专利名称：牛早期胎儿性别发育相关基因、编码蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种牛早期胎儿性别发育相关基因、编码 蛋白及其制备方法。
背景技术：
对两性生物而言，性别决定和性别分化决定着雌性和雄性两种性别的存在，是个 体正常发育和生存不可缺少的一环，也是种族得以繁衍延续的基础。1990年，Sinclair等克隆到人“Y染色体上的性别决定区域(SRY) ”。Koopman等 将含有SRY基因的DNA片段(14kb)移植给XX鼠体内，小鼠发育为雄性，这一实验结果揭示 了动物性别控制的根本途径。但是，性别决定是一个错综复杂的过程，性别决定与分化是一 个以SRY基因为主导的、多基因参与的、有序协调的表达过程，性反转可因该多基因调控串 上某基因的改变而引发。在性别基因的调控网络中，紧跟SRY表达的是S0X9 (sry-relatedHMG-box gene 9 基因的表达，研究发现S0X9转基因XX雌性鼠可产生睾丸，并具有正常的Sertoli细胞及 Leydig细胞，这提示S0X9可代替SRY基因的功能，或者SRY的作用仅是提高S0X9的表达量。 S0X9是SRY仅有的直接调节目标基因，在SRY表达后被激活，出现雄性特异上调；当S0X9 继续表达时，SRY表达关闭，表明SRY直接作用于S0X9，S0X9是SRY下游重要的性别决定基 因。S0X9 在下游与 WT1 (wilm，stumor-associated gene)、SF1 协同作用激活 AMH 的表达， 进而抑制缪勒氏管发育。S0X9基因还是软骨发育中最关键的转录激活因子，显著表达于胚胎间叶细胞、软 骨原基和软骨细胞等。软骨基质蛋白II型胶原的Col2al为其靶基因，故S0X9活性下降或 失活将抑制II型胶原基质蛋白，从而导致躯干发育异常综合症(Campomelic dysplasia, CD)，其特征为先天驼背、长骨弯曲、肩胛骨发育不全、盆骨不成形，不能形成软骨。哺乳动物以基因为基础的性别决定系统保证了雌雄两性后代各占50%的性比平 衡。在家畜的生产过程中，这个性别比例往往并不总是生产所需要的，奶牛雌雄后代的价值 差别在十倍以上；而对于肉用动物的养殖，饲养者更希望获得更多的雄性后代。通过对性别 决定基因的调控来人为选择动物后代的性别，尤其是农业用家畜，将产生巨大的经济效益。当前，我国奶牛良种不足、低产个体数量特别多，因此，采取一定的性别控制手段， 迅速增加基础群中高产母奶牛头数，在育种群中增加优秀种公牛的雄性后代，则可从根本 上提高我国奶业的发展水平。但是目前尚没有性别控制手段在农业上成功应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛早期胎儿性别发育相关基因S0X9基因，其核苷酸序 列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，所述基因的开放读码框如SEQ ID NO. 2所示，通过该基因 可以成功进行牛后代的性别控制。本发明还提供所述基因的制备方法，包含以下步骤从牛早期胎儿生殖嵴中提取总RNA，根据保守区序列设计引物用RT-PCR法扩增cDNA，设计5' RACE引物和3' RACE引 物，结合RACE和巢式PCR技术，克隆测序得到牛早期胎儿性别发育相关基因S0X9。本发明还提供所述基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明所述制备方法具体是通过以下技术方案来实现的1.总RNA的提取解剖牛胎儿取出尚未分化的生殖嵴，提取总RNA。2. cDNA 的合成使用 TaKaRa 3' -Full RACE Core SetVer. 2. 0 (Code No. D314) 合成cDNA，同时设立M-MLV(-)对照。3.引物设计与引物合成从GenBank中下载近源物种(人、大鼠、小鼠等)的S0X9 基因CDS序列，利用Clustal软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计引物 XF4、XR4，扩增片段大小为529bp，引物由大连宝生物公司合成。引物序列为XF4 :AATCTCCTGGACCCCTTCAT (如 SEQ ID NO. 4 所示)XR4 :CGGCGCGGCTGGTACTTGTAG (如 SEQ ID NO. 5 所示)4. S0X9基因CDNA全序列的克隆以上述合成的第一链⑶NA作为模板，用XF4、XR4进行PCR扩增，所扩增的PCR产 物用3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。利用XF4、XR4对目的 产物进行测序。根据已得到的CDNA片段序列设计特异性引物，利用CDNA末端快速扩增技术 (rapid-amplification of cDNA ends, RACE)对目的基因的 3'和 5'末端进行 PCR 扩增。在5' RACE 中，利用 TaKaRa-Full RACE Kit (Code No. D315)对总 RNA3 ii g 进行 CIAP、TAP处理，并与5' RACE Adaptor连接后反转录合成cDNA，同时设立M_MLV(_)对照。