专利名称：一株植物乳杆菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于食品微生物发酵技术领域，尤其涉及一株植物乳杆菌菌株及其用途。
背景技术：
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，以下简称CLA)是含有顺式或反式共 轭双键的十八碳二烯酸，是亚油酸(Linoleic acid，以下简称LA)的一组位置和构象异构 体的总称。其中CLA的两种异构体顺9，反Il-CLA(c9，tll-CLA)和反10，顺12_CLA(tlO， C12-CLA)具有重要的生理功能，比如抗癌(结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌)、提高细胞免 疫、降低体脂含量、预防糖尿病的发生以及抑制动脉粥样硬化等。自然界中CLA主要来源于瘤胃动物肉及奶制品，且CLA的含量随着动物品种、饲 养方式及饲养条件的改变而不同；人乳中CLA含量为0. 29% 0. 71%，马乳中为0. 05% 0. 12%，猪乳中为0. 19% 0. 27%，而海产品和菜籽油中含量较低，分别为0. 03 % 0. 06%和0. 01% 0. 07%。奶及肉制品所含的CLA中，c9，tll-CLA异构体约占75 % 90% ；而菜籽油中约有 50%是 c9, tll-CLA,40%^ tlO, cl2_CLA。目前商业化生产CLA主要是以富含LA的种子油(如向日葵油(64% LA)、玉米油 (57% LA)、棉籽油(53% LA)、豆油(51% LA)等)进行碱催化异构制得。其机理是在强碱 条件下，LA第11位碳被夺去一个质子，形成碳负离子，然后由于热力学因素引起碳负离子 迁移，从而形成不同的共轭化产物。采用化学方法原理比较简单，但在反应过程中会产生一 系列CLA异构体混合物、饱和或不饱和脂肪酸及有毒物质，活性CLA提纯工艺繁琐，应用成 本较高。已发现一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌能合成CLA。微生物合成CLA培养灵活、不需 要高温高压；生成的异构体以c9，tll-CLA为主，分离纯化步骤相对简单。但是，瘤胃菌是严 格厌氧菌，培养困难，难以实现大规模生产。而乳酸菌大多是人体益生菌，用其生产CLA可 以直接应用于食品，或精制成药品，因此应用乳酸菌生产CLA将有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种植物乳杆菌菌株，该菌株能高效地将LA转化为CLA。一株高产CLA的植物乳杆菌菌株，命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) 1ρ15-2-1，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2010年4月27日，保藏号为CGMCC NO. 3782。上述菌株主要生理学特征为在MRS培养基上生长良好，形成白色、半透明、圆形 菌落，菌落表面湿润，细菌形态呈短杆状，两端椭圆，革兰氏染色反应呈阳性，无运动性，不 产芽孢。本发明还提供了上述菌株在将LA转化为CLA中的应用。即将上述菌株接种于含底物LA的MRS培养液中进行直接震荡(生长细胞)培养 或者静息细胞培养，底物LA的浓度可以分别控制在0. 2mg/ml和25mg/ml，当然该浓度可以调整，只要不严重抑制细胞生长即可，优选在0. 2 25mg/ml。 本发明植物乳杆菌可将LA转化为CLA，直接震荡培养的转化率高达21. 32 %，静息 细胞最高CLA产量1023. 55 μ g/ml，可用于酸奶、泡菜、果汁饮料等的工业化生产。
图1是本发明菌株的16S rRNA序列的系统发育树。图2为本发明菌株和植物乳杆菌ACCC10171的16s rRNA序列PCR扩增凝胶电泳图谱。
具体实施例方式菌株的分离纯化从杭州市区不同超市购买得到的泡菜中进行菌种的分离与筛选，具体操作为将泡 菜采用无菌水洗涤后，洗涤液用重量百分比浓度为0. 8%的无菌生理盐水梯度稀释(10_5)， 然后涂布在MRS平板上，将所有平板分成8组，置于不同温度(30°C或37°C )、不同含氧量 (厌氧或微氧)培养不同时间(24或48小时)后，挑取单菌落接入MRS液体培养基中，在与 分离条件相同的条件下培养后保存在MRS斜面培养基中。将上述分离得到的菌株活化后接种于含有0. 2mg/ml LA的MRS液体培养基中， ISOrpm培养24h后利用两倍体积正己烷提取CLA，然后利用紫外分光光度法测定培养基中 CLA的合成量，根据CLA合成量，比较各菌株转化LA为CLA的能力，选取CLA合成量大于 20 μ g/ml的10株菌株。将上述10株菌株活化后置于无菌水中制成悬液，用浓度为的硫酸二乙酯诱变 30min,稀释后涂布在MRS平板上，挑选无严重变异的菌株，挑取的菌株部分冷冻，部分接种 到MRS液体培养基中30°C条件下活化2次，然后接种到含0. 2mg/ml LA的MRS培养基中，用 两倍体积正己烷提取CLA后紫外分光光度法检测CLA含量，筛选正向变异的菌株。将上述正向变异的菌株活化后置于无菌水中制成悬液，用30W紫外灯距离30cm进 行照射20s，稀释后涂布在MRS平板上，挑选无严重变异的菌株，挑取的菌株部分冷冻，部分 接种到MRS液体培养基中30°C条件下活化2次，然后接种到含0. 