专利名称：一种免疫毒素及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体的说，涉及一种免疫毒素，以及含有这种免疫毒素的 载体、转化的菌株和用途。
背景技术：
器官移植是20世纪医学的重大成就之一，是多种脏器终末性疾病目前唯一的治 疗手段。仅我国每年新增的肝、肾及心脏功能衰竭患者就达数百万，其中大部分可通过器官 移植延长生命。从供体器官来源来分，器官移植可分为同种同基因移植(如自体移植、孪生 子之间的移植)、同种异基因移植、以及异种移植。目前绝大多数脏器移植均为同种异基因 移植。由于人体主要组织相容抗原(MHC抗原)的高度多样性，不可避免地造成供体脏器抗 原与受体免疫系统不相容，手术后产生严重排斥反应。急性排斥反应是最常见的一种移植排斥反应，属于迟发型变态反应的细胞免疫现 象，是移植物的HLA抗原刺激受者T淋巴细胞使之分化增殖，产生大量具有特异性的致敏淋 巴细胞，可直接杀伤或通过释放各种淋巴因子杀伤靶细胞，排斥移植物。现认为体液免疫也 参与急性排斥反应。组织病理学改变为血管内膜损伤和纤维素样坏死伴单核细胞浸润。急 性排斥反应经过及时正确的处理，80-90%能被逆转。T淋巴细胞是特异性免疫应答反应最重要的功能细胞，在免疫识别、免疫反应启 动、效应阶段，以及免疫调节的过程中，无不起着重要的作用。器官移植排斥反应基本上属 于特异性免疫应答反应，移植免疫学研究表明，T细胞是急性移植排斥的主要效应细胞。环 孢霉素A、0KT3等现代免疫移植剂及通过广泛作用于T细胞而发挥抗移植排斥作用。但是， 由于这些药物作用不具有特异性，因而增加了感染和恶性肿瘤发生的几率，在一定程度上 抵消了移植的治疗效果。虽然免疫耐受是移植研究的终极目标，但是开发特异性作用于活 化T细胞的免疫抑制剂成为移植研究的更现实目标。研究发现，IL-2是免疫系统中重要的信号分子，其受体表达是同种抗原反应性T 细胞活化的关键步骤。⑶25是IL-2受体的alpha链。一般情况下，静止T细胞和B细胞不 表达⑶25。但是在发生排斥的病人，外周血T细胞和移植物局部浸润T细胞表达⑶25明 显增加，排斥前和排斥过程中活化的T细胞分泌的游离的IL-2Ra在血清中增加；而且，抗 ⑶25抗体体外可以抑制MHC不匹配淋巴细胞的混合反应及CTL产生。⑶25抗体能够干扰 IL-2结合到其高亲和受体上，有效地与IL-2竞争，抑制IL-2启动的T细胞增殖反应，从而 选择性地抑制了免疫应答，防止了同种异体排斥反应。因此，CD25抗体是一种可用于预防 器官移植排斥反应的抗体。然而，单独使用单抗的治疗效果并不理想，人们很快开发出了以单抗或细胞因子 为导向部分，与经修饰的毒蛋白相连，对靶细胞进行杀伤作用的免疫毒素。第一代免疫毒素是通过化学偶联，以二硫键将完整的单抗与经过修饰的毒蛋白相连而合成。经化学偶联的 免疫毒素需要单独制备抗体和毒素，异源性高，毒性强，并且分子量很大( 200kDa)，导致 其穿透实体肿瘤的能力很差，从而大大影响了其在肿瘤治疗中的应用。第二代的免疫毒素 是由完整的单抗与经修饰的或不完整的毒素组成。由于毒素蛋白经修饰毒性降低，动物较 容易耐受，但缺陷依然存在。随着分子生物学技术的发展，重组免疫毒素应用而生，利用DNA 重组技术，将异源的scFv基因与经削减的毒素基因融合并克隆到合适的载体上，在大肠杆 菌中翻译出单链嵌合蛋白，因此又称为基因工程免疫毒素。将免疫毒素克隆到适当的表达 载体中，在大肠杆菌中得到高效转录和翻译，而且表达周期短，具有操作简便、成本低廉、易 于控制和大规模生产的特点。抗体携带毒素导向具有特异抗原的肿瘤组织，与靶细胞上的 抗原结合，毒素内化，催化性地使核糖体失活，抑制蛋白合成，杀死细胞。因此，本领域仍需 要提供一种高效低毒的免疫毒素。
发明内容
本发明需要解决的第一个技术问题是提供一种分离的多肽，包含抗人单克隆抗体 ⑶25的单链抗体ScFv，以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL，以弥补现有技 术的不足。本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述多肽的DNA分子。本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种表达上述DNA分子的载体。本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种被上述表达载体转化的宿主细胞。本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种预防和/或治疗T细胞介导的疾病 的药物组合物。本发明需要解决的第六个技术问题是提供一种多肽在制备预防和/或治疗T细胞 介导的疾病的药物中的用途。本发明的技术方案如下本发明第一方面提供了一种分离的多肽，该多肽包含抗人单克隆抗体CD25的单 链抗体ScFv，以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL，所述单链抗体ScFv具 有重链可变区-接头-轻链可变区的结构，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO :1所示的氨 基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；所述免疫毒素PE38KDEL 具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可 用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方 法(美国专利No. 4，816，567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature, 352 624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)所述的技术从噬菌体抗体库 中分离获得。本发明所用的术语“单链Fv”或〃 ScFv"或“sFv”抗体包括抗体的VH和VL区， 其中这些区在一条多肽链中。通常，Fv多肽还包括VH和VL区间的多肽接头，该接头可 使ScFv形成结合抗原所需的结构。关于ScFv综述可见Pluckthim在《单克隆抗体药理 学》(The Pharmacology of Monoclonal antibodies), 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编辑， Springer-Verlag, New York，269—315 页(1994)。