使用TaKaRa 5' -Full RACE Kit (Code No. D315)以加尾后的 cDNA 为模板，利用 XR4作为外侧特异性引物和5' RACE Outer Primer进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再 用R692作为内侧特异性引物和5' RACE Inner Primer进行第二次PCR扩增。5' RACE Outer Pr imer :CATGGCTACATGCTGACAGCCTA(如 SEQ IDN0. 6 所示)5' RACE Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG(如SEQ ID NO. 7 所示)R692 CGCTTGACGTGCGGCTTGTTC (如 SEQ ID NO. 8 所示)R619 :CCTTGAGCACCTGGCTGACGG (如 SEQ ID NO. 9 所示)将PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳(约0. 75Kbp)，R619对PCR产物直接测序， 得到5'端序列。在3' RACE 中，使用 TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (CodeNo. D314) 合成cDNA，同时设立M-MLV(-)对照。使用TaKaRa LATaq (Code No. DRR002A)以 3' RACE 合成的 cDNA 为模板利用 F625作为外侧特异性引物和3' RACE Outer Primer进行第一次PCR扩增，所得PCR产物 再用F669作为内侧特异性引物和3' RACE Inner Primer进行第二次PCR扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用 TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver. 2.0 (Code No. DV805A)切胶回收 3' RACE 产物，使用 CTD027F669 对 PCR 产物直接 测序，得到3'端序列，发现未出现3' UTR，分析可能是CDS序列中有poly A+造成，又根据同源序列和测序得到3'端序列进行同源扩增。F625 :GCTCAAGGGCTACGACTGGACGC (如 SEQ ID NO. 10 所示)F669 CAAGAACAAGCCGCACGTCAAGC (如 SEQ ID NO. 11 所示)根据同源序列NM_000346/NM_213843/XM_001498424和测序得到3'端序列设计 引物 F955、F1048、R1958、R1792。使用TaKaRa 3 ‘ -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code No. D314)禾口 TaKaRaPrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit (Code No. R023A)合成 cDNA，同时 设立M-MLV(-)对照。使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)以上一步得到的cDNA为模板利用 F955、R1958引物进行Outer PCR扩增。所得产物再用F1048、R1792引物进行inner PCR 扩增所得产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver. 2.0 (Code No. DV805A)切胶回收上述产物(约 0. 7Kbp)，使用 CTD027F1048/R1792 对PCR产物直接测序，得到5'端部分序列，但由于序列中部因GC含量高有套峰，所以需要 进行克隆测序。使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (Code No. D6022)中的连接酶，将回收片 段与 PMD20-T Vector (Code No. D107)连接后，热转化至 E. coli Competent Cells JM109 中，涂布平板，37°C过夜培养。挑选阳性菌落植菌，挑两个菌落提取质粒使用F1048/R1792 对这两个质粒测序，将序列测通。F955 GCACATCTCGCCCAACGCCATCTTCA (如 SEQ ID NO. 12 所示)F1048 CTCGGGGCAATCCCAGGGTC (如 SEQ ID NO. 13 所示)R1958 GGTGGGTTACGGTCTTTCTTCGGTGG (如 SEQ ID NO. 14 所示)R1792 :GTAGTAGGAGCCGGAGTTCTGGT (如 SEQ ID NO. 15 所示)在前述得到的所有序列上设计3' RACE用引物。