2mg/ml LA的MRS培养基 中，用两倍体积正己烷提取CLA后，采用紫外分光光度法检测CLA含量，筛选正向变异菌株， 挑选一株转化LA能力最强的菌株。筛选所用各种培养基分离培养基(g/L)=MRS ；液体种子培养基(g/L) =MRS ；发酵培养基(g/L):MRS+LAMRS培养基成分蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，无水乙酸 钠 5. Og/L，柠檬酸三胺 2. 0g/L, Tween 801. 0ml/L，磷酸氢二钾 2. 0g/L，硫酸镁 0. 02g/L，硫 酸锰 0. 05g/L。菌株的鉴定上述分离的菌株在MRS培养基上生长良好，形成白色、半透明、圆形菌落，菌落表
4面湿润，细菌形态呈短杆状，两端椭圆，革兰氏染色反应呈阳性，无运动性，不产芽孢。用API 50CHL试剂盒(法国梅里埃公司)进行菌株利用49种碳水化合物的发酵
实验，结果如下表所示
0029]注+代表阳性，_代表阴性，d表示不确定。将上述实验结果用APILAB Plus自动判读系统对其进行鉴定，鉴定结果表明该菌 株为乳酸菌属的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，鉴定值99. 9%。同时查阅伯杰 氏系统细菌学鉴定手册发现植物乳杆菌的菌落形态与上述分离所得菌株的菌落形态一致。对上述菌株和植物乳杆菌ACCC10171的16s rRNA序列进行扩增，PCR扩增产物大 小约为1500bp (如图2所示)，测序结果表明，菌株的16SrRNA全长为1471bp，Genbank登 录号为FJ763580 ；植物乳杆菌ACCC10171 16S rRNA全长为1468bp。经比对，菌株与植物 乳杆菌ACCC10171 16S rRNA序列同源性达99. 2%，而Blast后绘制系统发育树，结果表明 菌株属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(如图1所示)，与API细菌鉴定系统
5所得结果一致。因此可以认定该菌为植物乳杆菌，并命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 1ρ15_2_1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保 藏日期为2010年4月27日，保藏号为CGMCC NO. 3782。转化LA利用本发明植物乳杆菌CGMCC No. 3782生产CLA的培养方法如下首先将其接种于MRS培养液进行活化(1 %接种量接入IOml MRS, 30°C培养24h ； 连续两次)，再将菌种转接至MRS培养液中、加入底物LA进行发酵培养，可以分如下两种方 式直接震荡(生长细胞)培养方法发酵温度为30°C，转速为180r/min，底物LA浓 度为0. 2mg/ml，培养48h后停止发酵，获得CLA产量为44. 72μ g/ml，转化率为21. 32%。静息细胞培养方法在发酵液中添加0.5% LA诱导后，培养24h。24h后， 10000rpm，4°C，冷冻离心5 20min，收集菌体，并用生理盐水洗涤三次。称量获得的湿细 胞，以pH5. 5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，加入乳化后的LA25. Omg/ml，震荡培养120h， 获得 CLA 产量为 1023. 55 μ g/ml。
权利要求
一种植物乳杆菌菌株，其特征在于命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)lp15 2 1，保藏号为CGMCC NO.3782。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株在将亚油酸转化为共轭亚油酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤将植物乳杆菌菌株CGMCC NO. 3782接种于含亚油酸的培养基中，直接震荡培养或静息 细胞培养48 120h。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的培养基为MRS培养基。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的亚油酸浓度为0.2mg/ml 25mg/ml ο
全文摘要
本发明公开了一株高产共轭亚油酸的植物乳杆菌菌株，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2010年4月27日，保藏号为CGMCC NO.3782。本发明菌株可将亚油酸高效转化为共轭亚油酸，静息细胞最高共轭亚油酸产量1023.55μg/ml，直接震荡培养的转化率高达21.32％，可用于酸奶、泡菜、果汁饮料等的工业化生产。
文档编号C12P7/64GK101914477SQ201010251108
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者何国庆, 傅明亮, 张强, 阮晖, 陈启和 申请人:浙江大学