利名称：一种基于af146527基因的弓形虫pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫PCR检测方法。
背景技术：
弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，可寄生于除红细胞外的所有有核细胞内，可感 染包括人类在内的所有温血动物(da Silva RC, Langoni H. Parasitol Res，2009，105 (4) 893-898.)。它引起的弓形虫病是一种严重的人兽共患病，其传播与流行传播与流行给畜 牧业生产(特别是带来养猪业)巨大的损失(Dorny P，PraetN, Deckers N, et al. Vet Parasitol，2009，163(3) 196-206 ；Dubey JP. Vet Parasitol，2009，164(2-4) :89_103·)； 同时，对于妊娠妇女、AIDS患者，骨髓移植患者、器官移植受者以及包括肿瘤患者在内的免 疫力低下群体，弓形虫病则会导致严重的后果，对人类健康存在很大的潜在危害，其防治在 艾滋病、移植医学、围产医学等学科中备受关注(Ong EL. Clin Med, 2008,8 (5) 539-543 ； Pereira-Chioccola VL,Vidal JE,Su C. Future Microbiol, 2009，4 1363—1379 ；PeyronF. Mem Inst Oswaldo Cruz,2009,104(2) 316-319 ；Derouin F, Pelloux H ；ESCMIDStudy Group on Clinical Parasitology. Clin Microbiol Infect,2008,14(12) :1089_1101)。 在临床上，弓形虫感染多为隐形感染，难以用传统常规方法侦检；及时出现临床症状的患 者，由于其临床症状复杂多变，且多同时伴有其他病变，亦往往造成诊断困难。目前，弓形 虫感染的诊断方法主要为免疫学诊断方法，检测弓形虫抗体，但往往弓形虫病患者伴有免 疫功能低下，对于这部分免疫功能低下的患者，往往会出现抗体水平的下降，难以用免疫 学方法诊断。而普通病原学检测方法如直接涂片法的检出率低下，动物接种和细胞培养 法尽管检出率高，但操作繁琐，周期长，并不适合用于临床诊断。PCR是一种在体外模拟自 然DNA复制过程的核酸扩增技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏的特点。关于弓形虫的 PCR诊断方法，国内外学者已经进行了大量的研究，其中Bl基因、P30基因及ITS-I基因 等均曾被作为PCR诊断的标靶。弓形虫基因组中存在一个529bp的重复序列(AF 146527 基因)，其基因组中的拷贝数高达200 300，远远高于上述的PCR诊断标靶，因此，以其作 为PCR诊断的标靶可以提高诊断的灵敏性(Homan W L, Vercammen M, DeBraekeleer J, et al. International Journal for Parasitology，2000，30 :69_75)。国外学者曾利用该重 复序列为标靶建立荧光定量PCR诊断方法，获得较为理想的效果(Homan W L，Vercammen M, De Braekeleer J, et al. International Journal forParasitology,2000, 30 69-75 ； Edvinsson B, Lappalainen MjEvengard B, et al. ClinMicrobiol Infect,2006,12(2) 131-136.)。但荧光定量PCR的设备及试剂成本较高，因此，本领域需要一种敏感特异的普 通PCR检测方法，以满足实际工作中弓形虫感染诊断的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测弓形虫的PCR方法，通过以下技术方案实现(1)设置PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、EB染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)；(2)提取被检样本DNA; (3) PCR扩增；(4)扩增产物 分析；其中(1)的PCR反应管内含IOX缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgC12，所述引 物1、引物2系根据弓形虫AF146527基因序列(SEQ ID NO. 1)设计合成的DNA片段，序列如 下引物 1 5，-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3，(SEQ ID NO. 2) 引物 2 5，-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3，(SEQ ID NO. 3)。