F1458 :AGCGAACGCACATCAAGACGGAGCAG (如 SEQ ID NO. 16 所示)F1515 AGCACTCGCCGCAGCAGATCGCCTAC (如 SEQ ID NO. 17 所示)使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，以3'端同源序列扩增时的cDNA为模 板，F1458作为外侧特异性引物和3' RACE OuterPrimer进行第一次PCR扩增，所得PCR产 物再用F1515作为内侧特异性引物和3' RACE Inner Primer进行第二次PCR扩增。所得产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurif ication Kit Ver. 2. 0 (Code No. DV805A)切胶回收上述3' RACE产物，使用F1515对PCR产物直接 测序，得到5'端部分序列，但序列后半部分有套峰，需要进行克隆测序。使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (Code No. D6022)中的连接酶，将上步 PCR 产物与 pMD20-T Vector (Code No. D107)连接后，热转化至 E. coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37°C过夜培养。挑选阳性菌落植菌，挑两个菌落提取质粒使用BcaBEST PrimerM13-47/RV-M对质粒测序，将序列测通。5 验证5' RACE序列验证(1)引物设计和合成F146 TCTCCAATTCGCCTTCCCCTACT (如 SEQ ID NO. 18 所示)
(2)PCR 扩增使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，F146/R692 为引物，进行 PCR 扩增，反 应体系条件与已知序列验证相同。取5ul进行琼脂糖凝胶电泳。(3)结果PCR验证得到的5' RACE序列是根据已知序列得到的。3' RACE序列验证(1)引物设计和合成根据前述得到的3'端所有序列，设计验证引物。F200 CGCCTTCCTAAACCCTCGCTCCT (如 SEQ ID NO. 19 所示)R1873 GGCTGTGGGTCTGGGGGATGGAG (如 SEQ ID NO. 20 所示)F862 CAAGAAGGACCACCCGGACTACAA (如 SEQ ID NO. 21 所示)R1789 TGAAGGTGGAGTAGAGGCCGGAG (如 SEQ ID NO. 22 所示)(2) PCR 扩增使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，F200/R1873 为 IstPCR 引物，F862/ R1789为2nd PCR引物，进行PCR扩增，反应体系条件与3‘端同源序列扩增相同。取5ul 进行琼脂糖凝胶电泳。(3)结果经PCR验证，得到的3' RACE序列是根据已知序列得到的。经验证，得 到367bp的5'端未知序列，约1911 bp的3'端未知序列。6.对牛S0X9基因的测定将所有测序得到序列利用ClustalW软件进行拼接，拼接结果见SEQ ID NO. 1。将 拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为牛S0X9基因序列。将克隆测序获得的 S0X9 基因 cDNA 序列输入 NCBI 的 OCR Finder (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)程序，并通过比较基因组学的方法参考人和小鼠已经定位的基因的⑶S序列，寻找 0RF，结果见SEQ ID NO. 2，将得到的0RF用BLAST软件进行同源性测定。将得到的0RF序 列输入GENSCAN(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)进行氨基酸序列预测分析，结果 见SEQ ID NO. 3，将牛S0X9基因与其他脊椎动物进行同源性比较，结果表明该基因在外显 子组成、长度和位置上与小鼠、人和大鼠高度保守。比对结果分析表明，牛S0X9基因的阅 读框与人、类人猿、大鼠和小鼠S0X9基因的开放阅读框序列同源性都达到90%以上。利 用 Specialized BLAST 进行保守区预测(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi)，分析结果可知牛S0X9蛋白的前半部分(21-95AA)与sox-N超家族有很高的相 似性，得分85. 73，后半部分(104-174AA)与HMG-B0X超家族有很高的相似性，得分98. 40。 HMG-B0X超家族的成员包括SRY及其同源蛋白，是蛋白样转录因子，可与特定的DNA序列结 合，发挥作用。这也进一步确定了我们克隆到的基因确实为牛S0X9基因。通过RNAi技术研究本发明所述S0X9基因功能，构建其干扰载体pS0X9_EGFP，通 过尾静脉注射转染怀孕9. 5dpc的母鼠，以注射生理盐组和对照质粒pControl-EGFP为对照 组。采用半定量PCR检测其中Sox9RNA的表达量，胎鼠中S0X9基因的表达量都降低到对照 组的15%左右，干扰效果较好，表明对Sox9基因的干扰达到预期的效果。分析子鼠性别比例变化发现，15只注射pS0X9-EGFP的母鼠中胎儿的中雄性比例 为6/21、15只注射pControl-EGFP的母鼠中胎儿的雄性比例为32/61、6只注射生理盐水的 母鼠中胎儿的雄性比例为30/56，可见后两组中雄性比例相近，约等于50%，二者远大于第一组中雄性比例(28. 6%).以上结果说明，由于PS0X9-EGFP干扰载体干扰了 S0X9基因的 表达，其后代雌性比例远远高于雄性。因此该基因可以用于进行牛后代的性别控制，在畜牧 业极具应用价值。
