专利名称：一种香蕉果实特异高效表达dna调控元件及其植物表达载体的制作方法
一种香蕉果实特异高效表达DNA调控元件及其植物表达载
体本发明涉及香蕉淀粉粒合成酶基因启动子序列的获得和植物表达载体的构建。 [背景技术]香蕉(Musa spp.)属芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)。是重要的热带水果，是利 用转基因方法生产重组药用蛋白和肽，或者是有价值的化合物的理想植物。外源基因能够在植物组织中实现正常乃至高效的表达，一个重要的条件是构建一 个能高水平表达异源蛋白质的表达载体，而对一个高效表达的载体而言，启动子则是其最 重要元件之一。因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考 虑的问题。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子 叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin 启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基 因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的 表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外 源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达 启动子的研究和应用越来越重视。果实特异性启动子作为重要的组织特异性启动子，可以 控制外源基因在转基因植物的果实中特异表达。克隆和研究果实特异性启动子，可为深入 研究果实品质形成机理、提高果实品质及为在植物中特异性地表达外源基因奠定基础。但 是，由于受到果实特异表达基因数量的限制，果实特异表达启动子的克隆鉴定及应用研究 的报道非常有限，目前相关研究在番茄上进展较大，如番茄E8基因的启动子被证明是果实 成熟启动子且对乙烯做出反应，Penarrubia(Penarrubia et al. 1992)等用该启动子转移 的指导甜蛋白基因在番茄果实成熟中表达，结果获得较高的表达量，且甜蛋白受乙烯诱导 而增加。番茄PG基因(Bird C R et al. 1998)和2A11基因亦被证实为果实成熟特异表达， Chengappa等(Chengappa S et al. 1990)用2A11基因启动子在番茄果实中特异表达反义 蔗糖合成酶基因，证实为果实特异表达。毛自朝等(2002)用番茄果实专一性启动子2A12 驱动ipt基因在番茄中表达，结果表明在果实中专一表达。另外，Atkinson (Atkinson R G et al. 1995)和Wang(Wang Z Y et al. 2000)分别研究了苹果ACC合成酶、PG基因和猕猴 桃PG基因的表达，它们均为果实特异表达，分离三个基因的启动子，分别与报告基因GUS构 建表达载体且转化番茄，在转基因番茄中GUS表达表明呈现果实成熟特异性。香蕉的启动 子研究也获得一些进展，王新立等(2001)克隆了香蕉ACC合成酶和氧化酶基因的启动子， 通过⑶S基因的瞬时表达研究证实为果实特异性，但未见更深入的研究报道。亦未见有果 实特异启动子在香蕉转基因中应用的报道。Prabodh Kumar Trivedi等2004年发现乙烯和 IAA可促进香蕉果实中MaExpl的启动子(888bp)的活性，认为这个启动子可用作香蕉中外 源基因的转化，调节果实成熟。香蕉淀粉粒合成酶基因(Granule-BoundStarch Synthase gene，MaGBSS)是我们通过果实抑制差减文库获得的一个香蕉成熟相关基因，器官表达特异性证明该基因只在果 实中表达。通过基因芯片表达和Northern blot分析，结果显示该基因在果实中大量表达且 与果实成熟过程密切相关(香蕉果实成熟相关基因克隆及表达。