本发明中的绿脓杆菌外毒素(PE)，是66KD的单链蛋白，氨基末端构成Ia区，为细 胞结合结构区域，Ib (365-404)，是介于II与III区之间的小分子，功能不清楚，但去除后不 影响毒素的活性。第253-364氨基酸组成II区，负责毒素的转位。III区，405-613，具有 ADP核糖基化活性。PE及衍生物到达细胞，在受体或抗体受体介导下内吞，在胞内蛋白水解 酶的作用下I、II区被去除，III区转移入内质网，再转移至胞质。将PE的I区去除，再将 PE分子的羧基REDLK突变为KDEL，即PE38KDEL，其细胞毒生物学活性可提高6_10倍。本发明提供了一种多肽，该多肽是由单链抗体ScFv和免疫毒素PE38KDEL通过共 价键或接头来连接。它们的前后次序或位置可以互换。本发明还提供了编码上述多肽的DNA分子，含有该DNA分子以及与所述序列操作 性相连的表达调控序列的表达载体，以及被所述表达载体转化的宿主细胞。本发明另一方面还提供了制备上述多肽的方法，该方法包括a)提供表达载体， 该表达载体含有上述DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a) 所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述多肽表达的条件下培养步骤b)所得的宿主 细胞；和d)分离纯化获得所述多肽。本发明的多肽可由本领域技术人员根据常规手段来获得。首先，可根据本发明提 供的序列信息用化学合成或PCR等常规获得上述DNA分子。然后，用本领域熟知的各种方法 通过选择合适的酶切位点将该DNA分子插入表达载体中使其与表达调控序列操作性相连。 “表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列，其包括与目标核苷酸序列操作性 相连的启动子和终止信号，通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是 指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体。随后， 用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞” 一般包括原核细胞和真核细胞。 常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细 胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这 些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓 鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如H印G2)和其它许多细胞系。用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿 主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转 染、磷酸钙沉淀、Polybrene (1,5- 二甲基-1，5- 二氮i^一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原 生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。然后，在适合多肽表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球 蛋白纯化步骤，如蛋白A-S印harose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水 层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明 的多肽。本发明另一方面还提供了一种预防和/或治疗T细胞介导的疾病的药物组合物， 该组合物药学上有效量的上述多肽以及药学上可接受的载体。在较佳的实施方案中，该药 物组合物中还可含有与本发明的多肽联用的其它化疗药物和放疗药物。本文所用的术语 “药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利 的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的多肽相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低单克隆抗体或药物组合物的药效。可作为药 学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉， 如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维 素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油， 如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘 露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween ；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂； 压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的药物组合物可用于治疗T细胞介导的疾病，包括移植排斥，移植物抗机 体或机体抗移植物。