图1为牛早期胎儿生殖嵴Total RNA 琼脂糖凝胶电泳图；M :DL2000DNA Marker ；1 牛牛早期胎儿生殖嵴 Total RNA ；图2为cDNA扩增产物3 %琼脂糖凝胶电泳图M :DL2000DNA Marker ；1 :PCR 产物；2 :M-MLV (-)对照 PCR 产物；图3为5 ‘ RACE PCR产物3 %琼脂糖凝胶电泳图；M :DL2000DNA Marker ；1 5' RACE PCR 产物；2 :M-MLV(-)对照 PCR 产物；图4为3 ‘ RACE PCR产物1 %琼脂糖凝胶电泳图；M 入-HindiII DNA Marker ；1 3' RACE PCR 产物；2 :M-MLV(-)对照 PCR 产物。图5为PCR产物3 %琼脂糖凝胶电泳图；M :DNA Marker DL2000 ；1 :PCR 产物；2 :M-MLV (-)对照 PCR 产物；图6为3 ‘ RACE PCR产物3 %琼脂糖凝胶电泳图；M :DNA Marker DL2000 ；1 3' RACE PCR 产物；2 :M-MLV(-)对照 PCR 产物；图7为PCR产物1 %琼脂糖凝胶电泳图；M :DNA Marker DL2000 ；1 :PCR 产物；2 :M-MLV (-)对照 PCR 产物；图8为PCR产物1 %琼脂糖凝胶电泳图；M :DNA Ma rker DL2000 ；1 :PCR 产物；2 :M-MLV (-)对照 PCR 产物；图9为s i RNA表达载体对雌性胎鼠S0X9基因抑制效果；M :DNA Marker ；CK 注射生理盐水对照组；Cc 注射pControl-EGFP质粒对照；pA、 pB、pC为注射pS0X9-EGFP的雌性胎鼠。图10为siRNA表达载体对雄性胎鼠S0X9基因抑制效果；M :DNA Marker ；CK 注射生理盐水对照组；Cc 注射pControl-EGFP质粒对照；pi、 p2、p3、p4、p5、p6、p7 为注射 pS0X9-EGFP 雄性胎鼠。
具体实施例方式本发明公开了一种牛早期胎儿性别发育相关基因S0X9及其编码蛋白，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围 内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面 结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1 牛早期胎儿生殖嵴Total RNA提取使用TaKaRa RNAiso Reagent (Code No. D312)提取牛早期胎儿生殖嵴的 Total RNA,并用 DNase I (RNase Free) (Code No. D2215)进行 DNase I 处理，最终溶于 DEPC 处理 水。取lul进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，其中M :DL2000DNA Marker ；1 牛牛早期
7胎儿生殖嵴Total RNA(DNase I处理)。
实施例2 已知序列验证1.引物设计和合成 2.反转录使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ve r. 2. 0 (Code No. D314)合成 cDNA，同 时设立M-MLV(-)对照。反应体系 反应条件70°C，lOmin后立即冰上放置2分钟然后加入下列组分 反应条件:30°c,lOmin ；42°C，60min ；70°C, 15min3. PCR 扩增使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，进行 PCR 扩增。反应体系
72 0C
IOmin
Icycle
取5ul进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，其中M:DL2000DNA Marker ； 1 PCR产物；2 =M-MLV (-)对照PCR产物。4. PCR产物纯化使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (CodeNo. DV805A)切 胶回收目的产物，命名为CTD026-C。
5.测序分析
使用CTD026XF4/XR4对CTD026-C测序，测序结果与已知序列-实施例3:5'端序列获取 (一)5 ‘ RACE 1.引物设计和合成
根据上述得到的序列设计5' RACE用引物。
