专利名称：酶解蛋白过程中抗氧化肽活性保护及其制备方法
技术领域：
本发明涉及动植物蛋白的开发利用领域，特指在蛋白酶解制备抗氧化肽过程中通 过使用充入保护气体隔绝氧气，以保护产品抗氧化活性和蛋白酶催化活性的制备方法。
背景技术：
许多研究证实，氧化与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉硬化等的 发病机理有关。抗氧化活性肽是一类具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效的 生物活性肽。近些年国内外很多学者以植物蛋白或动物蛋白为原料，进行抗氧化肽的制备研 究。许多食物源蛋白水解后可产生有较强抗氧化活性的肽，蛋白的氨基酸残基侧链通常包 含疏水性、抗氧化性基团如羟基、酚羟基、巯基同时这些基团提供较强的供氢能力。蛋白质 的疏水基团导致分散性减弱，不易水解，以往研究已经证实，采用酶控制水解技术是制备大 量天然抗氧化肽最安全有效的方法。但在迄今所有的研究中，蛋白酶解过程均是在开放体 系下完成的，由于蛋白所含的羟基、酚羟基、巯基等活性基团易受氧化等因素影响而降低活 性，并且会造成蛋白在酶解过程中分散性降低，从而影响水解效率和效果；同时蛋白酶本身 所含巯基、疏水基等活性基团，这些往往是酶的活性部位，与催化活性有密切关系，在开放 体系酶解中同样面临被氧化导致酶活降低的问题。因此，肽的抗氧化活性保护和酶活性保 护成为抗氧化肽制备过程中需要高度重视和亟待解决的难题。本发明针对上述问题对酶解 体系中蛋白酶及产物的抗氧化活性进行保护，减少这些基团氧化失活的机会，使产物肽抗 氧化活性比传统酶解方法得到提高。
发明内容
本发明的目的在于克服蛋白质酶解过程中使用的蛋白酶和制得的抗氧化肽被氧 化导致的产物抗氧化活性降低以及部分蛋白质分散性差等技术难题，从而提供一种酶解过 程中抗氧化肽和蛋白酶活性保护及其制备方法。本发明的技术方案一种酶解蛋白过程中抗氧化肽活性保护及其制备方法，以动 植物蛋白或动物血液为原料，通过加蛋白酶进行酶法水解，同时添加微量的巯基乙醇、亚硫 酸钠或巯基乙胺等巯基保护剂改善蛋白分散性，在水解过程中充入N2、CO2或其他惰性气体 等为保护气体隔绝水解液与氧气的接触，对酶解过程中肽的抗氧化活性和蛋白酶分子的活 性进行保护，制备高活性的抗氧化肽。酶解过程中抗氧化肽活性保护及其制备方法，该方法的具体步骤为1.样品液制备取一定量的上述蛋白样品加入终浓度为0. 005 0. 06% (W V) 的巯基保护剂配制成2% 10%浓度(W V)的蛋白液，并加HCL或者NaOH溶液调整并维 持PH为3 10，以保护酶与蛋白的巯基，同时改善易结块蛋白的分散性。2.保护酶解将制备好样品液放入可以密闭的反应釜中，然后以[E]/[S]= 0. 5 10%迅速加入蛋白酶，立刻密封反应釜；并抽去反应釜内的空气，直至反应釜内压力降为10mm/Hg时，通入N2、C02或惰性气体等保护气体至常压；开动搅拌器搅拌，在反应釜温 度30 65°C，pH3 10，反应釜密闭条件下，酶解2 12h。水解结束后，沸水浴灭酶IOmin。3.抗氧化肽制备将水解液过滤、浓缩，然后经过冷冻干燥、真空干燥或喷雾干 燥，即为抗氧化活性肽产品。本发明的有益效果采用本发明方法制备得到的肽产品为白色或淡黄色粉末、无 异味，抗氧化活性强。经实验验证，以玉米醇溶蛋白为原料制备得到的抗氧化肽产品中总氮 收率93%以上，相比同条件下的开放体系酶解，其DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除 活性分别提高了 35 50%以上和10 15%以上；以胶原蛋白为原料时，保护酶解与开放 体系酶解的产物相比，总抗氧化活性提高了 15 45%以上，酶解速度加快15 35%;以鹿 茸血为原料时，保护酶解与开放体系酶解的产物相比，总抗氧化活性提高了 25%以上。说明 采取适当的保护方法可以有效防止酶解过程抗氧化肽的活性损失和蛋白酶分子的活性损 失，能够制得具有较高活性的产品。
具体实施例方式实施例1:1.玉米醇溶蛋白悬浊液制备称取80g玉米醇溶蛋白粉于3L烧杯中，加入2L经 过超声脱气的0. 03%亚硫酸钠溶液，在室温下搅拌加碱(1N的NaOH)，调整并维持pH在9. O