图1 :CD25(sFv)引物设计图，CD25-1、_2、_3、_4 引物扩增 ScFv ；图 2 :PE38KDEL 引物设计图，PE38-1、_2、_3、_4 引物扩增 PE38KDEL ；图 3 :CD25-PE38KDEL 引物设计图，用引物 CD25-1、PE38-4over_lapping PCR 扩增 CD25-PE38KDEL ；图4 重组表达载体构建图。图5 :CD25-PE38KDEL免疫毒素对HUT-102细胞的杀伤活性结果。图6 ⑶25-PE38KDEL免疫毒素对混合淋巴细胞反应的抑制作用结果。图7 :CD25-PE38KDEL治疗组与PBS对照组分别清除CD25+T细胞的对比结果。
具体实施例方式下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只 是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。实施例1⑶25单链抗体及其免疫毒素基因的克隆1.实验材料1. 1 菌株大肠杆菌 TGl 和 BL21 (DE3)。1. 2序列抗CD25单抗的重链和轻链，按照文献Design of humanizedantibodies :from anti-Tac to Zenapax. Methods. 2005May ；36(1) :69_83 艮 的序列合成。1. 3工具酶及试剂盒限制性内切酶购自Promega公司。Taq DNApolymerase购自 上海皓嘉科技发展有限公司。质粒提取试剂盒购自Qiagen公司和华舜公司，DNA回收试剂 盒购自华舜公司，PCR扩增试剂盒购自生工公司。pGEM-T vector购自美国Promega公司。1. 4DNA分子量标准2000bpMarker为华美公司产品。1. 5PCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。1. 6细菌培养试剂胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉为英国0X0ID公司产品。1. 7主要实验仪器PCR 仪德国 Mastercycler gradient, Nethller-HinZ GmbH 产品；复日 FR-980 生 物电泳图像分析系统上海复日生物实验技术研制所产品；UV-2401PC紫外分光光度计(上 海分析仪器总厂，UV755B型)；_80°C低温冰箱美国REVCO, Asheville, N, C产品；细菌培
6养摇床上海离心机械研究所产品2.实验方法2. 1引物设计选择抗体重链和轻链可变区的适当位置，分别设计4条特异性引 物，用来克隆单链抗体和免疫毒素的抗体部分；选择PE40毒素的适当位置分别设计4条引 物，用来克隆PE38KDEL毒素和免疫毒素的毒素部分。引物序列如下
引物
CD25引物 轻链引物
1:5’ ACGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCACCCTGT(SEQ ID NO 5) 2 5‘ACCAGAGCCACCACCGCCAGAGCCACCACCACCTTTGACCTCCACCTT (SEQ ID NO 6)重链
3:5’ -TCTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCTCAGGTGCAGCTG(SEQ ID NO 7) 4:5’ -CAGCGCGGCCAGGCTGCCGCC AGAGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQ ID NO 8) PE38引物
1:5’ -CCCTGGTCACCGTCTCCTCTGGCGGCAGCCTGGCCGC GCT G_3’ (SEQ ID NO 9)
2:5’ -GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3，(SEQ ID NO 10) 3:5’ -GAGGCCGGCGCGGCCAACGGCCCGGCGGACAGCGGCGAC-3，(SEQ ID NO 11) 4 :5’ -GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3，(SEQ ID NO 12) 引物所处的位置如图1、2和3所示。
2.2重叠PCR PCR均采用热启动，⑶25重链和轻链可变区序列的扩增条件是 940C 5min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，72°C 5min，30 个循环。PE 毒素序列中由于 GC 含量高达70%以上，用普通的PCR很难扩增，因此选用Takara公司专门用来扩增GC含量高 的 DNA 聚合酶，其 PCR 条件是 94°C lmin，94°C 30s, 60°C 50s, 72°C lmin，72°C 5min，30 个循环。2.3质粒的构建2. 3. 1连接反应1)分别取适量以DNA回收试剂盒回收DNA片段、经匹配末端限制 性内切酶线性化的载体DNA(两者末端浓度比为1 1-1 2) ；2)加连接缓冲液1.0 μ 1、 T4DNA连接酶1 μ 1，加水至10 μ 1 ；3) 16°C连接过夜；4)铺板，形成具有相应抗生素抗性的