-致，继续进行RACEc 2.5' RACE前处理及反转录使用TaKaRa 5' -Full RACE Kit (Code No. D315)对牛早期胎儿生殖嵴 Total RNA 3ug进行CIAP、TAP处理，并与5' RACE Adaptor连接后，反转录合成cDNA，同时设立 M-MLV (-)对照。反应体系 反应条件94 "C3minIcycle 72 °CIOminIcycle取5ul进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，其中M:DL2000DNA Marker ；1 5 ‘ RACE PCR 产物；2 =M-MLV (-)对照 PCR 产物。4. PCR产物纯化使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (CodeNo. DV805A)切 胶回收上述1的5' RACE产物(约0. 75Kbp)，命名为CTD026-5P。5.测序分析PCR产物直接测序使用CTD026R619对CTD026-5P测序，得到5 ‘端序列。实施例4:3'端序列获取(一)3' RACE1.引物设计和合成
名称序列序列CTD027F625 5’ -GCTCAAGGGCTACGACTGGACGC-3，23mersCTD027F669 5’ -CAAGAACAAGCCGCACGTCAAGC-3'23mers2.反转录使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code No. D314)合成 cDNA，同时 设立M-MLV (-)对照。反应体系 反应条件70°C，IOmin立即冰上放置2分钟然后加入下列组分 反应条件42°C，60min70°C，15min3. PCR 扩增使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，进行 PCR 扩增。Outer PCR 反应体系
反应条件 94 0C 3min
Icycle
94 °C 30sec 60 °C 3 Osec
72 °C 4min
72 °CIOmin
Inner PCR反应体系
3 Ocycles
Icycle
反应条件94 "C3minIcycle 72 °CIOminIcycle取5ul进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，其中Μ: λ-HindIII DNA Marker ；1 3' RACE PCR 产物；2 =M-MLV(-)对照 PCR 产物。4. PCR产物纯化使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (CodeNo. DV805A)切 胶回收上述1的3' RACE产物，命名为CTD027-3P2。5.测序分析使用CTD027F669对PCR产物CTD027-3P2直接测序，得到3'端序列，发现未出现 3' UTR，分析可能是CDS序列中有poly A+造成，拟根据同源序列和CTD027-3P2序列进行 同源扩增。(二)3'端同源序列扩增1.引物设计和合成根据同源序列NM_000346/NM_213843/XM_001498424 和 CTD027-3P2 序列设计引物。
CTD027R1958 5，-GGTGGGTTACGGTCTTTCTTCGGTGG-3，26mersCTD027R1792 5’ -GTAGTAGGAGCCGGAGTTCTGGT-3’23mers2.反转录使用TaKaRa 3 ‘ -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code No. D314)禾口 TaKaRaPr imeScript II High Fidelity RT-PCR Kit (Code No. RO23A)合成 cDNA，同时 设立M-MLV (-)对照。反应体系
Total RNA (1 ug/ul)1ul3，RACE Adaptor (5 uM)1ul
dNTP Mixture (10 mM each)1ulRNase Free dH207ul
反应条件65°C，5min立即冰上放置2分钟
然后加入下列组分5 χ PrimeScript II Buffer4ul
PrimeScript II RT Enzyme Mix1ulRNase Free dH205ul
Total20ul
反应条件:42°C,60min ；70°C，15min 3. PCR扩增
使用 TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，进行 PCR 扩增, Outer PCR反应体系
上述2的反转录反应液
4 ul
1X cDNA Dilution Buffer II6 ul CTD027 F955 Primer (10 uM)2 ul CTD027 R1958 Primer (10 uM)2 ul
2χ GC Buffer II25 ul TaKaRa LA Taq (5 U/ul )0. 5 ul dH2010. 5 ul
Total
反应条件
50ul
14
