专利名称：检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因大豆及其深加工产品，具体而言是一种适用于检测转 cp4_印sps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒，属于食品安全转基因 检测领域。
背景技术：
转基因作物自面世及大规模推广种植以来，就以其自身的优势为人类社会创造了 巨大的经济效益。但转基因作物及其加工产品的生物安全性隐患也是一个不可忽视的事 实。面对这把双刃剑，世界上许多国家纷纷出台了相应的法律法规来对转基因作物及其加 工产品进行标识管理及安全性评价。1983年人类成功培育了世界上第一种转基因植物——含抗生素药类抗体的烟草。 但直到1994年，具有延熟保鲜功能的转基因番茄才成为首例批准进行商业化生产的转基 因植物。此后，转基因作物正式走进了大众的视线，在全球得到了大面积推广。1996年全 球仅有6个国家种植转基因作物，而到2008年数量激增至25个国家；与此同时，1996年全 球转基因作物种植面积仅有170万公顷，而到2008年则累计达到8亿公顷(Clive James, 2008)。到目前为止，已经有超过100种以上的转基因植物被商业化种植，其中最广泛的 是大豆、玉米、棉花和油菜。例如，2008年全球大豆种植面积约为九千五百万公顷，其中转基 因大豆占 70%份额(Clive James, 2008) 美国孟山都公司生产的抗草甘膦除草剂转基因大豆(Roundup Ready Soybean), 简称RR大豆，是世界上最早获准进行商业化种植的转基因大豆品种(1994年5月获准在美 国进行商业化种植)。它的抗草甘膦除草剂特性是通过转入cp4-印sps基因并正确表达而 获得的。大豆类食品制品及相关产品一直以来都是为人民群众所热爱的。可以预见，随着 我国经济的进一步发展，人民群众生活水平的提高，大豆类食品制品及相关产品的需求量 必然上升。而国内的大豆产量与市场需求间一直存在着一定的差距。自1996年开始，中国 成为大豆、豆粕和粮油的全面净进口国，现已是世界上最大的大豆进口国。2008年中国大豆 总产量为1656万吨，而进口量已达到惊人的3743万吨(罗维燕，2009)。有证据表明，2008 年，美国、阿根廷和巴西转基因大豆的种植率分别高达91.9%、90. 4%和70. 3%，而来自美 国、巴西和阿根廷的大豆约占我国总进口大豆份额的90% (梁克红等，2009)。转基因作物自面世以来，就其安全性各界一直存在着较大的争议。我国于2001和 2002年相继颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》， 以此来规范农业转基因生物的监督监管机制。本发明不仅为转基因大豆及其深加工产品中 转基因成份的检测提供了一种可行性高且可靠的方法，也为食品安全领域中的转基因安全 性评价和标识管理提供了有力的支撑，具有很高的实际应用价值。
发明内容
本发明目的提供一种适用于快速检测转cp4_印sps基因大豆及其深加工产品中 转基因成份的方法及试剂盒，以克服蛋白层次检测时间长、成本高和易受产品基质影响等 缺点。另外，本发明以内源基因的检测结果为参照来验证转基因大豆及其深加工产品中外 源转基因成份检测结果的正确性，在一定程度上能有效避免PCR过程中的污染及假阳性问 题，从而能够更有效的对检测结果做出科学和准确的判断。本发明目的的实现一种检测转cp4_印sps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法，包括提 取样品中总DNA、PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳检测，其特征在于大豆内源lectin基因上游引物为SEQ ID N。1，下游引物为SEQ ID N0 2 ；cp4-epsps基因上游引物为SEQ ID N0 :3，下游引物为SEQ ID N0 :4。在本发明中在PCR扩增反应体系中，PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、引物和DNA 之间的体积比为50 1 2 1 ；在扩增反应中，变性94°C 3 IOmin ；扩增94°C 30s, 40 65°C 30s, 72°C 20 60s ；循环30 45 ；后延伸72°C IOmin0在本发明中PCR反应缓冲液由10XPCR buffer、MgCl2、dNTP和dd H2O组成，它们 的体积比为5 3 1 41。在本发明中所述的琼脂糖凝胶电泳检测是指制备琼脂糖凝胶，60 100V恒压电 泳，30 60min。EB染色后于凝胶成像仪上观察和拍照。