杨小亮，硕士论文，2004; XuBY,Su W,Liu JHjWang JB and Jin ZQ. Differentially expressed cDNAs at the early stage ofbanana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray. Planta, March, 2007, 226 :529_539)，因此我们认为，MaGBSS 基因的启动 子很可能是果实特异高效表达启动子。为了解决香蕉作为生物反应器的需要，同时亦为在香蕉果实特异表达氨基酸合成 基因、抗衰老基因、药用蛋白质基因等有用基因，培育具有较高商业价值及保健价值的香蕉 新品种，本发明的目的是提供一种香蕉果实特异高效表达DNA调控元件及其植物表达载 体。本发明的技术方案为一种分离的香蕉果实特异高效表达DNA调控元件，具有序 列表中<400>项下的序列。上述DNA调控元件是包括从香蕉总DNA分离的香蕉MaGBSS基因启动子，经测序 其长度为606bp，通过Promoter predictions等软件进行基础启动子的分析，结果表明 在93-138和182-227bp存在2处基础启动子区。利用该启动子序列置换植物表达载体 PCAMBIA1304启动子构建成一个含有MaGBSS基因启动子驱动GFP和⑶S基因的新的植物 融合表达载体P1304PGBSS。通过基因枪法将载体pl304PGBSS转化香蕉果实薄片、根系及叶 片中，GFP和⑶S染色显示该启动子为果实特异表达启动子；启动子启动⑶S基因表达活性 检测显示，P1304PGBSS质粒轰击的果片活性高于pCAMBIA1304质粒轰击的果片，而且持续 的时间较长，说明MaGBSS基因启动子在果实中的启动活性高于35S启动子，证明了 MaGBSS 基因启动子是一个果实特异性的高效启动子。本发明还提供了一种香蕉果实特异高效表达载体，其特征在于转入了前述的分 离的香蕉果实特异高效表达启动子置换植物表达载体PCAMBIA1304上的35S启动子构建 成一个含有MaGBSS基因启动子驱动GFP和GUS基因的新的植物融合表达载体，命名为 P1304PGBSS。[结果分析]一、MaGBSS基因启动子的克隆及表达载体构建1. MaGBSS基因启动子的分离及序列分析香蕉基因组DNA提取采用经改良的SDS法小量提取香蕉基因组DNA。根据我们克 隆的MaGBSS基因的序列，根据TAIL-PCR方法的要求设计3个引物，进行PCR扩增。PCR扩 增到一条长约600bp左右的产物，扩增片段与pGEM-T Easy Vecter连接，于上海生工测序。 测序结果为长606bp，序列参照序列表中<400>。通过Promoter predictions等软件进行 基础启动子的分析，结果表明在93-138和182-227bp存在三处基础启动子区。该启动子具 有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒、转录起始位点及其他调控元件 (见表1)。表1 :MaGBSS基因启动子元件分析
2.果实特异表达载体pl304PGBSS构建根据已测序的MaGBSS基因启动子序列，在其两端加上EcoR I和Spe I酶切位点
设计5’和3’端引物。通过PCR反应扩增启动子目的片段，回收PCR产物，用EcoR I和Spe I双酶切该产物和植物表达载体PCAMBIA1304，将酶切获得的含有两个酶切位点的启动子 片段和pCAMBIA1304载体大片段连接获得含有MaGBSS基因启动子表达载体pl304PGBSS。二、MaGBSS基因启动子的功能鉴定1.基因枪法对香蕉不同器官转化pl304PGBSS及GFP显微观察、⑶S基因的组织化 学染色定位将香蕉果实用1%。氯化汞溶液消毒lOmin，用灭菌蒸馏水冲洗数次再将其徒手切 成薄片；纵剖香蕉组培苗的根并将叶切为1 2cm小块。置上述材料于1/2MS培养基上， 室温放置3h.。参照王关林的方法以pl304PGBSS、pCAMBIA1304两种表达载体的质粒DNA 和H2O包被金粉制备微弹，按厂商提供的使用手册用基因枪轰击香蕉材料。轰击后的香蕉 材料于26°C暗培养。然后进行荧光显微镜观察和GUS组织化学染色。显微镜观察显示， P1304GBSS载体包被的微弹轰击的材料，叶片、根在显微镜下没有观察到蓝色，而果实薄片 在果肉中观察到蓝色；PCAMBIA1304载体包被的微弹轰击的叶片、根、果实均在显微镜下观 察到蓝色(
