专利名称：一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子标记检测技术领域，更具体涉及一种快速定性检测红莲 型细胞质的方法，适用于各种水稻栽培种、农家种和野生稻中水稻红莲型配子体细胞质雄 性不育育性恢复基因的筛选。
背景技术：
植物在漫长的进化过程中通过自然突变或重组在基因组内积累了大量的变异，从 而导致同一种内不同株系或品系的差异。这种差异在遗传水平即表现为彼此间某些DNA片 段的不同。当这种变异与某一特定的基因共分离时，即可作为该基因的特有的分子标签。如 果将这些DNA片段通过体外扩增、电泳、显色，就会形成人们肉眼可见的具有不同大小的带 型。这些不同品系间具有相对差异的带型即我们通常所说的分子标记，它对某一个品种而 言，具有唯一性。利用分子标记进行品种选择或品种鉴定是当前植物生物技术育种的主要 内容。它具有准确、快速、不受季节限制等优点，因而在生产中被广为采用。粮食问题是关系到国计民生的头等大事。水稻是我国最主要的粮食作物，目前，我 国用仅占世界7%的耕地面积解决了占世界22%人口的粮食问题，其根本原因在于杂交水 稻的发明大幅度提高了水稻产量。据估计，到本世纪30年代，我国人口将达到15亿，对粮 食的需求也将持续增长。然而，随着社会的发展，工业、民用及其它用地将不断增长，并且还 由于沙漠化、水土流失的影响，我国的耕地面积将不断减少。因此，如何保持粮食生产的稳 步增长以满足广大人民生活的需求将是一个长期的课题。杂交水稻的利用是建立在水稻的三种细胞质雄性不育的基础之上。它们各自拥有 其相应的恢复基因。目前普遍认为水稻野败型细胞质雄性不育性的恢复是受一对或两对核 主效恢复基因Rf3和Rf4控制。而红莲则分别受一对主效恢复基因Rf5或Rf6)控制；包台 型的育性恢复受另一对主效恢复基因Rfl所控制。此外分别还有数量不等的隐性微效恢复 基因。关于恢复基因的定位已有多篇文献报道，Yao等(1997)认为明恢63的两对野败 恢复基因Rf3和Rf4分别位于第1和第10染色体，其中Rf3位于RG532上方6. OcM处，Rf4 位于G4003近端粒端3. 3cM处。何光华等(2002)利用SSR分子标记也将明恢63的两对野 败恢复基因Rf3和Rf4分别定位于第1和第10染色体，其中Rf3距RM11. 9cM, Rf4位于第 RM258和RM304之间，分别相距2. 9和OcM。推测野败型、红莲型、BT型3种不育胞质恢复 基因在第10染色体上形成基因族，为同一家族基因成员。自80年代以来，已有不少作者证明BT型雄性不育由强弱不同相对独立的恢复基 因控制，并发现Rfl座位上至少有4个复等位基因。滕利生和申宗坦(1996)进一步分析恢 复BT型和WA型不育系的恢复基因的关系认为，Rfl、Rf2、Rf3和Rf4互相之间是不等位的。 而且同一个恢复基因不能同时恢复BT型和WA型雄性不育性，只有经过重组，将Rfl与Rf3 结合在同一个恢复系之中才能使其各自恢复相应的胞质不育系，强弱恢复基因没有加性效 应，各恢复基因独立遗传，彼此间无明显的互作效应。
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红莲型CMS水稻的育性同样受一对恢复基因Rf5或者Rf6控制，不同恢复系中恢 复基因的位点并不相同。黄青阳等(2000)比较分析野败和红莲的育性遗传发现红莲型CMS 水稻的不育基因和野败不育基因的位点是不等位的，它们彼此间的恢保关系并不相同；野 败的保持系珍汕97B是红莲的恢复系，和密阳23之间的恢复基因是不等位的。并将红莲恢 复基因定位在第10染色体长臂，距SSR标记RM258约7. ScM(黄青阳等，1999)；而刘学群等 (2004)又进一步对红莲恢复系密阳23和9311的恢复基因基因进行了遗传分析和定位，证 明9311中含有两个恢复基因，分别命名为Rf5和Rf6，二者非等位。其中Rf5恢复基因定位 于分子标记HLOl和RM5456之间，分别相距0. 63和1. 57cM。而Rf6介于RM5373和SBD07 之间，分别相距0.4cM。