单克隆；2. 3. 2感受态细菌的制备1)挑取单一菌落于5ml液体LB培养基，37°C振荡培养 过夜，制备过夜菌；2)按1 100将过夜菌接种到LB液体培养基，37°C振荡培养约3h，OD值 为0. 3-0. 6时停止培养；3)菌液加入1. 5ml Ependorf管，1. 5ml/管，离心，lkrpm, Imin,沉 淀细菌，弃上清；4)加入冰预冷的IOOmM CaCl2溶液，200μ 1/管，冰浴30min ；5)离心沉淀 细菌，lkrpm, Imin,弃上清，加入冰预冷的IOOmM CaCl2溶液，100 μ 1/管；6)冰浴Ih以上， 备用。2. 3. 3转化1)取一个Ependorf管，加入DNA连接物2 μ 1、感受态细菌100μ 1，冰 浴Ih ；2)42°C热休克3min，冰浴2min ；3)加液体LB培养基200 μ 1，37°C振荡培养45min ；4) 取100 μ 1涂布于含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，晾干；5) 37°C倒置培养过夜；2. 3. 4重组质粒的提取1)挑取数个转化的单菌落，每个菌落分别接种于5ml含 50 μ g/ml的抗生素LB液体培养基，37°C振荡培养过夜；2)离心收获细菌，IOkrpm, Imin ；3)质粒提取试剂盒提取质粒；4)电泳检测质粒质量，测0D260/0D280决定质粒含量。2. 3. 5重组质粒的酶切鉴定1)取Ependorf管，依次加入约5 μ 1 IOX酶切缓冲 液、2yg质粒、Ιμ 酶1、1μ1酶2，以灭菌去离子水补充至50 μ 1 ；2)置37°C，lh;3)琼脂 糖凝胶电泳检测；3.实验结果3. IDNA 的扩增采用常规PCR技术顺利扩增了 CD25的单链抗体及用来构建免疫毒素的抗体部分。 PCR扩增结果与预期吻合。同时扩增PE38序列。扩增序列大小与预期吻合。将上述PCR 产物胶回收，取CD25-l-linker和linker_PE38KDEL胶回收产物进行重叠(over-lapping) PCR。3. 2序列测定和分析将上述PCR扩增产物克隆到pGEM -T载体中，转化大肠杆菌TGl，用蓝白斑筛选阳 性克隆测序。将测序结果正确的克隆保存，用于表达载体的构建。另外，CD25重链可变区 序列显示在SEQ ID NO :1中，CD25轻链可变区序列显示在SEQ IDNO 2中，PE38KDEL毒素 序列显示在SEQ ID NO :3中。单链抗体(ScFv)基因结构是由抗体基因的VH和VL通过非共价键或二硫键连接 而成，保留原有的抗原结合能力[King DJ 等.Biochem J，1993，290 (Pt3) =723-728 ；Huston JS 等.Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85 :5879_5884]，鼠源性抗体的 VH 和 VL 的基因分 别是由4个相对保守的骨架区(FR)和3个抗原互补决定区(CDR)组成，CDR区编码的氨 基酸相互作用共同构成抗原结合位点，也决定了每种抗体的特异性。FR区呈β片层排 列，碱基组成和排列顺序比较稳定，因此可以根据FRl和FR4的碱基组成和排列顺序扩增 VH和VL基因的寡核苷酸引物，用编码易折叠的寡核苷酸接头将二者连接成VH-Iinker-VL 即 ScFv [ColcherD 等.Ann N Y Acid Sci, 1999,880 263-280 ；Zu Putlitz J 等· Biochem BiophysRes Commun, 1999, 24 (255) :785_791]，将此基因克隆入原核或真核表达载体中并 在原核或真核细胞系统中表达，其产物即为ScFv。通用的连接肽有很多，连接肽必须能使 轻、重链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型。同时Linker尽可能减少蛋白 酶的攻击，并防止单链抗体的聚集。Linker长度以14-25个氨基酸残基为适，目前最常用 的连接肽是由Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构和计算机辅助分析结果设计 的具有刚性结构的 15肽序列(G4S) 3 [Mansfield E 等.Blood，1997，90 (5) =2020-2027], Glockshuber等单链抗体在大肠杆菌中表达，并能自发折叠成天然构象，而其抗原的亲和力 几乎和原来的完整抗体一样，其稳定性比通过二硫键相连的Fv片段提高近60倍。ScFv的 研究为进一步制备鼠_人嵌合基因工程抗体和人源化重构抗体奠定了基础。将ScFv与毒 素连接构成融合蛋白的研究意义重大，是近几年研究的热门课题。由于ScFv分子量小，免疫原性小，特异性强，亲和力较高，组织穿透力强等优点 [Niv R等.Int J Cancer，2001，94 :864-872]，在其基因3，端接上与毒素、酶、细胞因子，构 成重组免疫毒素，可以作为良好的导弹，对肿瘤细胞发挥杀伤作用[Van der Poel HG等.J Urol, 2002,168 :266_272 ；Matsumoto H等.Anticancer Res, 2002, 22 :2001_2007]。对于一 个特定的scFv，其稳定性主要是由VH-VL间相互作用的性质和强度以及连接肽的类型决定 的。柔性的连接肽使各个scFv中的VL和VH与附近抗体分子的VH和VL或其它的粘性表面之间不断的结合和解离，因而易于发生聚合和沉淀等现象[Reiter Y等ProteinEng. 1995， 12 1323-1331]。制备免疫毒素的抗体最好属于IgG类，因为IgM类抗体难于毒素偶联，偶 联后的免疫毒素产量和活性均低。⑶25的抗原是理想的靶点，因此将抗⑶25抗体的重链可变区和轻链可变区通过 连接肽(G4S) 3连接起来，构建⑶25的单链抗体，然后又用连接肽将⑶25的单链抗体与 PE38KDEL毒素连接，构建天然的新的免疫毒素CD25-PE38KDEL，为下一步研究肿瘤的靶向
治疗奠定基础。发明人采用常见的over-lapPCR技术将两个DNA片段连在一起。由于PE38KDEL DNA中GC含量很高，这给PCR扩增带来很大困难，用常用的DNA聚合酶和PCR常规条件很难 扩增出对应的片段，于是选用专门用来扩增GC含量高的DNA序列的DNA聚合酶，成功地扩 增了 PE38KDEL和CD25-PE38KDEL。DNA基因重组技术的使用，使制备单链抗体和单链抗体 免疫毒素在二周内即可实现，大大缩短了导向药物的制备时间，成本较低，操作方便，改善 培养条件，大肠杆菌能表达并装配和折叠具有高生物活性的免疫毒素。实施例2 免疫毒素CD25-PE38KDEL的表达纯化免疫毒素原核表达载体构建成功后，转化BL21，挑选高表达阳性克隆，原核表达， 收集细菌，用His-Ni++和分子筛纯化，用蛋白电泳和Iowry酚法鉴定纯化效果。1.实验材料1. 1 菌株大肠杆菌 TGl 和 BL21 (DE3)。1. 2细菌培养试剂LB培养基氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公
