专利名称：一种猪细胞培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清。本发明还涉及一种培养猪细胞的方法，一种胎猪血清以及所述胎猪血清在培养猪细胞或者制备猪细胞培养基中的用途。
背景技术：
培养基既是细胞培养中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。目前主要使用的是在合成培养基中加入天然成分而成的完全培养基。完全培养基由基础培养基(如MEM)和添加成分(如血清，或对于无血清的培养基，使用激素及生长因子)组成。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5% -20% (ν/ν)。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作细胞增殖用，也用于细胞系和原代培养，而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。目前，猪细胞培养基主要是由基础培养基DMEM和/或F12与胎牛血清构成的完全培养基，同时，这种培养基也广泛应用于其它种类细胞的培养。胎牛血清来源较为容易，产量较大，是普遍使用的血清。但猪细胞在此种培养基上培养时细胞生长状态和细胞的增殖速度都较为有限，细胞的传代次数也受到了很大的影响。目前在猪的细胞培养方面依然缺少较为理想合适的培养基。对此，本发明人研制了一种猪细胞培养基，其中在基础培养基中加入胎猪血清替代胎牛血清，以排除使用胎牛血清导致的异种成分引起的排斥现象。本发明，所述猪细胞中还可以加入选自如下至少一种的添加因子表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG)。采用本发明所述的猪细胞培养基可以显著改善猪细胞的培养状态和提高猪细胞的增殖水平，有利于用猪的细胞进行转基因克隆和诱导性多能干细胞的相关研究和应用。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清，并且按照培养基的总体积，所述胎猪血清的含量为5%-25% (ν/ν) 0在本发明的一个实施方案中，猪细胞培养基中所述胎猪血清的含量为8-12% (ν/ν)。在本发明的又一个实施方案中， 猪细胞培养基中所述胎猪血清的含量为10-12% (ν/ν) 0在本发明中，猪细胞是指来源于猪个体的各种部位不同生长时期的细胞。本发明的猪细胞培养基适用于来自猪个体不同生长时期的各种细胞，包括但不限于原代猪成纤维细胞、猪肾细胞、猪心肌细胞、猪卵母细胞、猪血管内皮细胞等等。其中，所述“猪细胞”和“胎猪血清”中的猪的品系并不特别限定，常见的是家猪。所述胎猪血清可以按照如下方法制得1)血清分离将获自猪胎的血样进行离心，获得血清；2)冷冻脱纤将步骤1)中离心分离得到的血清在-20°c下冷冻脱纤(即脱去纤维)；3)澄清过滤将步骤2)中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进行过滤；4)血清透析将步骤3)得到的样品用分子量12000-14000的透析膜在0. 15M NaCl溶液中透析，直至样品的葡萄糖含量< 0. 5mg/mL ；5) γ射线照射将步骤4)得到的样品进行、射线照射，照射剂量为1. 2_4Gy，得到粗制血清；和6)除菌过滤先后使用0. 2微米和0. 1微米滤膜，将步骤5)中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。上述步骤1)中，所述猪胎优选3-4周龄的猪胎。在本发明的一个实施方案中，所述胎猪血清的制备方法还包括步骤7)和8)7)紫外线照射装瓶前用紫外线照射；8)封装保存将前面步骤7)制得的胎猪血清装瓶密封，-20°C低温保存，使用之前 4°C过夜解冻。在本发明的一个实施方案中，所述猪细胞培养基中的基础培养基为DMEM、或F12、 或者是如下面的表1所示组成的人工培养基表1 人工培养基配方
权利要求
1.一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清，并且按照猪细胞培养基的总体积，所述胎猪血清的含量为5%-25% (ν/ν)；具体地，所述胎猪血清的含量为8%-12% (ν/ ν)；更具体地，所述胎猪血清的含量为10^-12% (ν/ν) 0