而李绍清(2005)和谭艳平(2008)的研究发现，在野生稻和农家种 中存在多个红莲恢复位点，其中至少3个得到了遗传证明。这些研究表明，在水稻中红莲型 细胞质雄性不育具有多个独立的恢复位点，发掘这些恢复位点对红莲型杂交稻的可持续发 展具有重要价值。而恢复基因Rf5、Rf6的精密定位为发掘筛选这些潜在的新型恢复基因奠 定了基石出。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方 法，该方法将传统的遗传分析和分子遗传标记技术结合起来，有目的地发掘利用新的遗传 基因资源，精确地选择新型恢复系，拓宽恢复谱，提高优良恢复基因的聚合选择效率，促进 杂交水稻的结实率和产量，有利于其可持续发展。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法，其步骤是1、共分离分子标记的PCR引物设计引物设计基于红莲型水稻细胞质恢复基因Rf5和Rf6共分离的分子标记，序列如 下引物Pl(Rf5，53°C )PlF :5’ -ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’PlR :5，-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3，引物 P2(Rf6，56°C )P2F 5 ’ -GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’P2R 5' -ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’ ；2、PCR扩增体系的建立标准的PCR扩增反应体系共15 μ 1，组成如下50ng/ μ 1的总DNA 1 μ 1， IOXPCRbuffer (ρΗ8. 3) 1. 5 μ 1, 25mM MgCl2O. 6 μ 1，25 μ m dNTP 0. 6μ l,lU/y 1 Taq 酶 0. 6μ 1，5ρΜ 的引物 F 1μ 1，5ρΜ 的引物 R 1μ 1，去离子 ddH20 8. 7 μ 1。反应混合物用矿物油(Sigma)覆盖，PCR反应程序如下lcycle -MV 5min30cycle :94°C lmin，53 或 56°C lmin，72°C Iminlcycle :72°C 5min3、扩增DNA片段检测 选恢复位点
(1)以含红莲恢复基因Rf5的密阳23 (韩国)和含Rf6的9311 (江苏省下里河农 科所)作对照，以与这些恢复基因共分离的分子标记对所有待检测水稻品种进行PCR扩增， 扩增产物在3. 5% (w/v)的琼脂糖胶上电泳。(2)将检测品种扩增的带型分别与密阳23中Rf5、9311中Rf6共分离的分子标 记带型进行比较如果某一个水稻品种分子标记的带型与红莲型恢复基因Rf5(密阳23)、 Rf6(9311)带型不同，那么就确定该品种可能携带与已知的红莲Rf5、Rf6不等位的新型候
选恢复基因。4、遗传分析确证新型恢复基因a、将选择筛选的含差异标记的候选恢复系与红莲不育系粤泰A(广东省农科院水 稻所)测交，套袋确定育性。如果测交组合可育，说明该候选恢复系可能含新型恢复基因 R，。b、进一步将该候选新型恢复基因恢复系R，与Rf5亲本密阳23和Rf6亲本9311 杂交，配制杂种F1，即=Rf5 :R，/密阳23 ；Rf6 :R，/9311。c、然后以红莲不育系粤泰A作母本与相应的每个杂种Fl测交，将测交组合种植 150株以上的群体，观察育性分离。如果两个群体中都出现不育株，说明候选恢复系中所含 的恢复基因与Rf5和Rf6不等位，属于新的恢复基因R’。本发明的优点本发明与普通遗传筛选方法相比具有以下优点和效果(1)方法快速、准确、操作方便PCR反应不需要特别的技术培训，经过短暂培训的 实验员均可独立操作。(2)具有高通量和可预测性，大幅度提高育种效率传统的杂交方法无法预测杂 交的结果，而通过分子检测PCR板一次反应可以检测96个材料，不需要通过大规模的测恢 则可确定具有不同的恢复基因位点，可以事先对材料进行选择，大幅度提高筛选效率。表1本发明对普通遗传筛选方法的优势比较 (3)可以拓宽恢复系育种材料的选择范围，增加遗传多样性传统选育恢复系的 方法一般是利用现有的恢复系进行杂交转育，这样导致恢复基因类型完全相同。而利用该 方法可以在野生稻和栽培稻中筛选到更多新的红莲型恢复基因。