司ο1. 3IPTG购自上海华舜生物有限公司。1. 4Chelating sepharose Fast Flow and Superdex75resin 购 自 AmershamPharmacia Biotech(USA)01. 5主要仪器设备AKTA FPLC (Amersham pharmacia biotech) ；Vertical electrophoresissystem(Pharmacia Hoefer Biotech Inc,San Francisco CA,U. S. A,mini VE 型)Electrophoresis Power Supply (amersham Pharmacia biotech, EPS601 型)；Mini Trans-Blot Cell (BI0-RAD 公司)；UV-2401PC 紫外分光光度计(SHIMADZU)2.实验方法2. 1免疫毒素CD25-PE38KDEL的诱导表达当发明人成功构建了免疫毒素⑶25-PE38KDEL的原核表达载体后，转化大肠杆 菌BL21，在LB培养基中表达，37°C扩增，待0D600在0. 6 0. 8之间时，用IPTG诱导(终 浓度为lmmol) 4小时，分别在诱导前后取样。4000转/min离心30min，弃上清收集细菌菌 体。-20°C保存，进行下一步的纯化工作。2. 2 免疫毒素 CD25-PE38KDEL 的纯化1)将收集的细菌菌体用50mmol Tris (pH7. 5) (lg菌体用20液体重悬)重悬， 4°C超生破碎菌体，高速离心(10000转/min) 30min收集可溶性上清和包涵体，取小样进 行SDS-PAGE蛋白电泳；2)将高速离心得到的包涵体用8M尿素、0. IMNaH2PO4^O. OlTris (pH 8. 0)室温变性2小时，10000转/min离心30min,收集上清；3)将收集的上清用0. 45um的滤膜过滤准备用His-Ni++金属鏊合柱纯化；4)装IOml的His-Ni++金属鏊合柱，用5个柱 体积的水冲洗后，用5柱体积的平衡液(8M尿素、0. 1M0. IM NaH2P04、0. OlTrisUOmmol咪唑 PH 8.0)平衡，上样(流速为2ml/min) ；5)上样完备后，再用5柱体积的平衡液(8M尿素、 0. IM NaH2P04、0. OlTrisUOmmol咪唑pH 8. 0)平衡，然后用5小时将8M尿素的平衡液逐步 减为OM尿素的平衡液，此为蛋白的柱上复性过程；6)蛋白柱上复性完成后，用5柱体积的 洗脱液(0.02M PB，0.5M咪唑)洗脱，收集蛋白峰。蛋白电泳检测其纯化情况；7)将洗脱收 集的蛋白再进行分子筛(20mmolPB)纯化，收集蛋白峰，进行电泳，确定对应的目的蛋白。
2. 3免疫毒素CD25-PE38KDEL的浓度测定和纯度鉴定 对纯化的蛋白采用SDS-PAGE蛋白电泳和280nm紫外读数法和Iowry酚法检测纯 度和浓度。2. 3. 1蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)1)15%凝胶电泳，制胶后按预定顺序加样，每孔加15μ 1，在甘氨酸电泳缓冲液中 初始以60V电压进行电泳；2)当样品进入分离胶时将电压改为150V，直至溴酚蓝跑出胶的 底部。取出凝胶在染色液中室温染色4小时；3)在脱色液中脱色，每隔1小时换脱色液一 次，充分脱色后，干胶。2. 3. 2蛋白浓度测定1)根据紫外测定值，稀释样品至合适浓度，用Lowry酚法测免疫毒素蛋白浓度，配 置标准蛋白质溶液(lmg/ml)，从1000 μ g/ml开始稀释为1000,500,250,125,62. 5 ；2)样品 也大概从1000 μ g/ml开始稀释5个浓度。3)以标准蛋白质浓度为横坐标，光密度(OD75tl) 值为纵坐标，绘制标准曲线。3.实验结果3. 1免疫毒素CD25-PE38KDEL的诱导表达将构建好的免疫毒素表达质粒转化大肠杆菌BL21，待0D600在0. 6 0. 8之间 时，加入IPTG，37°C诱导表达4小时，4°C离心收集细菌，将诱导前后的细菌裂解，取样进行 SDS-PAGE电泳，发现诱导后有明显的诱导条带，而且蛋白分子量大小与预期蛋白分子量一 致。将收集的菌体重悬后在冰水中超声碎菌，高速离心收集上清和包涵体，蛋白电泳显示其 表达形式以包涵体为主。3. 2 免疫毒素 CD25-PE38KDEL 的纯化根据蛋白电泳显示免疫毒素主要是以包涵体形式表达。对于包涵体变性，常用的 变性剂主要有尿素(8M)、盐酸胍(GdnHCl 6-8M)，通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白 间的氢键而增溶蛋白。采用8M尿素变性包涵体(室温2小时)，离心收集上清，过滤后用 His-Ni++金属鏊合柱纯化，将目的蛋白结合到亲和柱上，缓慢地去除平衡液中的尿素，即为 柱上复性的过程，最后用洗脱液洗脱收集蛋白峰，将收集的蛋白在用分子筛纯化，最后将纯 化的免疫毒素⑶25-PE38KDEL及其突变体蛋白进行SDS-PAGE电泳。3. 3免疫毒素CD25-PE38KDEL及其突变体的纯度和浓度测定将收集的蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，发现其纯度大于90%，可以满足实验要 求。结合蛋白电泳、280nm紫外读数法和Iowry酚法定量蛋白浓度，它们浓度在0. 24-0. 5mg/ ml之间。本实施例成功地构建了免疫毒素⑶25-PE38KDEL的原核表达载体，并进行了表达纯化。