图1，图中蓝色、黑色)。取基因枪转化24h香蕉叶、根、果在荧光显微镜下观察， P1304GBSS载体转化的植物表达载体香蕉材料的根、叶均未发现荧光，而只在果实中特异表 达，转化含有35S启动子的pCAMBIA1304植物表达载体香蕉材料根、叶、果实均有荧光(图 2，图中绿色)。2.转化材料的⑶S酶活性检测方法参照王关林“分子克隆原理”中提供的方法。(1) pl304PGBSS和pCAMBIA1304载体转化香蕉⑶S活性测得各转化材料⑶S提取 液的A595，根据标准曲线计算样品蛋白含量如下(表3)。表3 转化24小时各器官GUS提取液中蛋白含量 根据表1可以看出，pl304PGBSS转化的果实中⑶S蛋白明显高于pCAMBIA1304。 PCAMBIA1304转化的各器官中⑶S含量差别不大，而pl304PGBSS转化的各香蕉果实高出其 他器官35-300倍左右。这个结果说明，MaGBSS基因启动子的活性很高，在香蕉果实中略高 于目前常用的组成型强启动子35S(图3)，而且是果实特异性的。(2)转化24小时后一定时间内GUS酶活力变化与时间的对应关系基因枪转化后数 十小时取相同重量的基因抢轰击的果实薄片制备GUS提取液，酶反应后测得415nm处两种 果实转化材料Gus提取液不同反应时间的光吸收值，按0. 0170标样OD为Inmol产物/ml 的标准将其换算成消光产物量后对时间作图(图4)。Gus酶活力曲线图表明，pl304PGBSS质粒轰击的果片在15-60min Gus活性与 PCAMBIA1304质粒轰击的果片基本相同，60min后pl304PGBSS质粒轰击的果片的Gus活性 高于pCAMBIA1304质粒轰击的果片。说明MaGBSS基因启动子在果实中的启动活性稍高于 35S启动子，而且持续的时间较长，证明了 MaGBSS基因启动子是一个果实特异性的高效启 动子，本研究从MaGBSS基因启动子的分离、测序、植物表达载体的构建、基因枪法转化香蕉各组织(根、茎、叶)、GFP荧光显微观察、⑶S基因染色定位、⑶S基因活性测定等作了 系统研究，获得了一个香蕉果实特异高效表达DNA调控元件，以此启动子转化香蕉及番茄 等果用型植物是可行的。以下结合实例应用对本发明进行详细说明。1.启动子序列的克隆根据MaGBSS基因启动子测序结果设计5’、3’引物，并分别 加上EcoR I和Spe I酶切位点(下划线处)5’ Primer CGGAATTCTCGAGTATGGTGTTCTTTTTG 3’ Primer GGACTAGTCCACTCACGTCACTTCAGC目的片段PCR扩增在PCRlf中依次加入
灭菌水18. 9ul
香蕉基因组DNA1. Oul
缓冲液2. 5ul
dNTP0. Oul
TaqDNA聚合酶0. 5ul
5' Premer1. 5ul
3' Premer1. 5ul_总体积25ul轻轻混勻，瞬时离心，将Eppendorf管置PCR扩增仪中，盖上加热帽。反应程序 940C 2S、72°C 3min 7 个循环；94°C 2s ;67°C 3min. 37 个循环 67V 4min.取5. O μ 1 PCR扩增反应液进行1. O %琼脂糖凝胶电泳，5V/cm恒电压条件下电泳 30min后，通过凝胶成像系统观察并照相。2.目的片段的回收用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QAGEN)回收，方法参照说明书进行3.回收PCR产物和pCAMBIA1304植物表达载体用EcoR I、Spe I双酶切。回收 PCR 产物IOulBuffer E5ulBamHl5ulHindlll5ulBSA(IOOx)0. 5ulH2024. 5ul_总体积50ulpBI121 质粒 DNA5ulBuffer E5ulBamHl5ulHindlll5ul
7