在本发明中提取样品中总DNA是指通过CTAB法、SDS法、酶裂解法、高盐低pH法 或试剂盒法等方法提取样品中总DNA。一种实现上述PCR扩增反应的试剂盒，其特征在于包括A液、B液、C液和D液。 其中，A液为PCR反应缓冲液，B液为Taq DNA聚合酶，C液为大豆内源基因lectin的上游 引物和下游引物，D液为cp4_印sps基因片段的的上游引物和下游引物。所述的PCR反应 缓冲液内含 10XPCR Buffer、dNTPs、MgCl2 和 ddH20。在所述的试剂盒中大豆内源lectin基因上游引物为SEQ ID N。1，下游引物为 SEQ ID N0 2 ；cp4-epsps 基因上游引物为 SEQ ID N0 :3，下游引物为 SEQ ID N0 :4。在所述的试剂盒中PCR反应缓冲液中10XPCR buffer、MgCl2, dNTPs、dd H2O的 体积比为5 3 1 41。在所述的试剂盒中A液为50ml，B液为1ml，C液为2ml，D液为2ml。在本发明中针对lectin和cp4_印sps基因所设计的引物也可以应用于实时荧光 定量PCR扩增反应。本发明的优势在于本发明提供了一种具有高可行性的能够快速检测转基因大豆及其深加工产品中 转基因成份的方法及试剂盒。lectin基因是大豆的内源基因，针对其进行PCR扩增可表征 出实验样品中是否含有大豆成份，并可对所提样品DNA质量作出初步的判断。由此，本发明 不仅可以根据lectin基因PCR扩增结果的有无来判断样品中是否含大豆成份，而且还可以 判断出不同样品中DNA提取的质量情况。通过联立lectin及cp4-印sps基因PCR扩增结 果，本发明不仅对食品中转基因成份有着高检出率，且通过PCR检测结果的相互印证能有
4效避免PCR过程中的污染及假阳性问题，从而能够更有效的对PCR检测结果做出科学和准 确的判断。本发明不仅为转基因食品安全检测提供了一种高可行性的方法，也为食品安全 领域中的转基因安全性评价和标识管理提供了有力的支撑，具有很高的实际应用价值。
图1 本发明所述PCR体系的有效性及所用引物的特异性检测结果图。图中A =Iectin基因引物PCR结果；B :cp4_印sps基因引物PCR结果。图2 用转基因大豆制备的加工食品中转基因成份检测结果图。图中A =Iectin基因引物PCR结果；B :cp4_印sps基因引物PCR结果。图3 自由市场所购食品样品中转基因成份检测结果图。图中A =Iectin基因引物PCR结果；B :cp4_印sps基因引物PCR结果。图4 食用大豆油与腐乳中转基因成份检测结果图。图中A =Iectin基因引物PCR结果；B :cp4_印sps基因引物PCR结果。图5 行标引物对上述实验所购食品样品中转基因成份检测结果图。图中A 对应图1所用样品的行标cp4_印sps基因引物PCR结果；B 对应图2所用样品的行标cp4_印sps基因引物PCR结果；C 对应图3所用样品的行标cp4_印sps基因引物PCR结果；D 对应图4所用样品的行标cp4_印sps基因引物PCR结果。
具体实施例方式实施例1一、应用试剂盒法(TaKaRa D9093)提取Roundup Ready大豆粉和野生型大豆粉中 总 DNA (1)称取0. 5g左右磨碎的样品放入Tube中，加入1. 75ml Pretreatment Buffer禾口 200 μ 15Μ Guanidinium Hydrochloride Solution，振荡混勻后，再加入 50 μ 1 Proteinase K，颠倒混勻后，58°C保温lh，间隔IOmin颠倒混勻；(2)室温下 8，OOOrpm 离心 5min，取 500 μ 1 上清放入 1. 5ml Microtube 中；(3)室温下 14，OOOrpm 离心 lOmin，取 300 μ 1 上清放入 2ml Microtube 中；(4)加入 100 μ 1 Solution I，振荡混勻后，再加入 200 μ 1 0.2% SDS 以及 Iml Silica GelSolution，轻轻颠倒混勻 5 6min ；(5)室温下12，OOOrpm离心30s，去上清；(6)加入 300 μ 1 IXffash Solution,充分混勻后，室温下 12，OOOrpm 离心 30s,去
上清，重复两次(最后一次离心3min)；(7)向沉淀中加入70°C预热的100 μ 1 TE Buffer,混勻后，室温静置5min ；(8)室温下14，OOOrpm离心3min，取上清，即为样品DNA溶液。二、PCR扩增反应PCR反应体系PCR反应缓冲液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H2O。扩增反应按下表进行
权利要求