使用的表达载体是pET32a，得到的蛋白是融合蛋白，其主要是以包涵体为主。包涵体 变性、复性是本部分的难点。目前，对于包涵体变性，常用的变性剂主要有尿素(8M)、盐酸胍(GdnHC16-8M)，通 过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去垢剂如强的阴离子去垢剂 SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去 除而不允许在制药过程中使用。极端pH:可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在 pH> 9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这 些方法只适合于少部分蛋白的增溶。变性剂的使用浓度和作用时间一般在偏碱性的环境 中，如pH8. 0-9. 0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pHl. 0。有些蛋白只能用盐酸胍 如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。复性通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠 结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。复性中常 采用的方法有稀释复性直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂 稀释速度太快，不易控制。透析复性好处是不增加体积，逐渐降低外透液浓度来控制变性 剂去除速度，易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。超滤复性在生产 中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且 有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。柱上复性是最近研究较多并成功的在生产中 应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性是通过柱上复性进行的。常用于复性的层 析方法有SEC、HIC等。复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外， 还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二 硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对 其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的 复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去 除速度、温度、PH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等[Giovane， C.等.J.Mol.Recognit. 1999，12 :141-152 ;Ben Khal ifa 等，J. Mol. Recognit. 2000，13 127-139 ；Christensen, L. L. Anal.Biochem. 1997，249 153-164 ；Lilie, H.等·Curr. Opin. Biotechnol. 1998,9 :497_501]。复性效果的检测根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等 方面对蛋白质的复性效率进行检测。1、凝胶电泳一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶 电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的 蛋白复性后二硫键的配对情况。2、光谱学方法可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性 光谱(CD)等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研 究中的过程检测。3、色谱方法如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不 同，4、生物学活性及比活测定一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性 蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体 内活性。5、黏度和浊度测定复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露， 一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。6、免疫学方法如ELISA、TOSTERN等，特别 是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态[Fischer，B.等，.Arzneimittelforschung. 1992,42 1512—1515 ；Buchner, J.等.Anal. Biochem. 1992,205 263-270 ；Rogl, H.等，FEBS Lett. 1998,423 21-26 ；Mihic, S. J.等· BioTechniques. 1996， 20 804-808 ；Werner, Μ. H.等· FEBS Lett. 1994，345 125-130 ；Batas, B.等· Biotechnol. Bioeng. 1996,50 16-23]。