专利名称：牛子宫内膜炎病原快速诊断方法
技术领域：
本发明属于牛子宫内膜炎病原诊断方法。
背景技术：
子宫内膜炎是牛产后多发的繁殖障碍性疾病，世界各地该病的发病率都很高，如 在韩国奶牛子宫内膜炎的发病率为47.6%，美国为53%，中国为20-50%。此疾病影响奶 牛的产奶量、繁殖率，甚至因长期不孕而被淘汰，造成巨大的经济损失。目前对于本病的发 生机理还不十分明了，由于环境、生产条件的因素的影响，本病的致病菌诊断结果各国均不 同，为本病的治疗带来了困难。因此，快速、有效地病原诊断方法成为了对此疾病的研究关 键。牛子宫内膜炎是多种病原导致的。从感染子宫中分离出的病原微生物，大部分存 在环境中，并具有感染其他组织和器官的能力。因此子宫内膜炎是非特异性病原菌感染。目 前对于本病的病原诊断，主要为传统细菌分离鉴定方法。首先分离培养微生物，然后进行鉴 定，再进行药敏试验等研究。但微生物的分离存在偶然性，与培养基密切相关，会导致很多 遗漏，况且分离到的也未必是主要致病菌。而且从感染的子宫中分离到的许多细菌也是随 意组合的，再次感染时，子宫中的菌群组合会稍有改变，无法保证子宫内菌群组合的真实比 例关系。另外存在感染或者其他需氧菌时，子宫内氧还原酶的电位降低，创造一个缺氧的环 境，有大量的厌氧菌繁殖。传统的致病菌分离培养技术对于大部分厌氧细菌是无法分离培 养的。因此，传统诊断方法不能揭示患病奶牛子宫内微生物的状态，无法对致病菌做出有效 的诊断，导致疾病缺乏有效的防治措施。
发明内容
本发明提供一种牛子宫内膜炎病原快速诊断方法，以解决传统诊断方法不能揭示 患病奶牛子宫内微生物的状态，无法对致病菌做出有效的诊断的问题。本发明采取的技术 方案是，包括下列步骤(一 )病料的采集利用子宫内膜活检采样器进行子宫样品的采集，采集后将棉拭子放入含2ml灭菌 生理盐水2ml的冻存管内以制成菌体稀释液，密封，充分摇勻，一部分放于加入冰袋的保温 箱内用于分离培养，另一部分液冻存；( 二)病料处理细菌裂解病料用TE缓冲液悬浮后，加入抽提缓冲液，37°C哺育lh，再加入溶菌酶 10mg/mL，37°C温育 2h ；细菌核酸抽提采用常规酚/氯仿抽提，提取后对其进行琼脂糖凝胶电泳验证；(三)套式PCR设计并合成两对套式PCR 引物 Pmuu492-1、Pmuu492_2 和 pm442_l、pm442_2。在 Pmuu492-1 与 pm442_l 的 5，端加上 GC clmap 结构。
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套式PCR 16s rDNA 引物
引物序列(5二+3’)Pmuu492-1ACTCCTACGGGAGGCAGCAGPmuu492-2AACGCGAAGAACCTTACpm442-lCCTACGGGAGGCAGCAGpm442-2CCGTCAATTCATTTGAGTTTGC cImapCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG取子宫黏液菌体稀释的液1ml，利用菌体DNA提取试剂盒提取子宫粘液中的菌体 总DNA ；再以菌体总DNA为模板，利用Ex Taq酶和引物Pmuu492_l、Pmuu492_2，进行第一次 PCR扩增；PCR条件为94°C预变性8min ；94°C变性25s、58°C退火45s、72°C延伸45s，30个 循环后；72°C恒温7min。再以扩增产物为模板，利用Ex Taq酶和引物pm442-l、pm442-2进 行第二次PCR扩增，PCR条件为94°C预变性IOmin ；94°C变性45s、54°C退火60s、72°C延伸 60s, 35个循环；72°C恒温IOmin ；对于得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增产 物；(四)变性梯度凝胶电泳分析^tM Bio-Radoeode Universal Mutation Detection SystemPCR EMf 物进行分离(1)变性梯度胶的制备使用梯度混合装置，制备8%的聚丙烯酞胺凝胶，变性剂浓度从30%到60% (100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物)，其中变性剂的浓度从 胶的上方向下方依次递增；(2)套式PCR样品的加样待变性梯度胶完全凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取第二次PCR 产物50微升加入上样孔。(3)电泳及染色在160v的电压下，60°C电泳3h ；电泳结束后，使用EB对凝胶进行染色0. 5h ；(4)胶图扫描将染色后的凝胶用Bio-Radoeode凝胶成像系统获取胶图；(5)图像分析对各条带进行标号，记录；对各条带内DNA比例关系并得到直观的曲线图并比较 各条带之间的DNA含量；根据以上分析得到优势致病菌并确定回收目的带；(6)目条带回收对分析后选定的条带，使用page胶回收试剂盒进行回收纯化。(7)连接反应1.取一支0. 5ml微离心管，置于冰浴中，分别加入