左右稳定。2.保护酶解将制备好的玉米醇溶蛋白悬浊液放入带有搅拌器、PH计、温度计和 溶解氧电极的5L的反应釜内，迅速加入1. 6mL碱性蛋白酶(酶活1. 6*105U/mL)立刻密封反 应釜；开动真空泵抽去反应釜内的空气(至反应釜内压力降为10mm/Hg)，再通入氮气，至常 压，开动搅拌器搅拌，并开始升温至55 °C，保持4h。酶解期间自动进样口自动加碱，保持pH 稳定9. O。水解结束后，沸水浴灭酶lOmin。取出水解液放在冰浴里迅速冷却后，以12000r/ min 4°C离心15min，取上清液。3.抗氧化肽产品制备将上步制得的上清液超滤、蒸发浓缩后冷冻干燥，即为抗 氧化活性肽产品。该成品的总氮收率在93%以上；相比同条件下的开放体系酶解，其DPPH自由基清 除活性和ABTS自由基清除活性分别提高50%以上和14%以上。实施例2:1.胶原蛋白悬浊液制备称取50g胶原蛋白溶解于IL经过超声脱气的0.005%巯 基乙醇溶液中，用HCL调整并维持pH3.0至稳定，配制成5% (W V)的蛋白悬浊液。2.保护酶解将底物悬浊液移至反应釜中，以[E]/[S] = 5% (酶活8. 0*104U/g) 加入酶后密闭反应釜，抽真空后通入二氧化碳至常压；开动搅拌器搅拌，并开始升温并维持 在55°C，pH3. O。保持4h。水解结束后沸水浴灭酶IOmin结束反应，取出水解液放在冰浴里 迅速冷却后，以12000r/min在4°C离心15min，取上清液。3.抗氧化肽产品制备将上步制得的上清液超滤、蒸发浓缩后冷冻干燥，即为抗 氧化活性肽产品。该成品的总氮收率在95%以上；相比同条件下的开放体系酶解，水解速度加快 10%，而水解液总抗氧化活性提高15%以上。
实施例3:1.马鹿茸血样品液制备称取50g马鹿茸血，加入0. 005%二硫苏糖醇500mL，配 成浓度为10% (W V)的马鹿茸血样品液。2.保护酶解将样品液在100°C水浴IOmin后移入反应釜内，以氢氧化钠溶液调至 PH 7，以[E]/[S] =6. 5%加入中性蛋白酶(酶活10. 82X 104U/g)，加入酶后密闭反应釜，抽 真空后通入氦气至常压；开动搅拌器搅拌，在50°C反应2h，煮沸IOmin灭活酶，迅速冷却至 45°C以下，以[E]/[S] =9%加入木瓜蛋白酶(酶活14. 10X104u/g)，再次抽真空后通入氦 气至常压；反应4h(pH 6. 8)，煮沸IOmin后冷却，将水解液以12000rpm/min离心lOmin，收 集上清液。3.抗氧化肽产品制备将上步制得的上清液超滤、蒸发浓缩后冷冻干燥，即为抗 氧化活性肽产品。该成品的总氮收率在95%以上；相比同条件下的开放体系酶解，水解液总抗氧化 活性提高25%以上。应用例1 以紫外线照射建立UVB小鼠皮肤损伤模型，日粮中添加10 25g/kg体重保护酶 解的骨胶原水解产物肽，可显著提高免疫器官指数、皮肤水分及羟脯氨酸含量，降低耳指数 及皮肤厚度；有效降低血液及皮肤的自由基水平，并对氧化应激造成的GSH-Px、SOD,CAT活 力的下降、总抗氧化能力的降低、MDA含量的升高具有显著的改善作用，从而减轻UVB照射 造成的皮肤老化损伤以及机体的免疫、抗氧化系统损伤。
权利要求
一种酶解过程中抗氧化肽活性保护及其制备方法，其特征在于分别以N2、CO2或惰性气体为酶解过程中的保护气体以及亚硫酸钠、巯基乙醇、巯基乙胺或二巯基化合物等巯基保护剂，改善蛋白分散性，保护蛋白酶及其水解过程中产生的抗氧化肽活性基团，提高酶解效率。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于使用的蛋白原料中植物蛋白为玉米 蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、大豆醇溶蛋白、小麦蛋白、小麦醇溶蛋白，大米蛋白、米糠蛋 白等，动物蛋白为胶原蛋白、乳清蛋白等，动物血液猪血、牛血、马鹿茸血等。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述使用的蛋白酶包括来源于动物、 植物、微生物的内切蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的内切蛋白酶为碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜 蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述酶解过程中充入的保护气体为氮 气、二氧化碳气体和氦气等惰性气体。
6.根据权利要求1所述的制备方法其特征在于所述使用的巯基保护剂为亚硫酸钠、 巯基乙醇、巯基乙胺、二硫苏糖醇或二巯基化合物等。
全文摘要
酶解过程中抗氧化肽活性保护及其制备方法，属于动植物蛋白的开发利用领域。本发明以动物、植物蛋白和动物血液为原料，通过在酶解过程中采取充入保护气体和添加巯基保护剂的处理方法，以提高蛋白溶解性和酶解效率，保护蛋白酶活性和抗氧化肽活性，制成高活性的抗氧化肽产品。本方法制得的抗氧化肽产品在制备时间、抗氧化活性等方面均比使用传统方法制得的产品有明显的提高。该产品具有极佳的抗氧化活性，适宜在保健品、高级营养食品、化妆品、动物饲料和动物食品等领域的应用。
文档编号C12P21/06GK101914604SQ20101024227
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者乐国伟, 施用晖, 田许, 马淑凤 申请人:江南大学