BSA(IOOx)0. 5ulH2029. 5ul_总体积50ul37°C 水浴，3.5h。4.回收MaGBSS基因启动子和pCAMBIA1304双酶切载体片段并连接用QlAquick Gel Extraction Kit (50)回收两个目的片段(方法同2)，1 %琼脂糖 凝胶电泳检测回收结果。启动子双酶切片段与pBI121双酶切载体连接反应606bp 目的片段 DNA7. OulpCAMBIA1304 双酶切载体1. OulIOx 连接酶 buffer2ulT4DNA 连接酶Iul_总体积IOul16°C, 16h05.连接产物的转化及重组质粒鉴定方法参照分子克隆手册中。6. MaGBSS基因启动子连接芪合酶基因植物表达载体的构建1)芪合酶基因PCR扩增根据已发表的芪合酶基因序列设计两个引物，分别在5’和3’加上Bgl II和SpeI 酶切位点5' Primer CC kGATCTi GCTTCAATTTCATTACGT 3’ Primer CC ACTAGT CTCCTATTTGATACATTA利用葡萄叶片的总DNA为模板进行PCR反应
灭菌水18.9ul
葡萄基因组DNA1. Oul
缓冲液2. 5ul
dNTP0. Oul
TaqDNA聚合酶0. 5ul
5' Premer1. 5ul
3' Premer1. 5ul_总体积25ul轻轻混勻，瞬时离心，将Eppendorf管置PCR扩增仪中，盖上加热帽。反应程序 95°C变性1分钟94°C变性30秒55°C退火30秒72°C延伸2分钟35个循环72°C延伸10分 钟取5. 0 μ IPCR扩增反应液进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm恒电压条件下电泳 30min后，通过凝胶成像系统观察并照相。获得一条长约1500bp的条带，测序证明是葡萄芪合酶基因。总体积10. Oul37°C 水浴，3h。经酶切鉴定，含有MaGBSS基因启动子及葡萄芪合酶基因的植物表达载体 P1304PGBSSH已构建成功。7.转化香蕉1)材料与试剂巴西香蕉未成熟雄花愈伤组培由我研究室培育。卡那霉素(Kanamycin)，利福平(Rifampicin)、链霉素(Str印tomycin)、噻孢霉素 (Cefotaxime)、潮霉素(Hygromrycin Rif)均购自宝生物公司。2)香蕉材料的准备及抗性梯度实验①香蕉材料的准备将巴西香蕉未成熟雄花愈伤组织接种于MS附加6-BA 2. 0mg/L、NAA 0. 2mg/L的培 养基上进行扩大繁殖培养。②抗性梯度实验将取自香蕉未成熟雄花愈伤组织分别接种于含有潮霉素5mg/L、10mg/L、30mg/L、 50mg/L、100mg/L的MS附加6-BA 2. Omg/L、NAA 0. 2mg/L培养基上，进行诱芽培养，测定外 植体对潮霉素的敏感性及最适选择浓度。筛选的最适潮霉素浓度为50mg/L。3)质粒 pl304PGBSSH 导入农杆菌 EHA105三亲交配法将载体pl304PGBSSH导入农杆菌EHA105 ①接种受体农杆菌EHA105在含有Rif50mg/L、str 100mg/L的YEP固体培养基上， 28°C培养，长出单菌落后，挑选一个单菌落接种在液体培养基中，28°C振荡培养。②接种带有“协助”质粒PRK2013的大肠杆菌在含有Kan 50mg/L的固体培养基上， 37°C培养，长出菌落后挑选一个单菌落接种在相应液体培养基中，37°C振荡培养。③挑带有中间质粒载体pBIL2的大肠杆菌的单菌落在含有Kan 50mg/L的液体LB 培养基中，37°C振荡培养。④三种菌生长到OD6tltl为0. 5左右时，等体积混勻，涂布于不含抗生素的YEP固体 培养基上，28 °C过夜培养。⑤用接种针将长出的菌苔转接至含有Rif 50mg/L、Str 100mg/L、Kan 50mg/L的 固体YEP培养基上，28°C培养2-3天，长出单菌落。同时设三个对照EHA105、pRK2013、 P1304PGBSSH。⑥将长出的单菌落再次转接到含有上述三种抗生素的YEP固体培养基上，28°C培 养。