所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建将以弓形虫 基因组 DNA 为模板，以引物 Tox4[5，-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3，(SEQ ID NO. 4)]、引 物 Tox5[5，-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3，(SEQ ID NO. 5)]扩增获得的 PCR 产物连接 于pMD18-T载体后经测序验证获得的阳性质粒，该质粒含有弓形虫AF146527基因片段；所述阴性对照为去离子水；其中步骤(2)所述提取被检样品DNA，可采用《分子克隆》描述的经典方法提取，亦 可使用上海飞捷生物公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取(或其他生物公司的DNA提取 试剂盒提取)；其中步骤⑶所述的PCR扩增是在PCR管中加入步骤⑵提取的被检样本DNA，同 时设阳性对照和阴性对照，反应体系为10Xbuffer 5 μ 1，IOmM dNTPO. 25 1· 5 μ l,25mM MgCl22 5μ 1，引物 1(50ρ θ1/μ 1)1 μ 1，引物 2(50ρ θ1/μ 1) 1 μ ITaq 酶( υ/μ 1)1 μ 1， 模板DNA 1 μ 1，加去离子水补足至50 μ 1。PCR反应条件为94°C预变性5min后，94°C变性30s，56 63°C退火30s，72 °C延 伸1. 5min，共循环30 45次，最后72°C延伸lOmin。优选反应体系为IOXbuffer 5 μ 1, IOmM dNTP 1 μ l,25mM MgCl22yl，引物 1(50ρ θ1/μ 1)1μ 1，引物 2(50ρ θ1/μ 1)1μ l，Taq 酶(IU/μ 1) 1 μ 1，模板 DNAl μ 1，加去离 子水补足至50 μ 1。优选反应条件为94 °C预变性5min后，94 °C变性30s，63 °C退火30s，72 V延伸 1. 5min，共循环30次，最后72°C延伸IOmin0其中步骤(4)所述扩增产物分析，是将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，被检样本孔 出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照孔对比，以判断阳性或阴性。利用本发明优选的PCR反应体系与反应条件，最低可检出10个拷贝AF146527基 因(即0. 03 0. 05个虫体)，具有高度的敏感性；同时，本发明对正常小鼠全血、健康志愿 者全血、间日疟原虫、恶性疟原虫及结核杆菌的基因组DNA扩增均为阴性，仅扩增弓形虫基 因组DNA结果为阳性，具有高度的特异性。本发明的优点是提供了一种基于弓形虫基因组中高度重复的AF146527基因的检 测弓形虫的PCR检测方法，可快速、敏感、特异地检测被检样本中的弓形虫存在与否，适用 于人类和动物弓形虫感染的筛查、临床诊断及流行病学调查。
图1本发明PCR方法的特异性实验电泳图。1 弓形虫；2 正常小鼠全血；3 正常 人全血；4 间日疟原虫；5 恶性疟原虫；6 结核杆菌；M =DNAmarker
图2本发明PCR方法的敏感性实验电泳图。1 7 分别为10、102、103、104、105、 106、100拷贝数的pMD-18/Tox529bp重组质粒模板的扩增产物；M =DNAmarker
具体实施方式
下面的实施例旨在对本发明进行进一步详细说明，不当作为对本发明的限制。实施例一弓形虫PCR检测方法的建立1.设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括(I)PCR管管内含IOX缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgC12，所述引物1、引物2 系根据弓形虫AF146527基因序列设计合成的DNA片段，序列如下引物 1 5，-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3，引物 2 5，-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3，(2)阳性对照含有目的基因片段的重组质粒。(3)阴性对照去离子水。(4) Taq 酶(5) EB 染料(6)溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)。2.样本的采集自弓形虫感染病鼠采取抗凝全血500 μ 1及肝脏、脾脏、淋巴结等 组织，4°C或冷冻保存；3.被检样本DNA提取取200μ 1抗凝全血(或Img样本如肝脏、脾脏、淋巴结置于 研钵，加入生理盐水Iml，研磨成糊状，转移至离心管)，按上海飞捷生物公司的基因组DNA 快速提取试剂盒提取(或其他生物公司的DNA提取试剂盒提取)DNA (亦可按《分子克隆》经 典方法提取DNA)，4°C保存备用；4. PCR扩增在每个PCR检测管中加入提取的DNA样品1 μ 1，Taq酶1 μ 1，同样设阳 性、阴性对照。混勻后稍离心，置于PCR进行扩增，PCR扩增条件94°C预变性5min后，94°C 变性30s，63°C退火30s，72°C延伸1.5min，共循环30次，最后72°C延伸IOmin05. PCR扩增产物分析将琼脂糖溶于电泳缓冲液，然后加入EB染料，混勻后制胶， 将扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混合，依次加入加样孔，恒压电泳。电泳完成后，紫外灯下 观察样品孔泳道条带，并与阳性对照和阴性对照对比，判定被检样本弓形虫阳性或阴性。实施例二 .