一种检测转cp4 epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法，包括样品中总DNA提取、PCR扩增反应，其特征在于大豆内源lectin基因上游引物为SEQ ID NO1，下游引物为SEQ ID NO2；cp4 epsps基因上游引物为SEQ ID NO3，下游引物为SEQ ID NO4。
2.根据权利要求1所述的检测转cp4-印sps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的 方法，其特征在于所述PCR扩增反应的体系为PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、引物、DNA 之间的体积比为50 1 2 1 ；在扩增反应中，变性94°C 3 IOmin ；扩增94°C 30s， 40 65°C 30s, 72°C 20 60s ；循环30 45 ；后延伸72°C IOmin ；所述Taq DNA聚合酶的浓度为3 IOU/μ 1，所述引物的浓度为15 40 μ Μ。
3.根据权利要求2所述的检测转cp4-印sps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的 方法，其特征在于PCR反应缓冲液由10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs和dd H2O组成，它们的 体积比为5 3 1 41 ；所述MgCl2的浓度为15 35mM，所述dNTPs的浓度为5 15mM each。
4.根据权利要求1-3所述的检测转cp4-印sps基因大豆及其深加工产品中转基因成份 的方法，其特征在于PCR扩增反应后通过琼脂糖凝胶电泳检测；所述的琼脂糖凝胶电泳检 测是指制备琼脂糖凝胶，60 100V恒压电泳，30 60min ；EB染色后于凝胶成像仪上观察 和拍照。
5.根据权利要求1所述的检测转cp4-印sps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的 方法，其特征在于所述的PCR扩增反应为Real-time PCR扩增反应。
6.根据权利要求1 5之一所述的检测转cp4-印sps基因大豆及其深加工产品中转基 因成份的方法，其特征在于样品中总DNA是指通过CTAB法，或SDS法，或酶裂解法，或高盐 低PH法，或试剂盒法提取。
7.一种实现权利要求1 3之一所述PCR扩增反应的试剂盒，其特征在于包括A液、 B液、C液和D液；其中，A液为PCR反应缓冲液，B液为Taq DNA聚合酶，C液为大豆内源 lectin基因上游引物和下游引物，D液为cp4_印sps基因上游引物和下游引物；所述的PCR 反应缓冲液内含 10XPCR Buffer、dNTPs、MgCl2 和 ddH20。
8.根据权利要求7所述PCR扩增反应的试剂盒，其特征在于所述的大豆内源lectin 基因上游引物为SEQ ID N。1，下游引物为SEQ ID N。2 ;cp4_印sps基因上游引物为SEQ ID N0 :3，下游引物为SEQ ID N0 :4。
9.根据权利要求7所述PCR扩增反应的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应缓冲液 中 10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs、dd H2O 的体积比为 5 3 1 41。
10.根据权利要求7 9之一所述PCR扩增反应的试剂盒，其特征在于A液为50ml，B 液为lml, C液为2ml, D液为2ml。
全文摘要
本发明是一种适用于检测加工食品中转cp4-epsps基因成份的方法及试剂盒。具体方法样品DNA提取；PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测，其中PCR扩增的两对引物为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。所述试剂盒包括A液PCR反应缓冲液；B液Taq DNA聚合酶；C液大豆内源lectin基因的上游引物和下游引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；D液为cp4-epsps基因的上游引物和下游引物SEQ ID NO3，下游引物为SEQ ID NO4。本发明对加工食品中转基因成份检出率高，能有效避免污染与假阳性等问题，实际应用价值高。
文档编号C12Q1/68GK101935701SQ201010249480
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者何健, 吴洪洪, 周光宏, 周兴虎, 徐晟 , 沈文飚, 肖笑, 谢彦杰, 黄明 申请人:南京农业大学