根据目前包涵体变性、复性存在的问题，本发明者选择价格便宜的尿素为变性 剂，复性方法采用柱上复性[Colangeli R.等.J. Chromatography B 1998,714:223-235; Rapid and efficient purification and refolding of a(His)6-tagged recombinant protein produced in E. coli as inclusion bodies,18-1134-37, Amersham Pharmacia Biotech]。根据纯化结果和下一部分的活性检测结果，该方法是成功的。这样，仅用二步纯 化法和His-Ni++柱上复性得到了目的蛋白，既节省了时间又减少了目的蛋白的损失。实施例3 HUT-102细胞杀伤试验1.材料和试剂台式离心机Eppendorf公司产品生物安全柜台湾造鑫公司产品细胞培养箱美国Revco，Asheville, N, C产品培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴细胞培养试剂小牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品；RPMI-1640培养基和 DMEM培养基为GIBCO公司产品。磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含小牛血清的PBS(PBSS)。测活细胞株HUT-102细胞(ATCC TIB162)，含10 %新生小牛血清(NBS)的 RPMI-1640/DMEM(1 1)培养液传代培养于25_75cm2方瓶中。培养条件37°C，5% CO2，饱和湿度。2.方法⑶25-PE38KDEL用无酚红培养液稀释至2 μ g/mL,并连续2倍比稀释。对数生长期的HUT-102细胞，离心弃上清，无酚红培养液调整细胞密度至2X IO5/ ml，然后将细胞悬液加入96孔细胞培养板，0. Iml/孔。CD25-PE38KDEL的序列稀释液加入上步96孔培养板中，0. Iml/孔，每一浓度设2 复孔，培养液为空白对照，细胞培养箱反应4-6小时。取各孔上清50 μ 1/孔，转入另一 96孔板相应孔中，加入细胞杀伤检测试剂，细胞 培养箱反应30分钟，酶标仪读取0D490nm。3.结果分析采用分析软件Select2. 2拟合标准曲线横坐标为工作参考品或待测样品的浓 度，纵坐标为OD值的平均数，曲线为“S”形，因此选用4参数方程回归模型。该软件给出的回归方程为Y= (A-B)/[1+(X/C)D]+B根据该方程，X = +①时，Y = B，即最高限；当X = O时，Y = A，即最低限；而当X =C时，Y = (A+B)/2,即半数有效。因此C的数值即为半数有效浓度(EC50)。4.实验结果我们用HUT-102细胞检测了 CD25-PE38KDEL免疫毒素的杀伤活性，EC50为30ng/ml，如图5所示。实施例4⑶25-PE38KDEL免疫毒素对混合淋巴细胞反应的抑制作用1.检测原理混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)或称混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reaction, MLR)是来源于两个个体的淋巴细胞在体外混合培养时，由 于细胞表面HLA-II类抗原中的D和DP抗原不同，可相互刺激对方淋巴细胞转化(称为双 向MLC)，并产生多种淋巴因子，促进NK、CTL、LAK等杀伤细胞活性。若将刺激的一方淋巴细 胞先用丝裂霉素COiiitomycine C)或放射线照射处理，使该细胞失去增殖能力，但仍保持刺 激对方淋巴细胞增殖能力的试验称为单向MLC ；如不加上述处理，则双方互相刺激，称为双 向MLC。MLC反应可通过3H-TdR掺入率或形态学检测法以及MTT法检测反应细胞的增殖能 力。在淋巴细胞相互刺激转化的过程中，若以CD25免疫毒素杀伤IL-2受体阳性细胞，则能 够抑制MLR。2.材料和试剂2. 1玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置，闪烁液及液闪计数仪。2. 2 3H-TdR 中科院上海原子核研究所产品，比放射活性30Ci/mmol，放射性浓度 lmCi/mL。2. 3其余材料和试剂与体外刺激活化的人外周血单个核细胞竞争结合试验相同3.实验方法3.1分别取三位健康志愿者(A、B及C)肝素抗凝静脉血10mL，用淋巴细胞分层 液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，经无血清的RPMI-1640洗3次，每次 1000r/min 离心 IOmin03. 2用含20% FCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至2. OX 105/mL。3. 3 含 20 % FCS 的 RPMI-1640 完全培养液稀释 CD25-PE38KDEL 至 1000pg/mL，并继 续稀释至浓度分别为100、10及lpg/ml。3. 4三个不同个体的淋巴细胞悬液，每两种(AB、BC及AC)分为一组，检测双向 MLR，于96孔细胞培养板中各孔加入每组两种细胞悬液各50yL，最弱反应对照(min)加入 同一个体的单个核细胞100 μ 1。3. 5将样品的稀释液加入上述96孔细胞培养板，100 μ 1/孔，最强反应对照(max) 孔(分别为含每组两种不同的淋巴细胞的孔)加入含20% FCS的RPMI-1640完全培养液， 100 μ 1/孔，最弱反应对照也加入含20% FCS的RPMI-1640完全培养液，100 μ 1/孔，设置3 个复孔，37°C，5% 0)2温箱培养6d。3. 6终止培养前20h每孔加入0. 5 μ Ci3H-TdR03. 7用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上，用生理盐水充分洗涤，洗去游 离的3H-TdR ；将滤纸片烘干后，用镊子按其顺序分别依次放入盛有闪烁液的塑料管内；β 闪烁仪自动测定样品lmin。4.试验结果试验结果表明，本发明所提供的CD25-PE38KDEL免疫毒素在0. 01ng/ml表现出抑 制作用，有效抑制混合淋巴细胞反应，如图6所示。实施例5 CD25-PE38KDEL免疫毒素对同种异体移植动物模型排斥反应的抑制作