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IOX 连接 BufferIul ；回收的 PcR 产物(1000ng/ul)5ul ；T 载体(50ng/ul)Iul ；T4DNA 连接酶Iul ；DDff70ul 总体积15. Oul2.混勻。放在调好16°C的DNA连接仪内，然后置4°C冰箱冷藏放置10h。(8)转化(a)转化反应1.在灭菌的1. Sml离心管中加入50ul DH5 α感受态菌及5ul的连接产物，混勻后 冰浴30min。2.将离心管移入52°C水浴中，2min后(切忌振荡)。立即将离心管置于冰浴中 5min。3.向离心管中加入200ul LB液体培养基，在37°C恒温振荡器上以llOr/min培 养40min。以利于转化后的受体菌，在良好的环境(通气、新鲜的LB液体培养基)中繁殖生长。(b)涂板(蓝白筛选)1、取反应物在平板上涂布。2、涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37°C温箱中培养12h。挑取单个阳 性菌落，液体培养基扩人培养IOh(9)质粒提取1.取Iml过夜培养的菌液加入1. 5ml离心管中。于12000r/minX g离心30秒，去
除上清。2.加 250ul Resuspension Buffer，重悬细菌沉淀。再加入 250ul 细胞 Lysis Buffer，轻柔颠倒4-6次。3.加 350ul Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管 4-6 次。于 12000g 离 心10分钟。4.将步骤3离心后得到上清转移到Spin column内，于6000r/minXg离心1分
钟，并弃去接液管中的液体。5.向 Spin cnlumn 内加入 650ul Wash Buffer，于 12000g 离心 30-60 秒，并弃去
接液管中的液体。再重复一次此操作。6.再次于12000r/minXg离心lmin，然后将Spin column转移到无菌的1. 5ml离 心管中，向 Spin column 内加入 50ul Elution Buffer，室温静置 lmin。(10)测序将质粒送去生物公司测序，然后与基因bank中收录的相比对，确定治 病菌种属，完成诊断。传统的致病菌诊断方法为培养基分离培养，但研究发现大部分致病菌不能用现有 的培养方法进行分离培养。而且现有的培养方法对于观察菌群的多态性及动态变化是基本 上做不大的。而直接从子宫内膜炎患牛子宫黏液样品中抽提总DNA，然后对16S rDNA的可 变区进行套式PCR扩增，通过DGGE进行分析，能检测到难以或不能培养的治病菌，更能精确
6反映子宫内膜炎发生时母牛子宫内致病菌的动态变化。可以找出其中的优势致病菌，从而 确定主要致病菌。套式PCR的使用增加了目的基因选择的准确性、限制性。为电泳分析结 果的产生提供支持。相对于传统的分离鉴定方法只能鉴定出部分致病菌，本发明方法诊断更加全面， 而且可确定主要致病菌。此方法可在短时间内诊断出主要致病菌的种类，为疾病的进一步 治疗提供指导。此方法操作过程中还克服了传统治病菌诊断方法过程中人员操作带来的偶然因 素的干扰。传统病原诊断方法容易出现假阳性或假阴性结果，主观性较强，且会漏掉一些不 能培养的致病菌。此方法能客观完整地鉴定致病菌，它根据16SrDNA的套式PCR扩增产物在 凝胶中的相对位置来进行判断，结果直观。将凝胶上的条带切割下来测序，然后与GenBank 中的标准序列进行比较，可以得出它们的遗传相关性。在整个诊断过程中，分子生物学仪器的操作简单易行，利于推广。l_5ng的DNA上 样量即可达到清晰的电泳分离效果。温度、时间等电泳条件易于控制，可保证电泳的重现性 和结果的可重复性。准确可靠通过套式per技术与变性梯度凝胶电泳技术相结合对细菌、真菌、寄生虫的保守 基因序列进行分析克服了传统分离鉴定方法的不足，可根据致病菌基因组成进行分类，根 据其表达量确定优势菌群，并为选用特异性方法分离病原提供参考。保证了病原菌诊断的 真实性，能全面的认识子宫内微生物的组成。此方法可以深入了解患病牛子宫内致病微生 物的组成及其量化关系，可分析确定微生物在子宫内膜炎发病过程中的作用，确定主要致 病菌，有效地对牛子宫内膜炎的病原菌诊断。
图1是DNA提取后电泳图；图2是套式PCR第一次扩增结果图；图3是套PCR第二次扩增结果图；图4是确定回收目的条带图。