YEP培养基蛋白胨10g/L pH 7.0、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/LLB培养基蛋白胨IOg/ L pH 7.0、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L(配制固体培养基时，需加入15g/L琼脂粉)挑菌苔涂三抗平板后，三个对照pl304PGBSSH、EHA105、pRK 2013都未长出菌苔或 菌落，只有三亲交配产物长出菌苔及菌落，说PBIL2已导入农杆菌EHA105。4)农杆菌介导法转化香蕉未成熟雄花愈伤组织取培养好的香蕉未成熟雄花愈伤组织作为受体材料。从平板上挑取含有目的载 体P1304PGBSSH的农杆菌单菌落，接种于三抗YEP液体培养基中，28°C培养24小时以上，至 OD600 为 0. 6-0. 8。
将菌液分装于IOmL离心管中，4°C，4000rpm，离心lOmin，弃上清。将菌体重悬于2 倍体积，附加500uM乙酰丁香酮(Acetosyringone AS)的MS液体培养基中。将菌液倒入无 菌小烧杯内，将受体材料放入菌液中，分别浸泡10min、20min、30min，取出薄片放于无菌滤 纸上吸去多余菌液。将侵染过的薄片接种于MS附加6-BA 2. Omg/L、NAAO. 2mg/L的培养基 上，在28°C暗培养4-6天。将经过共培养的外植体转移到加有50mg/L Rif及300mg/L Cef 的脱菌分化培养基上，在光照为5000LX，25-28°C条件下进行诱芽选择培养。待吸芽长到0. 5cm以上时切下来转入含有50mg/L Rif的生根培养基(MS+O. 5mg/ LKT+1. Omg/L NAA)上进行生根培养。
图1是基因枪转化香蕉不同器官⑶S瞬时表达图，其中A是从左至右pCAMBIA1304质 粒轰击香蕉根、果、叶⑶S瞬时表达图；B是从左至右pl304BR47质粒轰击香蕉根、果、叶⑶S 瞬时表达图2是基因枪转化香蕉不同器官绿色荧光蛋白(GFP)瞬时表达图，其中A是从左至右 PCAMBIA1304质粒轰击香蕉根、果、叶GFP瞬时表达图；B是从左至右pl304BR47质粒轰击香 蕉根、果、叶GFP瞬时表达图3是MaGBSS基因启动子与35S启动子相对酶活对比图； 图4是瞬间表达的转化果实中GUS酶活性变化曲线图。
权利要求
一种分离的香蕉果实特异高效表达启动子，其特征在于具有序列表中<400>1项下的序列。
2.一种香蕉果实特异高效表达载体，其特征在于转入了权利要求1所述的分离的香蕉 果实特异高效表达启动子。
3.根据权利要求2所述的香蕉果实特异高效表达载体，其特征在于用权利要求1所述 的香蕉果实特异高效表达启动子置换植物表达载体PCAMBIA1304上的CaMV35S启动子，构 建成在启动子下游含有GFP和GUS基因的香蕉果实特异高效表达载体。
全文摘要
本发明涉及香蕉果实特异高效表达DNA调控元件及其植物表达载体，该启动子长606bp，以其取代植物表达载体pCAMBIA1304上的组成型35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pCSS1。用GFP基因和GUS基因瞬时表达方法检测了含有该段启动子及pCAMBIA1304启动子的启动活性，绿色荧光蛋白(GFP)显微镜观察和GUS组织染色显示该启动子具有表达组织特异性，且略高于35S启动子。该启动子的获得，为香蕉的转基因及对香蕉果实的分子生物学研究提供了一个有力的工具，特别是为利用香蕉作为生物反应器的研究和开发创造了条件。因此，该启动子的获得，具有重要理论和实践意义。
文档编号C12N15/82GK101928708SQ201010237890
公开日2010年12月29日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者刘菊华, 张建斌, 徐碧玉, 王纪, 谭光兰, 贾彩红, 金志强 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所;农业部热带作物生物技术重点开放实验室;中国热带农业科学院海口实验站