2.根据权利要求1所述的猪细胞培养基，其中，所述胎猪血清按照如下方法制得1)血清分离将获自猪胎的血样进行离心，获得血清；2)冷冻脱纤将步骤1)中离心分离得到的血清在-20°C下冷冻脱纤；3)澄清过滤将步骤2、中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进行过滤；4)血清透析将步骤3)得到的样品用分子量12000-14000的透析膜在0.15M NaCl溶液中透析，直至样品的葡萄糖含量< 0. 5mg/mL ；5)Y射线照射将步骤4)得到的样品进行Y射线照射，照射剂量为1. 2-4Gy，得到粗制血清；和6)除菌过滤先后使用0.2微米和0. 1微米滤膜，将步骤幻中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
3.根据权利要求1所述的猪细胞培养基，其中，所述基础培养基为DMEM、或F12、或者是如下组成的人工培养基(mg/L)无水氯化钙 200. 00-240. 00L-丝氨酸42. 00-55. 00L-色氨酸16. 00-20. 00L-苏氨酸95.00-110.00L-酪氨酸钠盐 104. 00-123. 00硝酸铁0. 10-0. 40氯化钾400.00-600. 00L-缬氨酸94. 00-112. 00L-盐酸精氨酸84. 00-98. 00L-谷氨酰胺584. 00-628. 00L-盐酸胱氨酸63. 00-72. 00L-亮氨酸95. 00-110. 00L-异亮氨酸93. 00-105. 00L-盐酸组氨酸32. 00-52. 00L-盐酸赖氨酸126.00-156. 00L-甲硫氨酸25. 00-40. 00L-苯丙氨酸46. 00-78. 00无水硫酸镁87. 67-99. 60氯化钠4400. 00-6700. C无水磷酸二氢钠105. 00-145. 00D-泛酸钙2. 00-6. 00氯化胆碱2. 00-5. 50叶酸3. 00-5. 50肌醇5. 20-8. 30甘氨酸烟酰胺核黄素盐酸硫胺0. 20-0. 6020. 00-40. 002.00-5. 003.00-6. 00 3500.00-5500. 00 100. 00-120. 00 以及 14. 00-16. 00。00-5. 00盐酸吡哆辛葡萄糖丙酮酸钠酚红
4.根据权利要求1所述的猪细胞培养基，其中，还含有如下添加因子中的至少一种 表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、 人绒毛膜促性腺激素、以及孕马血清促性腺激素。
5.根据权利要求4所述的猪细胞培养基，其中，按照猪细胞培养基的体积，添加因子的含量各自独立地为表皮生长因子3-15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子2-15ng/mL人绒毛膜促性腺激素4-30IU/mL孕马血清促性腺激素248IU/mL ；具体地，添加因子的含量各自独立地为 表皮生长因子8. 5-12. 6ng/mL碱性成纤维细胞生长因子6.6-11.8ng/mL人绒毛膜促性腺激素16. 7-23. 4IU/mL孕马血清促性腺激素17. 3-22. 6IU/mL。
6.一种培养猪细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1-5中任一项所述的猪细胞培养基，其中，所述猪细胞选自原代猪成纤维细胞、猪肾细胞、猪心肌细胞、猪卵母细胞、和猪血管内皮细胞。
7.一种按照如下方法制备的胎猪血清1)血清分离将获自猪胎的血样进行离心，获得血清；2)冷冻脱纤将步骤1)中离心分离得到的血清在-20°C下冷冻脱纤；3)澄清过滤将步骤2、中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进行过滤；4)血清透析将步骤3)得到的样品用分子量12000-14000的透析膜在0.15M NaCl溶液中透析，直至样品的葡萄糖含量< 0. 5mg/mL ；5)Y射线照射将步骤4)得到的样品进行Y射线照射，照射剂量为1. 2-4Gy，得到粗制血清；和6)除菌过滤先后使用0.2微米和0. 1微米滤膜，将步骤幻中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
8.权利要求7所述的胎猪血清在猪细胞培养和/或制备猪细胞培养基中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述猪细胞选自原代猪成纤维细胞、猪肾细胞、猪心肌细胞、猪卵母细胞、和猪血管内皮细胞。
全文摘要
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清。本发明还涉及一种培养猪细胞的方法，一种胎猪血清以及所述胎猪血清在培养猪细胞或者制备猪细胞培养基中的用途。
文档编号C12N5/071GK102344904SQ20101024248
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者刘欢, 李巍, 梁颜 申请人:深圳华大基因科技有限公司, 深圳华大方舟生物技术有限公司