具体实施例方式实验动物于长春市某养牛小区，选取产后7 10d，患子宫内膜炎奶牛20头为实验组，临床 表现为采食减少，体温升高，精神沉郁，由阴门流出灰褐(白)色有腐臭味的粘液，子宫颈口 周围有脓性分泌物附着，直肠检查子宫角，松软、增粗，子宫壁增厚，弹性减弱；产后7 IOd 临床表现正常20头为对照组。表现为体温正常，食欲旺盛，恶漏量少、色淡、略混浊，直肠检 查子宫角直径明显缩小，子宫壁弹性良好，采样后监测奶牛状态至再次受孕，未见异常。试剂和仪器Bio-Radoeode Universal Mutation Detection SystemΛ^ΜχΜ^Μ^ Bio-Radoeode ) ；CT15RT台式高速离心机；ΕΠ1205Β紫外透射仪(上海精密科学贸易有限 公司)JY300C型水平电泳槽、微型台式高速离心机、恒温金属浴仪。试剂菌体DNA提取试剂盒、DNA Maker 2000、质粒小提试剂盒均购自天根生化有
7限公司；PAGE胶回收试剂盒购自北京百泰克生物有限公司；Ex Taq酶、DNA连接酶、DH 5α 感受态细胞、PMD-18T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。本发明包括下列步骤(一 )病料的采集利用子宫内膜活检采样器进行子宫样品的采集，采集子宫黏液时，子宫内膜活检 采样器火焰灭菌后，将灭菌的棉拭子放入采样器顶端内管凹口内，关闭采样器，利用开膣器 打开阴道，使采样器直抵子宫颈口，以直肠把握法送入子宫内，打开采样器，通过直肠用手 按压子宫壁，使之与棉拭子充分接触10 20s，闭合并取出采样器，将棉拭子放入含2ml灭 菌生理盐水2ml的冻存管内以制成菌体稀释液，密封，充分摇勻，一部分放于加入冰袋的保 温箱内用于分离培养，另一部分液冻存；(二)病料处理细菌裂解病料用TE 缓冲液(IOmMTris · HCl，pH7. 0 ；0. ImM EDAT，ρΗ7· 0)悬浮 后，加入抽提缓冲液(IOmMTris ·<Χ，ρΗ7. 0 ；0. ImMEDAT, ΡΗ7. 0,0. 5% SDS)，37°C哺育 lh，再 加入溶菌酶10mg/mL，37°C温育2h。细菌核酸抽提按照《分子克隆实验指南》第四章用于病料中致病菌核酸提取方法 的筛选的方法采用常规酚/氯仿抽提。提取后对其进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图1。(三)套式PCR参考常见16s rDNA通用引物并对其进行改良，设计并合成两对套式PCR引物 Pmuu492-1、Pmuu492_2 和 pm442_l、pm442_2。在 Pmuu492_l 与 pm442_l 的 5 ‘端加上 GC cImap结构。套式PCR 16s rDNA 引物
引物序列(5^3’)Prauu492-1ACTCCTACGGGAGGCAGCAGPmuu492-2AACGCGAAGAACCTTACpm442-lCCTACGGGAGGCAGCAGpm442-2CCGTCAATTCATTTGAGTTTGC clraapCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG取子宫黏液菌体稀释的液lml，利用菌体DNA提取试剂盒提取子宫粘液中的菌体 总DNA ；再以菌体总DNA为模板，利用Ex Taq酶和引物Pmuu492_l、Pmuu492_2，进行第一次 PCR扩增；PCR条件为94°C预变性8min ；94°C变性25s、58°C退火45s、72°C延伸45s，30个 循环后；72°C恒温7min。再以扩增产物为模板，利用Ex Taq酶和引物pm442-l、pm442-2进 行第二次PCR扩增，PCR条件为94°C预变性IOmin ；94°C变性45s、54°C退火60s、72°C延伸 60s，35个循环；72°C恒温lOmin。对于得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增产 物，结果见图2、图3。(四)变性梯度凝胶电泳分析
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^tM Bio-Radoeode Universal Mutation Detection SystemPCR Jx^lr= 物进行分离。(1)变性梯度胶的制备使用梯度混合装置，制备8%的聚丙烯酞胺凝胶，变性剂浓度从30%到60% (100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物)，其中变性剂的浓度从 胶的上方向下方依次递增。(2)套式PCR样品的加样待变性梯度胶完全凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取第二次PCR 产物50微升加入上样孔。(3)电泳及染色在160v的电压下，60°C电泳3h。