图IA为一种利用红莲恢复基因共分离分子标记进行PCR扩增筛选示意 图.Marker，DNA分子量标记DL2000，Rf5共分离标记Pl的PCR扩增。图IB为一种利用红莲恢复基因共分离分子标记进行PCR扩增筛选示意 图.Marker, DNA分子量标记DL2000，Rf6共分离标记P2的PCR扩增。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常 按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)； D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制 造厂商所建议的条件。具体步骤如下一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法，其步骤是1、PCR引物设计引物设计基于水稻红莲型细胞质恢复基因Rf5和Rf6共分离的分子标记，序列如 下引物Pl(Rf5，53°C )PlF :5’ -ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’PlR :5，-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3，引物 P2(Rf6，56°C )P2F 5' -GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3，P2R 5' -ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’2、红莲恢复基因共分离分子标记的PCR扩增标准的PCR扩增反应体系共15 μ 1，组成如下50ng/ μ 1的总DNA 1 μ 1， IOX PCRbuffer (ρΗ8. 3) 1. 5 μ 1, 25mM MgCl2O. 6 μ 1，25 μ m dNTP 0. 6μ 1, lU/μ 1 Taq 酶 0. 6μ 1，5ρΜ 的引物 F 1μ 1，5ρΜ 的引物 R 1μ 1，去离子 ddH20 8. 7 μ 1。反应混合物用矿物油(Sigma)覆盖，PCR反应程序如下lcycle -MV 5min30cycle :94°C Imin ；53°C或 56°C Imin ；72°C Iminlcycle :72°C 5minstore -AV ；3、扩增DNA片段检测候选恢复位点(1)以含红莲恢复基因Rf5的密阳23和含Rf6的9311作对照，以这些恢复基因共 分离的分子标记对所有待检测水稻品种进行PCR扩增，扩增产物在3. 5% (w/v)的琼脂糖胶 上电泳。(2)将检测品种扩增的带型分别与密阳23中Rf5、9311中Rf6共分离的分子标 记带型进行比较如果某一个水稻品种分子标记的带型与红莲型恢复基因Rf5(密阳23)、 Rf6(9311)带型不同，那么就确定该水稻品种所含恢复基因与已知的红莲Rf5、Rf6不等位， 可能是一个新的候选恢复基因R’。本实验中我们对121个水稻品种进行了筛选，共发现8个水稻生态型具有和Rf5、Rf6不一致的扩增带型(如图1)，表明这些水稻可能携带不同于 Rf5和Rf6的恢复基因。4、等位性分析验证新的恢复基因位点为了进一步确证分子标记筛选的可靠性，我们对这些筛选的分子标记差异水稻品 种进行测恢和遗传分析。如果某一个水稻品种对红莲不育系具有恢复作用，同时，其恢复 基因与红莲的Rf5和Rf6恢复基因不等位，那么就确定该水稻品种含有一个不同于已知的 Rf5> Rf6的新恢复基因。(1)将选择筛选的含差异标记的候选恢复系与红莲不育系粤泰A测交，套袋确定 育性。如果测交组合可育，说明该候选恢复系可能含新型恢复基因R’。申请人对图一中筛 选出的携带差异分子标记的8个水稻品系进行了测恢分析，如表2中所示，除w9没有恢复 性外，其他7个材料对红莲全部高度恢复，说明分子标记筛选具有较好的可靠性。表2筛选的水稻品种与红莲粤泰A测恢测交杂种Fl的育性(％ )