94 "C3minIcycle 72 °CIOminIcycle 反应条件94 "C3minIcycle 72 °CIOminIcycle5ul进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，其中M =DNA MarkerDL2000 ；1 PCR产物；2 =M-MLV (-)对照PCR产物。4. PCR产物纯化使用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (CodeNo. DV805A)切 胶回收上述1的产物(约0. 7Kbp)，命名为CTD027-T4。5.测序分析①PCR产物直接测序使用CTD027F1048/R1792对CTD027-T4测序，得到5'端部分序列，但序列中部因 GC含量高有套峰，所以需要进行克隆测序。②克隆测序使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (Code No. D6022)中的连接酶，将 CTD027-T4 与 pMD20-T Vector (Code No. D107)连接后，热转化至 Ε. coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37°C过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为CTD027-T4-5和CTD027-T4-6。使用CTD027F1048/R1792 对 CTD027-T4-5 和 CTD027-T4-6 质粒测序，将序列测通。(三)再次 3' RACE1.引物设计和合成在前述得到的所有序列上设计3' RACE用引物。
名称序列序列CTD027F1458 5 ’ -AGCGAACGCACATCAAGACGGAGCAG-3’26mersCTD027F1515 5’ -AGCACTCGCCGCAGCAGATCGCCTAC-3’26mers2. PCR 扩增使用TaKaRa LATaq (Code No. DRR002A)，以3'端同源序列扩增时的cDNA为模 板，CTD027F1458/3' RACE Outer Primer 为 OuterPCR 引物，CTD027F1515/3‘ RACE Inner Primer为Inner PCR引物，进行PCR扩增，反应体系及条件同前述3 ‘ RACE。取5ul进行 3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，其中M:DNA Marker DL2000 ；1 3' RACE PCR产物； 2 =M-MLV (-)对照 PCR 产物。3. PCR产物纯化使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (CodeNo. DV805A)切 胶回收上述1的3' RACE产物，命名为CTD027-3P5。4.测序分析①PCR产物直接测序使用CTD027F1515对CTD027-3P5测序，得到5'端部分序列，但序列后半部分有套 峰，所以需要进行克隆测序。②克隆测序使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (Code No. D6022)中的连接酶，将 CTD027-3P5 与pMD20-T Vector (Code No. D107)连接后，热转化至Ε. coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37°C过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为CTD027-3P5-1 和 CTD027-3P5-2。使用 BcaBEST Primer M13-47/RV-M 对 CTD027-3P5-1 和 CTD027-3P5-2。 质粒测序，将序列测通。实施例5 序列验证(一)5 ‘ RACE 序列验证1.引物设计和合成
名称序列序列CTD026F146 5' -TCTCCAATTCGCCTTCCCCTACT-3‘23mers 2. PCR 扩增
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使用TaKaRa LATaq (Code No. DRR002A), CTD026F146/R692 为引物，进行 PCR扩 增，反应体系条件与已知序列验证相同。取5ul进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示， 其中M :DNA Marker DL2000 ；1 :PCR 产物；2 =M-MLV (-)对照 PCR 产物。3.结果经PCR验证，得到的5' RACE序列是根据已知序列得到。(二)3 ‘ RACE 序列验证1.引物设计和合成根据前述得到的3'端所有序列，设计验证引物。 2. PCR 扩增使用TaKaRa LA Taq (Code No. DRR002A)，CTD027F200/R1873 为 1st PCR 引物， CTD027F862/R1789为2nd PCR引物，进行PCR扩增，反应体系条件与3 ‘端同源序列扩增相 同。