电泳结束后，使用EB对凝胶进行染色0. 5h。(4)胶图扫描将染色后的凝胶用Bio-Radoeode凝胶成像系统获取胶图。(5)图像分析首先，对各条带进行标号，记录。然后，对各条带内DNA比例关系并得到直观的曲 线图并比较各条带之间的DNA含量。第三，根据以上分析得到优势致病菌并确定回收目的 带，结果见图4。(6)目条带回收对分析后选定的条带，使用page胶回收试剂盒进行回收纯化。(7)连接反应a.取一支0. 5ml微离心管，置于冰浴中，分别加入10X 连接 BufferIul ；回收的 PcR 产物(1000ng/ul)5ul ；T 载体(50ng/ul)Iul ；T4DNA 连接酶Iul ；DDff7Oul 总体积15. Oulb.混勻。放在调好16°C的DNA连接仪内，然后置4°C冰箱冷藏放置10h。(8)转化(a)转化反应在灭菌的1. 5ml离心管中加入50ul DH5 α感受态菌及5ul的连接产物，混勻后冰 浴 30min。将离心管移52°C水浴中，2min后，切忌振荡，立即将离心管置于冰浴中5min。向离心管中加入200ul LB液体培养基，在37°C恒温振荡器上以llOr/min培养 40min。以利于转化后的受体菌，在良好的环境通气、新鲜的LB液体培养基中繁殖生长。(b)涂板(蓝白筛选)取反应物在平板上涂布；涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37°C温箱中培养12h。挑取单个阳性 菌落，液体培养基扩人培养IOh ；
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(9)质粒提取a.取Iml过夜培养的菌液加入1.5ml离心管中。于12000r/minX g离心30秒，去
除上清。b.加 250ul Resuspension Buffer，重悬细菌沉淀。再加入 250ul 细胞 Lysis Buffer，轻柔颠倒4-6次。不要剧烈震动，防止基因组DNA被剪切，注意不要让反应持续超 过5分钟；c.加 350ul Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管 4-6 次。于 12000g 离 心10分钟。d.将步骤3离心后得到上清转移到Spin column内，于6000r/minXg离心1分
钟，并弃去接液管中的液体。e.向 Spin cnlumn 内加入 650ul Wash Buffer，于 12000g 离心 30-60 秒，并弃去
接液管中的液体。再重复一次此操作。f.再次于12000r/minXg离心lmin，然后将Spin column转移到无菌的1. 5ml离 心管中，向 Spin column 内加入 50ul Elution Buffer，室温静置 lmin。(10)测序将质粒送去生物公司测序，然后与基因bank中收录的相比对，确定治 病菌种属，完成诊断。
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权利要求
一种牛子宫内膜炎病原快速诊断方法，其特征在于包括下列步骤(一)病料的采集利用子宫内膜活检采样器进行子宫样品的采集，采集后将棉拭子放入含2ml灭菌生理盐水2ml的冻存管内以制成菌体稀释液，密封，充分摇匀，一部分放于加入冰袋的保温箱内用于分离培养，另一部分液冻存；(二)病料处理细菌裂解病料用TE缓冲液悬浮后，加入抽提缓冲液，37℃哺育1h，再加入溶菌酶10mg/mL，37℃温育2h；细菌核酸抽提采用常规酚/氯仿抽提，提取后对其进行琼脂糖凝胶电泳验证；(三)套式PCR设计并合成两对套式PCR引物Pmuu492 1、Pmuu492 2和pm442 1、pm442 2。在Pmuu492 1与pm442 1的5′端加上GC clmap结构；套式PCR 16s rDNA引物，序列(5′→3′)Pmuu492 1 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGPmuu492 2 AACGCGAAGAACCTTACpm442 1 CCTACGGGAGGCAGCAGpm442 2 CCGTCAATTCATTTGAGTTTGCclmap CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG取子宫黏液菌体稀释的液1ml，利用菌体DNA提取试剂盒提取子宫粘液中的菌体总DNA；再以菌体总DNA为模板，利用Ex Taq酶和引物Pmuu492 1、Pmuu492 2，进行第一次PCR扩增；PCR条件为94℃预变性8min；94℃变性25s、58℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后；72℃恒温7min；再以扩增产物为模板，利用Ex