恢复(2)为确定这些恢复系中的恢复基因位点与Rf5、Rf6的遗传关系，进一步将该候 选新型恢复基因恢复系鄂早1 (湖北黄冈农科所)、w3、w4、w5、wl9、w20、w26(国际水稻所 IRRI)分别与Rf5亲本密阳23和Rf6亲本9311杂交，配制杂种FlJP :R，/密阳23、R，/9311。(3)然后以红莲不育系粤泰A作母本与相应的每个杂种Fl测交，将测交组合种植 150株以上的群体，观察育性分离。表3中共列表分析了 16个Fl对粤泰A测交群体的育性 分析结果。观察表明鄂早l、w5和w20所携带的恢复基因均与Rf5和Rf6不等位，属于新的 恢复基因R’。表3栽培稻中红莲型恢复基因的等位性分析
权利要求
一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法，它包括下列步骤A、共分离分子标记的PCR引物设计设计红莲型细胞质水稻恢复基因Rf5和Rf6共分离的分子标记引物，序列如下引物P1Rf5，53℃P1F5’ ATGACAAATCTGCTCCGATG 3’P1R5’ CTTACTTAGGAAAGACTAC 3’引物P2Rf6，56℃P2F5’ GGAGATGCTATAGCAGCAGTG 3’P2R5’ ATTGCTCCTTACCACCTTGC 3’；B、PCR扩增反应体系的建立标准的PCR扩增反应体系共15μl，组成如下50ng/μl的总DNA 1μl，10×PCRbuffer1.5μl，25mM MgCl2 0.6μl，25μm dNTP 0.6μl，1U/μl Taq酶0.6μl，5pM的引物F 1μl，5pM的引物R 1μl，去离子ddH2O 8.7μl反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下1cycle94℃ 5min30cycle94℃ 1min；53或56℃1min；72℃ 1min1cycle72℃ 5minstore4℃；C、扩增DNA片段检测候选恢复位点(a)、以含红莲恢复基因Rf5的密阳23和含Rf6的9311作对照，与恢复基因共分离的分子标记对所有检测水稻品种进行PCR扩增，扩增产物在3.5％(w/v)的琼脂糖胶上电泳；(b)、将检测品种扩增的带型分别与密阳23中Rf5、9311中Rf6共分离的分子标记带型进行比较水稻品种分子标记的带型与红莲型恢复基因Rf5、Rf6带型不同，确定该品种携带与已知的红莲Rf5、Rf6不等位的新型候选恢复基因；D、遗传分析确证新型恢复基因(1)将选择筛选的含差异标记的候选恢复系与红莲不育系粤泰A测交，套袋确定育性，测交组合，该候选恢复系含新型恢复基因R’；(2)将该候选新型恢复基因恢复系R’与Rf5亲本密阳23和Rf6亲本9311杂交，配制杂种F1，即Rf5R’/密阳23；Rf6R’/9311；(3)以红莲不育系粤泰A作母本与相应的每个杂种F1测交，将测交组合种植150株的群体，观察育性分离，两个群体中都出现不育株，候选恢复系中所含的恢复基因与Rf5和Rf6不等位，属于新的恢复基因R’。
全文摘要
本发明公开了一种筛选红莲型细胞质雄性不育水稻新型恢复基因的方法，它包括下列步骤首先是恢复基因共分离分子标记的引物设计与标准PCR扩增体系的建立；其次是分子标记扩增带型的比较分析，筛选具有差异分子标记的水稻品种或生态型；再次是利用遗传分析验证新的恢复基因位点，确定新型恢复基因。该方法将传统的遗传分析和分子遗传标记技术结合起来，有目的地发掘利用新的遗传基因资源。具有操作简便，快速准确，精确地选择新型恢复系的特点。有利于拓宽恢复谱，提高优良恢复基因的聚合选择效率，促进杂交水稻的结实率和产量及其可持续发展。
文档编号C12Q1/68GK101899522SQ201010245020
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者李绍清, 谢红卫, 谭艳平 申请人:武汉大学