取5ul进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，其中M =DNA Marker DL2000 ；1 =PCR 产物；2 =M-MLV (-)对照PCR产物。3.结果经PCR验证，得到的3' RACE序列是根据已知序列得到的。经验证，得到367bp的5'端未知序列，约191 Ibp的3'端未知序列。实施例6 对牛S0X9基因的测定和分析将所有测序得到序列利用ClustalW软件进行拼接，拼接结果见SEQ IDN0. 1。将拼 接结果用BLAST软件进行同源性测定，确定为牛S0X9基因序列。将克隆测序获得的S0X9基因cDNA序列输入NCBI的OCR Finder (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)程序，并通过比较基因组学的方法参考人和小鼠已经 定位的基因的⑶S序列，寻找0RF，结果见SEQ ID N0. 2，将得到的ORF用BLAST软件进行同 源性测定，比对结果分析表明，牛S0X9基因的阅读框与人、类人猿、大鼠和小鼠S0X9基因的 开放阅读框序列同源性都达到90%以上。将得到的ORF序列输入GENSCAN(http://genes. mit.edu/GENSCAN.html)进行氨基酸序列预测分析，结果见SEQ ID N0. 3，将得到的氨基酸 序列用BLAST软件进行同源性测定，分析结果可知牛S0X9蛋白的前半部分(21-95AA)与 sox-N超家族有很高的相似性，得分85. 73，后半部分(104-174AA)与HMG-BOX超家族有很 高的相似性，得分98. 40。HMG-BOX超家族的成员包括SRY及其同源蛋白，是蛋白样转录因 子，可与特定的DNA序列结合，发挥作用。这也进一步确定了我们克隆到的基因确实为牛 S0X9基因。
实施例7 本发明所述牛S0X9基因的功能分析通过RNAi技术研究本发明所述S0X9基因功能。构建其干扰载体pS0X9_EGFP，通 过尾静脉注射转染怀孕9. 5dpc的母鼠，以注射生理盐组和对照质粒pControl-EGFP为对照 组。11. 5dpc时取出胚胎，在荧光显微镜下观察到GFP蛋白的表达，对照组无绿色荧光出现， 说明干扰质粒的成功转染。采用半定量PCR检测其中Sox9RNA的表达量，结果发现，注射干扰载体pSoX9_EGFP 组Sox9基因表达水平均受到显著影响；而生理盐水和对照质粒注射组胎儿的Sox9表达量 基本一致，见图9-10，图9为雌性胎鼠，图10为雄性胎鼠，除p6外，其余胎鼠中S0X9基因的 表达量都降低到对照组的15%左右，干扰效果较好。表明对Sox9基因的干扰达到预期的效
果 ο分析子鼠性别比例变化发现，15只注射pS0X9-EGFP的母鼠中胎儿的中雄性比例 为6A1U5只注射pControl-EGFP的母鼠中胎儿的雄性比例为32/61、6只注射生理盐水的 母鼠中胎儿的雄性比例为30/56，可见后两组中雄性比例相近，约等于50%，二者远大于第 一组中雄性比例(28.6%)。同时，注射质粒的母鼠所生后代数远远小于注射生理盐水的母 鼠，pControl-EGFP质粒影响胚胎的生长发育，但并不影响后代的性别比例。以上结果说明，由于pS0X9-EGFP干扰载体干扰了 S0X9基因的表达，使S0X9基因 不能发挥正常功能而引起胚胎的死亡，而且雌性比例远远高于雄性，推测S0X9在雄性中的 功能远比在雌性中重要，故干扰S0X9使其表达降低、导致雄性死亡比例远大于雌性，从而 导致后代雌性比例远高于雄性。
权利要求
一种牛早期胎儿性别发育相关基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述基因，其特征在于其开放读码框如SEQID NO. 2所示。
3.根据权利要求1所述基因的制备方法，包含以下步骤从牛早期胎儿生殖嵴中提取 总RNA，根据保守区序列设计引物用RT-PCR法扩增cDNA，设计5' RACE引物和3' RACE引 物，结合RACE和巢式PCR技术，克隆测序得到牛早期胎儿性别发育相关基因S0X9。
4.权利要求1所述基因的编码蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO. 3所示。
全文摘要
本发明涉及生物领域，公开了一种牛早期胎儿性别发育相关基因SOX9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供所述基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供所述基因的提取方法，即从牛早期胎儿生殖嵴中提取总RNA，用RT-PCR法扩增，结合RACE、巢式PCR技术克隆到牛早期胎儿性别发育相关基因SOX9的全表达序列。本发明所述基因可用于牛后代的性别控制，具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/12GK101914548SQ20101024824
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者徐超, 朱化彬, 杜卫华 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所