检测方法的特异性实验用经过有效性验证的弓形虫DNA、正常小鼠全血、健康志愿者全血、间日疟原虫、恶 性疟原虫及结核杆菌的基因组DNA各1 μ 1为模板，按照本发明方法的优化反应体系和反应 条件进行弓形虫特异性PCR扩增(扩增条件同实施例一)。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 分析(同实施例一)。结果仅扩增弓形虫基因组DNA泳道出现约250bp特异性条带，为阳性，其余各对照 DNA泳道均为阴性(见图1)。实施例三检测方法的敏感性实验将构建的含有目的基因的质粒稀释后作为模板加入PCR反应管，使PCR反应管内 含有目的基因的质粒DNA拷贝数为10° 106，按照本发明方法的优化反应体系和反应条件 进行弓形虫特异性PCR扩增(扩增条件同实施例一)。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析(同实施例一)，以确定其检测敏感性。结果表明，该方法最低可 检出10个拷贝AF146527 基因(即0. 03 0. 05个虫体)，表明该方法具有较高的灵敏度(见图2)。
权利要求
一种检测弓形虫的PCR方法，其特征包括以下步骤(1)设置PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、EB染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)；(2)提取被检样本DNA；(3)PCR扩增；(4)扩增产物分析；其中步骤(1)的PCR反应管内含10×缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgCl2，所述引物1、引物2系根据下述碱基合成的DNA片段引物1 5’ TGGAGCCACAGAAGGGACAG 3’引物2 5’ GCCATCACCACGAGGAAAGC 3’所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建将以弓形虫基因组DNA为模板，以引物Tox4(5’CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG 3’)、引物Tox5(5’ CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATTT 3’)扩增获得的PCR产物连接于pMD18 T载体后经测序验证获得的阳性质粒，该质粒含有弓形虫AF146527基因片段；所述阴性对照为去离子水；其中步骤(2)所述提取被检样品DNA，可采用《分子克隆》描述的经典方法提取，亦可使用上海飞捷生物公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取(或其他生物公司的DNA提取试剂盒提取)；其中步骤(3)所述的PCR扩增是在PCR管中加入步骤(2)提取的被检样本DNA，同时设阳性对照和阴性对照，反应体系为10×buffer 5μl，10mM dNTP0.25～1.5μl，25mM MgCl22～5μl，引物1(50pmol/μl)1μl，引物2(50pmol/μl)1μl，Taq酶(1U/μl)1μl，模板DNA1μl，加去离子水补足至50μl。PCR反应条件为94℃预变性5min后，94℃变性30s，56～63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循环30～45次，最后72℃延伸10min；其中步骤(4)所述扩增产物分析，是将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，被检样本孔出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照孔对比，以判断阳性或阴性。
2.根据权利要求1所述检测弓形虫的PCR方法，其特征在于PCR反应体系的最佳组 成为 IOXbuffer 5 μ 1, IOmM dNTP 1 μ l,25mM MgCl22 μ 1，引物 1 (50pmol/μ 1) 1 μ 1，引物 2(50ρ θ1/μ 1)1μ 1，Taq 酶(IU/μ 1) 1 μ 1，模板 DNA 1 μ 1，加去离子水补足至 50 μ 1。
3.根据权利要求1所述检测弓形虫的PCR方法，其特征在于PCR最佳反应条件为94°C 预变性5min后，94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸1. 5min，共循环30次，最后72°C延 伸 IOmin0
4.根据权利要求1所述检测弓形虫的PCR方法，其特征在于检测样品中弓形虫的应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫PCR检测方法。以弓形虫基因组DNA为模板，采用本发明设计的引物，以本发明优化的PCR体系和条件进行PCR反应，扩增高度重复的弓形虫特定的AF 146527基因的部分片段，可快速、特异、敏感地检测出样本中的弓形虫，为人类和动物弓形虫病的筛查与临床诊断及流行病学调查简单、快速、准确的方法。
文档编号C12Q1/68GK101962674SQ20101023775
公开日2011年2月2日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者夏惠, 孙新, 徐家森, 方强, 沈继龙, 王雪梅, 陈兴智, 齐文娟 申请人:蚌埠医学院