13用l.hu-SPL-SCID 小鼠的建立4-6周龄的SCID小鼠用、射线照射(200rad)后腹腔注射人新鲜脾细胞(108/ 只)，在接种后的数天内小鼠眼眶采血以测定人脾细胞在小鼠PBMCs中的比例。选择人脾细 胞(Spleens)与鼠PBMCs的比例在5% -20%之间的小鼠选使用。这样的人化SCID小鼠命 名为hu-SPL-SCID小鼠。2.皮肤移植实验 将皮肤组织移植到接种了人脾细胞1 Id后的hu-SPL-SCID小鼠的胸腔背侧，每块 皮肤均分别移植到不同的实验组。在进行了皮肤移植后当天给予各实验组动物腹腔注射50 u g/d的CD25-PE38KDEL 或PBS对照(持续5天)。移植实施7d后每天用盲法评价各实验组移植皮肤的存活状态， 连续观察30d，然后每星期观察一次，80d后处死小鼠。移植皮肤的状态可分为0-4级。0 级移植皮片完整柔软有光泽；1级皮片柔软但有小面积的色素沉着；2级皮片柔软但有 大面积的褪色；3级皮片变硬；4级皮片变硬皱缩失去光泽。当移植皮片的状态被评定为 3级以上时判为移植排斥。3. CD25-PE38KDEL 清除 CD25+T 细胞的能力⑶25-PE38KDEL发挥其免疫抑制作用的最重要机制是控制、清除参与排斥反应 的CD25+T细胞，为了考察各人源化抗体在人化SCID小鼠体内的免疫抑制作用，我们按 给小鼠注射⑶25-PE38KDEL，每日眼眶采血，检测外周血中人⑶25+T细胞的数量，检测 CD25-PE38KDEL对CD25+T细胞的清除能力。4.结果表1移植物存活时间
存活时间
受试动物编号-
PBS对照组CD25-PE38KDEL治疗组
#18d37d#210d51dm8d28d#49d80d#5lid63d CD25-PE38KDEL治疗组与PBS对照组分别清除CD25+T细胞的对比结果如图7所
7JN o
1权利要求
免疫毒素CD25 PE38KDEL的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤，(A)将抗CD25抗体的重链可变区和轻链可变区通过连接肽(G4S)3连接起来，构建CD25单链抗体ScFv，然后用连接肽将CD25单链抗体ScFv与PE38KDEL毒素连接，获得新的免疫毒素CD25 PE38KDEL序列；(B)构建表达含有步骤A中所述免疫毒素CD25 PE38KDEL序列的重组质粒，转化大肠杆菌BL21；(C)将步骤B中的大肠杆菌BL21诱导表达、菌体破壁、离心收集，获得免疫毒素CD25 PE38KDEL包涵体；(D)将步骤C中获得的免疫毒素CD25 PE38KDEL包涵体于室温使用8mol/l尿素溶液变性2小时，离心变性液，将收集的离心上清使用滤膜过滤备用；(E)His Ni++金属螯合柱用平衡液平衡，将步骤D中过滤备用的离心上清上样至His Ni++金属螯合柱，上样完备后再用平衡液平衡，然后将平衡液中的尿素含量缓慢降至0mol/l；和(F)使用洗脱液洗脱步骤E中的His Ni++金属螯合柱，将洗脱收集的蛋白再进行分子筛纯化，最终获得免疫毒素CD25 PE38KDEL蛋白。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A中所述CD25单链抗体ScFv具有 重链可变区-接头-轻链可变区的结构，其中所述重链可变区具有SEQID NO :1所示的氨基 酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，步骤A中所述PE38KDEL毒 素具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤D中使用的8mol/l尿素溶液的配 方为 8mol/l 尿素、0. lmol/lNaH2P04、0· 01mol/l Tris, ρΗ8· 0。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤E中使用的平衡液配方为8mol/l 尿素、0. lmol/lNaH2P04、0. 01mol/l Tris、10mmol/l 咪唑，pH 8. 0。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤F中使用的洗脱液包含0.02mol/l PB和0. 5mol/l咪唑溶液。
6.使用如权利要求1-5中任一项所述的制备方法获得的免疫毒素CD25-PE38KDEL。
7.一种预防和/或治疗T细胞介导的疾病的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有 权利要求6所述的免疫毒素⑶25-PE38KDEL以及药学上可接受的载体。
8.权利要求6所述的免疫毒素CD25-PE38KDEL或权利要求7所述的药物组合物在制备 预防和/或治疗T细胞介导的疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，其中所述的T细胞介导疾病为移植排斥反应。
全文摘要
本发明提供了一种分离的多肽，包含抗人单克隆抗体CD25的单链抗体ScFv，以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL。本发明还提供了编码上述多肽的DNA分子、含有该DNA分子的表达载体、宿主细胞和制备方法，并公开了该多肽在制备治疗T细胞介导的疾病的药物中的用途，以及含有该多肽的药物组合物。
文档编号C12N1/15GK101979593SQ20101024500
公开日2011年2月23日 申请日期2007年4月23日 优先权日2006年4月26日
发明者候盛, 寇庚, 李晶, 郭亚军 申请人:上海中信国健药业股份有限公司