Taq酶和引物pm442 1、pm442 2进行第二次PCR扩增，PCR条件为94℃预变性10min；94℃变性45s、54℃退火60s、72℃延伸60s，35个循环；72℃恒温10min；对于得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增产物；(四)变性梯度凝胶电泳分析采用Bio RadoeodeTM Universal Mutation Detection System对套式PCR反应产物进行分离(1)变性梯度胶的制备使用梯度混合装置，制备8％的聚丙烯酞胺凝胶，变性剂浓度从30％到60％(100％的变性剂为7mol/L的尿素和40％的去离子甲酰胺的混合物)，其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增；(2)套式PCR样品的加样待变性梯度胶完全凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取第二次PCR产物50微升加入上样孔。(3)电泳及染色在160v的电压下，60℃电泳3h；电泳结束后，使用EB对凝胶进行染色0.5h；(4)胶图扫描将染色后的凝胶用Bio Radoeode凝胶成像系统获取胶图；(5)图像分析对各条带进行标号，记录；对各条带内DNA比例关系并得到直观的曲线图并比较各条带之间的DNA含量；根据以上分析得到优势致病菌并确定回收目的带；(6)目条带回收对分析后选定的条带，使用page胶回收试剂盒进行回收纯化。(7)连接反应(a).取一支0.5ml微离心管，置于冰浴中，分别加入10×连接Buffer 1ul；回收的PcR产物(1000ng/ul) 5ul；T载体(50ng/ul) 1ul；T4DNA连接酶 1ul；DDW 70ul总体积 15.0ul(b).混匀，放在调好16℃的DNA连接仪内，然后置4℃冰箱冷藏放置10h；(8)转化(a)转化反应在灭菌的1.5ml离心管中加入50ul DH5α感受态菌及5ul的连接产物，混匀后冰浴30min；将离心管移入52℃水浴中，2min后(切忌振荡)。立即将离心管置于冰浴中5min；向离心管中加入200ul LB液体培养基，在37℃恒温振荡器上以110r/min培养40min。以利于转化后的受体菌，在良好的环境通气、新鲜的LB液体培养基中繁殖生长；(b)涂板取反应物在平板上涂布；涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37℃温箱中培养12h。挑取单个阳性菌落，液体培养基扩人培养10h；(9)质粒提取(a).取1ml过夜培养的菌液加入1.5ml离心管中。于12000r/min×g离心30秒，去除上清；(b).加250ul Resuspension Buffer，重悬细菌沉淀。再加入250ul细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4 6次；(c).加350ul Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4 6次。于12000g离心10分钟；(d).将步骤3离心后得到上清转移到Spin column内，于6000r/min×g离心1分钟，并弃去接液管中的液体；(e).向Spin cnlumn内加入650ul Wash Buffer，于12000g离心30 60秒，并弃去接液管中的液体。再重复一次此操作；(f).再次于12000r/min×g离心1min，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中，向Spin column内加入50ul Elution Buffer，室温静置1min；(10)测序将质粒送去生物公司测序，然后与基因bank中收录的相比对，确定治病菌种属，完成诊断。
全文摘要
本发明涉及一种牛子宫内膜炎病原快速诊断方法，属于牛子宫内膜炎病原诊断方法。从子宫内膜炎患牛子宫黏液样品中抽提总DNA，然后对16S rDNA的可变区进行套式PCR扩增，通过DGGE进行分析，能检测到难以或不能培养的治病菌，更能精确反映子宫内膜炎发生时母牛子宫内致病菌的动态变化。可以找出其中的优势致病菌，从而确定主要致病菌。此方法可以深入了解患病牛子宫内致病微生物的组成及其量化关系，可分析确定微生物在子宫内膜炎发病过程中的作用，确定主要致病菌，有效地对牛子宫内膜炎的病原菌诊断。
文档编号C12Q1/04GK101906478SQ20101025009
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月11日 优先权日2010年8月11日
发明者张乃生, 杨正涛, 王国卿, 王海霞, 郭梦尧 申请人:吉林大学